朱旭瑤，楊明柳，潘紅平，閻 冰，廖 馨**

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西科學(xué)院廣西紅樹林研究中心，廣西紅樹林保護與利用重點實驗室，廣西北海 536000)

0 引言

紅樹林研究具有重要的理論意義和現(xiàn)實經(jīng)濟意義，近年來圍填海是廣西乃至我國紅樹林面積減少的最直接原因，由于大量的圍墾造田、圍海養(yǎng)殖和道路碼頭的修建，大量紅樹林受到破壞[1-2]，嚴重威脅到海岸生物的多樣性。對紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性進行持續(xù)性監(jiān)測，是針對性制定和實施生態(tài)系統(tǒng)保護策略和合理有效利用資源的基本前提。紅樹林的種類組成和群落結(jié)構(gòu)比陸地森林簡單得多，但它有豐富的形態(tài)結(jié)構(gòu)和地面微景觀地貌，這些細化的生境對生物多樣性的豐富至關(guān)重要[3]。目前，對紅樹林生物多樣性的調(diào)查和研究主要采用傳統(tǒng)的生態(tài)學(xué)調(diào)查方法，傳統(tǒng)的調(diào)查方法費時費力且存在著諸多缺點，在分子生物學(xué)高速發(fā)展的今天，急需對傳統(tǒng)的生物多樣性調(diào)查方法作出改變。

環(huán)境DNA(Environmental DNA,eDNA)的概念于20世紀80年代末首次被提出，是指不對目標(biāo)生物進行分離，而直接從環(huán)境樣品(比如土壤、沉積物、空氣、水體等)中提取的DNA[4]。環(huán)境DNA提取技術(shù)最早出現(xiàn)在環(huán)境微生物學(xué)領(lǐng)域，被用來分離和純化沉積物中微生物的DNA。近年來，環(huán)境DNA技術(shù)被應(yīng)用在生物多樣性分析、生物量估測、珍稀物種發(fā)現(xiàn)、生物入侵物種的監(jiān)控、隱存種的發(fā)現(xiàn)、群落系統(tǒng)發(fā)育重建、物種間食物鏈關(guān)系分析等生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域[5-8]。2008年至今，伴隨著分子條形碼數(shù)據(jù)庫(DNA barcoding)的不斷完善以及測序技術(shù)的飛速發(fā)展，環(huán)境DNA技術(shù)在水生生態(tài)系統(tǒng)的應(yīng)用經(jīng)歷了由定性到相對定量，由檢測單一物種到同時檢測多物種，再到調(diào)查物種多樣性的發(fā)展[9]，水體應(yīng)用范圍已由一開始的淡水水域(湖泊、池塘、河流等)擴展至海洋，調(diào)查物種也由小型底棲動物擴展至魚類、兩棲類、哺乳動物等[10-13]。相比較而言，傳統(tǒng)方法除采樣過程艱辛外，其結(jié)果更大程度上取決于調(diào)查人員的專業(yè)素養(yǎng)和采樣經(jīng)驗，對一些珍稀物種、隱存物種、動物幼體而言，隨機性更大；而環(huán)境DNA技術(shù)經(jīng)濟效力高，省時省力，靈敏度高，對生態(tài)系統(tǒng)干擾低，采樣受限小，同時環(huán)境DNA技術(shù)可以用非常標(biāo)準化的方式在特定類型的棲息地中獲取環(huán)境樣本[14-15]。紅樹林地處大陸和海洋交界處，由于其生境的復(fù)雜性，使得紅樹林具有較高的生態(tài)價值和經(jīng)濟價值[16-17]。紅樹林具有特殊的生態(tài)系統(tǒng)，潮溝區(qū)復(fù)雜且生物多樣性豐富，隨著潮起潮落，紅樹林規(guī)律性地受到海水浸泡和露空，其生境具有較強的還原性、強酸性以及高鹽含量等特性[18]，因而紅樹林土壤的理化性質(zhì)十分復(fù)雜，不能夠穩(wěn)定地提取土壤DNA，再加上紅樹林中物種的分子條形碼信息相對缺乏，因此目前尚未有人通過環(huán)境DNA的方法開展紅樹林領(lǐng)域的生物多樣性研究。利用環(huán)境DNA技術(shù)對紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣進行調(diào)查研究，如何提取到高質(zhì)量的環(huán)境DNA是這項研究最基礎(chǔ)也是決定性的一步。

目前，針對紅樹林土壤DNA的研究主要集中于土壤微生物多樣性，也有學(xué)者對提取土壤微生物DNA進行一些方法學(xué)研究，如液氮-SDS-溶菌酶法[19]、玻璃珠-SDS-溶菌酶法、SDS-GITC-PEG法[20]、Bio 101 kit法、Nycodenz法[21]、SDS-GITC-FastPrep-PEG法、細胞包埋法[22]以及基于Zhou等[23]方法的改良法[24]，以提取土壤DNA。但尚未有人對紅樹林土壤環(huán)境DNA的提取做過全面的方法學(xué)研究。本研究通過預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)前人推薦的方法更偏向于提取優(yōu)質(zhì)的微生物DNA，并不能有效地覆蓋土壤環(huán)境DNA中所包含動植物DNA信息。本研究將比較多種方法提取和純化紅樹林土壤環(huán)境DNA的效率，并討論環(huán)境DNA中所包含的物種覆蓋度(細菌、真菌、無脊椎動物、植物)，為今后開展全方面的紅樹林生物多樣性的研究提供方法學(xué)依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣地為廣西北海山口紅樹林國家級自然保護區(qū)英羅港(21°49′N，109°76′E)和北海垌尾草頭村天然紅樹林(21°33′N，109°9′E)，采樣點見圖1，采集時間為2019年第二季度，在低潮區(qū)潮間帶林間間隔10 m的樹下，去表層浮土，收集10個點的土壤放入無菌袋中，將無菌袋放入有冰袋的隔溫箱中，帶回實驗室放入-20℃的冰箱保存。

1.2 土壤粒徑測定

使用Mastersizer 2000激光粒度儀(馬爾文公司)對采回的土壤進行粒度測定，計算礫、砂、粉砂、黏土的比例。

1.3 土壤環(huán)境DNA提取

1.3.1 SDS-GITC-PEG法提取

本法參照文獻[20]，并進行部分步驟的改良(為行文方便，下文及圖表中該方法簡稱C)，將采集的樣品均勻混合，對土壤進行預(yù)處理[25]。取適量的土樣于50 mL無菌離心管中，加5倍體積的TENP buffer(50 mmol/L Tris-Hcl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.01 g/mL PVPP，pH值為10.0)，渦旋振蕩5 min，12 000×g室溫離心5 min，收集沉淀(該步驟重復(fù)兩次)，加5倍體積的PBS buffer，渦旋混勻，12 000×g室溫離心5 min，收集沉淀(該步驟重復(fù)兩次)。沉淀冷凍干燥后裝于無菌離心管中備用。稱取10 g經(jīng)預(yù)處理的土壤于50 mL離心管，加16 mL SDS裂解液(0.25 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA，4% SDS)，渦旋混勻，68℃溫育30 min。加4 mL 5 mol/L 異硫氰酸胍混勻后68℃溫育1 h，每10 min輕輕搖動，12 000×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移入50 mL干凈的離心管，加0.125倍體積的5 mol/L醋酸鉀和0.42倍體積40% PEG8000，-20℃下沉淀2-4 h，14 000×g離心20 min。沉淀用18 mL 2×CTAB (2% CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA)溶解，68℃溫育15 min，加等體積的氯仿：異戊醇，輕柔混勻，12 000×g室溫離心10 min，加0.1倍體積3 mol/L NaAc和0.6倍體積的異丙醇，靜置于室溫下1 h，14 000×g，25℃離心20 min，沉淀物用70%乙醇清洗兩次，加適量TE溶解沉淀，并收集于1.5 mL的微型離心管中。

圖1 樣品采集地

1.3.2 試劑盒法提取

采用土壤基因組DNA快速提取試劑盒(Bioteke公司)(以下簡稱B+)，TIANamp Soil DNA試劑盒(天根公司)(以下簡稱T)，F(xiàn)astDNA Spin Kit for Soil試劑盒(MP公司)(以下簡稱F)和DNeasy PowerSoil試劑盒(Qiangen公司)(以下簡稱P)，提取方法參照各試劑盒操作說明書。其中Bioteke試劑盒實驗中省去溶菌酶處理的一步，其他步驟不變，也進行了提取DNA的嘗試(以下簡稱B-)。

因此本研究中一共用6種方法提取紅樹林土壤環(huán)境DNA。測定提取后的DNA濃度、A260/A280和A260/A230，并用瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA質(zhì)量。所有實驗均設(shè)置3次以上的實驗重復(fù)。

1.4 DNA純化

用2種試劑盒對上述提取的DNA進行純化：柱式腐殖酸清除試劑盒法(北京天恩澤)(以下簡稱H)和One-step PCR Inhibitor Removal試劑盒(ZYMO Research公司)(以下簡稱O)，實驗方法參照試劑盒說明書。測定純化后的DNA濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，同時以未用純化試劑盒純化的樣品(以下簡稱W)作對照。

1.5 PCR擴增

使用不同的細菌、真菌、底棲無脊椎動物、植物和線蟲的通用引物對提取的土壤環(huán)境DNA進行PCR擴增，篩選到以下擴增效果較好的引物，引物序列及對應(yīng)的PCR程序見表1。

表1 PCR引物擴增名稱及條件

Table 1 Name and condition of PCR primers and amplification

物種名稱Name of species引物Primer引物序列Primer sequencePCR程序PCR procedure細菌BacteriaF341GC5′CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG3′94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 30 s,35 cyclesR5345′ATTACCGCGGCTGCTGG3′真菌Fungus ITS1F5′CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3′ 94℃ 30 s,53℃ 30 s,72℃ 30 s,37 cyclesITS2R5′GCTGCGTTCTTCATCGATGC3′植物Plant matK3FKIM5′CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAC3′94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,38 cyclesmatKIRKIM5′ACCCAGTCCATATGGAAATCTTGGTTC3′無脊椎動物InvertebrateLCO14905′GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3′94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 1 min,35 cyclesHCO21985′TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3′線蟲NematodeNem18SF5′CGCGAATRGCTCATTACAACAGC3′ 94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 1 min,37 cyclesNem18SR5′GGGCGGTATCTGATCGCC3′

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Graphpad Prism 7軟件分別對兩個地方樣品不同提取方法得到的DNA濃度兩兩進行單因素t檢驗，分析不同提取方法之間是否存在差異性，以及繪制A260/A280折線圖，使用Origin 6軟件繪制所提DNA濃度的柱狀圖，使用Excel對純化后的DNA得率進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤粒徑分析

使用激光粒度儀對草頭村和山口采集回來的樣品進行粒徑分析，山口樣品砂粒的含量是草頭村的2.46倍，而草頭村的土樣中粉砂和黏土的含量比山口土樣中的高(表2)。綜合來說，草頭村的土壤更黏，而山口紅樹林取樣點的土壤沙質(zhì)更多。

表2 土壤粒徑分析

Table 2 Analysis of soil grain size

采樣地點Sampling site粒組含量Grain group content (%)礫Gravel砂Grit粉砂Grit黏土Clay山口Shankou0.0037.0844.2818.04草頭村Caotoucun0.0015.046.9323.03

2.2 土壤環(huán)境DNA提取和純化

用6種方法提取兩處不同紅樹林的土壤環(huán)境DNA，其中5種試劑盒法每次實驗均提取0.3 g土壤，SDS-GITC-PEG法取10 g土壤(為了數(shù)據(jù)對比的合理性和統(tǒng)一性，此法提取到的DNA量也換算成以0.3 g土壤為起始量)，將得到的DNA濃度分別進行兩兩t檢驗(表3)。對于草頭村土壤樣品，各方法提取的土壤環(huán)境DNA濃度大小為B+>B->F>P>T>C，即Bioteke試劑盒的提取效率最高。統(tǒng)計結(jié)果表明，對于草頭村樣品，B+和B-提取的DNA濃度P>0.1，差異不顯著，由此看出Bioteke試劑盒省去用溶菌酶消化這一步驟對總DNA提取影響不大；但其他試劑盒兩兩對比，得到的P值均小于0.05，說明其他幾種試劑盒DNA提取效率存在顯著性差異。對于山口紅樹林土樣，用不同方法提取后的DNA濃度對比情況和草頭村的有所差異，土壤環(huán)境DNA濃度大小為B-≥B+>F≈T≈C≥P。將所得濃度值同樣也進行兩兩t檢驗，P、F、T和C 4種方法同B+對比得到的P<0.05，說明B+與這4種方法存在明顯差異，雖然B-方法所提取的DNA濃度平均值最高，但標(biāo)準差也最大，t檢驗顯示B-法與其余5種方法的差異不顯著，此外，也可以看到P和F之間存在明顯差異。不同試劑盒對于不同采樣地提取DNA的結(jié)果有差異，推測與采樣地樣品的理化性質(zhì)有關(guān)?？偟膩碚f，就總DNA的提取效率而言，Bioteke土壤基因組DNA快速提取試劑盒表現(xiàn)最優(yōu)，F(xiàn)astDNA Spin Kit for Soil試劑盒次之，諸多文獻中推薦的DNeasy PowerSoil試劑盒在提取山口紅樹林土壤DNA時表現(xiàn)欠佳。

表3 6種eDNA提取方法的比對及統(tǒng)計分析

Table 3 Comparison and statistic analysis of eDNA extraction using 6 methods

采樣地點Sampling site提取方法Extraction methods濃度Concentration (μg/μL)P(vs B-)P(vs P)P(vs F)P(vs T)P(vs C)草頭村CaotoucunB+91.14±10.090.239 0<0.000 10.000 2<0.000 1<0.000 1B-70.68±13.340.006 50.040 10.000 10.000 1P28.800±1.1670.000 1<0.000 1<0.000 1F40.540±1.975<0.000 1<0.000 1T17.130±1.029<0.000 1C2.178 0±0.934 6山口ShankouB+88.9±25.670.857 50.008 70.016 10.016 00.017 1B-99.29±50.760.105 40.137 00.130 60.130 1P12.13±1.35<0.000 10.383 10.548 3F19.820 0±0.402 60.747 40.756 7T17.800±6.1690.956 9C17.230±8.204

本研究使用2種試劑盒對6種方法提取的總DNA進行純化。總體來說，One-step PCR Inhibitor Removal試劑盒純化效率比腐殖酸清除劑試劑盒純化效率要高，各種方法提取的草頭村土壤環(huán)境DNA經(jīng)兩種試劑盒純化后的得率總體要比山口紅樹林土壤的高(表4)。但使用這兩種試劑盒對DNA純化后都對土壤環(huán)境DNA造成不小的損失(圖2a)，損失率在37.40%-96.25%。特別是之前表現(xiàn)最佳的Bioteke試劑盒提取的DNA經(jīng)腐殖酸清除劑試劑盒純化后造成DNA大量損失，損失率高達65.80%-93.45%，其中，山口紅樹林土壤由Bioteke試劑盒提取的DNA經(jīng)腐殖酸清除劑試劑盒純化后損失率尤其大，得率僅有7.33%，經(jīng)One-step PCR Inhibitor Removal試劑盒純化后的得率也僅為14.59%(表4)。6種方法提取以及2種方式純化后的DNA均經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳的檢驗，可以看到總DNA清晰明亮的條帶(圖2b-c)。

表4 兩種純化方法效率比較

Table 4 DNA purification efficiency of 2 methods

采樣地點Sampling site提取方法Extraction methods濃度平均值Mean concentraction(μg/μL)試劑盒H處理濃度Treatment of Kit H (μg/μL)得率Yield (%)試劑盒O處理濃度Treatment of Kit O (μg/μL)得率Yield (%)草頭村CaotoucunB+84.20023.42027.8061.14072.60B-66.90022.88034.2033.36049.90P31.08013.39041.8018.12058.30F45.48017.69038.9027.97061.50T18.3607.61041.4011.58063.10C0.1470.06846.300.04530.60山口ShankouB+107.6807.8907.3315.71014.59B-106.5206.9806.5517.39016.33P16.4306.62040.2911.54070.24F19.7908.76044.268.76044.26T18.8804.18022.145.40028.60C0.8000.0303.750.0405.00

DNA在260 nm和280 nm下的吸光光度比值體現(xiàn)了DNA的純度，純DNA的A260/A280的比值為1.7-1.8較好[22]。兩個地點的樣品采用6種提取方法，經(jīng)2個純化試劑盒純化后，A260/A280的變化趨勢和純化前基本一致；草頭村樣品提取的DNA經(jīng)腐殖酸清除劑試劑盒純化后A260/A280基本在1.8附近，而One-step PCR Inhibitor Removal試劑盒純化后的DNA的A260/A280波動較大；與之相反的是，山口紅樹林的土壤樣品提取的DNA經(jīng)腐殖酸清除劑試劑盒純化后A260/A280波動很大，而One-step PCR Inhibitor Removal試劑盒處理的DNA的A260/A280相對穩(wěn)定，維持在1.6-2.0(圖2d)。推測由于兩地土壤粒徑差異較大，造成土壤中的微生物豐富程度有差異，腐殖酸及生物酶含量也有差異，導(dǎo)致兩種試劑盒的表現(xiàn)不一致。

CTC：草頭村；SK：山口；(a)DNA濃度的綜合比較；(b)草頭村土壤環(huán)境DNA電泳圖；(c)山口紅樹林土壤環(huán)境DNA電泳圖；(d)DNA的A260/A280示意圖

CTC：Caotoucun,SK：Shankou；(a)Comprehensive comparison of eDNA concentration,(b)Electrophoresis of soil eDNA in Caotoucun,(c)Electrophoresis of total DNA of mangrove soil in Shankou,(d)A260/A280schematic diagram of eDNA

圖2 土壤環(huán)境DNA提取及純化結(jié)果

Fig.2 Extraction and purification results of soil eDNA

2.3 PCR擴增結(jié)果

圖3a-b為兩個地點提取的DNA對細菌16S的引物PCR擴增結(jié)果，4種試劑盒(1-3，7-15泳道)直接提取的DNA和經(jīng)過兩種純化試劑盒處理的DNA針對細菌16S引物都能夠有效擴增，Bioteke土壤基因組DNA快速提取試劑盒省去用溶菌酶消化這一步驟(4-6泳道)也能有效地擴增細菌DNA。草頭村樣品使用SDS-GITC-PEG法提取的DNA能擴增出單一的條帶，但未經(jīng)純化和經(jīng)腐殖酸清除劑試劑盒純化的DNA擴增出的目的條帶亮度較暗，經(jīng)One-step PCR Inhibitor Removal試劑盒純化后的DNA擴增出的條帶清晰明亮；山口樣品使用SDS-GITC-PEG法提取的DNA無法擴增出目的條帶，而經(jīng)過腐殖酸清除劑試劑盒純化處理后的DNA能夠有效擴增，但經(jīng)One-step PCR Inhibitor Removal試劑盒處理后的DNA，未能擴增出目的條帶。兩種純化試劑盒再次有不同的表現(xiàn)。

圖3c-d為無脊椎動物線粒體COI基因擴增結(jié)果，5種試劑盒方法直接提取的DNA和經(jīng)兩種純化試劑盒處理的DNA都能擴增出有效條帶；SDS-GITC-PEG法提取的草頭村樣品DNA也能擴增出單一條帶，但條帶的亮度較暗，而山口紅樹林樣品DNA，經(jīng)腐殖酸清除劑試劑盒純化后可以擴增出單一且明亮的條帶。

圖3e-f為植物葉綠體基因matK的擴增結(jié)果，草頭村樣品中，只有用DNeasy PowerSoil試劑盒提取的DNA擴增出單一條帶，但條帶亮度比較暗，而山口紅樹林樣品提取的DNA，在進行二次PCR擴增時，Bioteke試劑盒去溶菌酶一步提取后再經(jīng)去腐殖酸試劑盒純化、FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒直接提取、DNeasy PowerSoil試劑盒直接提取和2種純化方式，以及SDS-GITC-PEG法提取后去腐殖酸純化均出現(xiàn)有效條帶，且用DNeasy PowerSoil試劑盒提取的DNA經(jīng)兩種方式純化后擴增出來的目的條帶最優(yōu)。

草頭村和山口的真菌PCR擴增圖基本都出現(xiàn)了符合目的條帶區(qū)間的條帶，但兩個地點的DNA擴增出的主要條帶亮度明顯有差異(圖3g-h)，表明兩個不同紅樹林區(qū)域的土壤可能因為土壤粒徑、植被種類不同等原因，造成真菌種類的差異。有文獻指出，由于真菌特殊的細胞壁結(jié)構(gòu)以及不同的土壤性質(zhì)的復(fù)雜性，提取土壤的真菌DNA需要對常規(guī)的提取方法進行高速振蕩的優(yōu)化，本研究按照文獻[26]的方法，加了高速振蕩處理后，用3個試劑盒進行DNA的提取并如前述方法進行PCR擴增，從PCR電泳圖中(圖3i)看出，條帶并沒有明顯的變化，甚至山口樣品DNA的擴增條帶比之前亮度要低，推測高速振蕩可能導(dǎo)致真菌破壁過度而影響了DNA的提取。

(a)草頭村-細菌，(b)山口-細菌，(c)草頭村-無脊椎動物，(d)山口-無脊椎動物，(e)草頭村-植物，(f)山口-植物，(g)草頭村-真菌，(h)山口-真菌，(i)草頭村、山口-真菌(高速振蕩)，(j)草頭村、山口-線蟲;1表示草頭村，2表示山口

(a)Caotoucun-bacteria，(b)Shankou-bacteria，(c)Caotoucun-invertebrate，(d)Shankou-invertebrate，(e)Caotoucun-plant，

(f)Shankou-plant，(g)Caotoucun-fungus，(h)Shankou-fungus，(i)Caotoucun,Shankou-fungus(the high speed shock)，(j)Caotoucun,Shankou-nematode；1 is Caotoucun，2 is Shankou

圖3 細菌、植物、無脊椎動物、真菌、線蟲PCR擴增結(jié)果

Fig.3 PCR amplification result of bacteria,plants,invertebrates,fungus,and nematodes

因為小型底棲動物如線蟲類，不是我們今后的研究范疇，在此只選擇了兩種方法提取的DNA對線蟲18S rDNA進行了擴增。使用FastDNA Spin Kit for Soil和DNeasy PowerSoil試劑盒直接提取的DNA對線蟲進行PCR擴增，來自兩個紅樹林采樣點的土壤DNA都能擴增出有效的單一條帶(圖3j)。

3 討論

本研究對北海兩處紅樹林潮間帶采集土壤樣品進行土壤環(huán)境DNA提取的方法學(xué)研究。采用6種方法提取土壤環(huán)境DNA，實驗結(jié)果顯示，對于草頭村的土壤樣品，Bioteke土壤基因組DNA快速提取試劑盒的提取效率顯著高于其他4種方法；對于山口紅樹林采集的土壤樣品，也是Bioteke試劑盒提取效率最高，與其他4種方法存在顯著性差異。FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒和DNeasy PowerSoil試劑盒這2種在外文文獻中最常用到的試劑盒提取的DNA濃度差異顯著，且濃度均較低，遠遠低于Bioteke試劑盒提取的。FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒和DNeasy PowerSoil試劑盒在國外多篇論文中均有推薦和使用[27-28]，但也有國內(nèi)學(xué)者得出和本研究相似的結(jié)果，即這兩個進口試劑盒提取土壤環(huán)境DNA量較少[29]且價格昂貴。

紅樹林的強還原性、強酸性和高鹽含量等特性使得在該生境下的物種也必有其特殊性，同時，紅樹林土壤中有機物通過植物碎屑和腐爛的根系不斷積累，腐殖酸和各種生物酶豐富[3]。腐殖酸等因子會影響PCR的擴增效率[30]，因此在做PCR擴增實驗之前，通常需要對提取的紅樹林土壤環(huán)境DNA進行純化處理，以去除腐殖酸等PCR抑制因子。兩種純化試劑盒純化DNA后，雖然A260/A280有一定的改善，但DNA的得率均不高，DNA的損失高達37.40%-96.25%，尤其是在提取DNA時，表現(xiàn)優(yōu)秀的Bioteke試劑盒提取的DNA損失率最高。

土壤環(huán)境DNA包括了胞內(nèi)和胞外的DNA，其中胞內(nèi)DNA通常為原核、真核微生物的DNA以及動植物脫落的細胞，而胞外DNA是環(huán)境DNA中非常重要的一部分，這些游離的DNA來自于生物體脫落的皮膚、排泄尿液、糞便、體液等[31]，正是這些來源的胞外DNA使得通過環(huán)境DNA來檢測生物多樣性成為可能。為檢驗提取的DNA是否包含有豐富的物種信息，首先使用廣西北部灣紅樹林中的廣布物種紅樹蜆(Polymesodaerosa)和歪紅樹蜆(Polymesodaexpansa)的線粒體COI特異引物和紅樹植物秋茄(Kandeliacandel)的葉綠體matK特異引物進行PCR擴增，得到相應(yīng)的特異性擴增產(chǎn)物條帶，并測序驗證成功(結(jié)果未展示)。其次，為檢驗所提取的DNA是否具有廣泛的物種覆蓋度，使用細菌、真菌、底棲無脊椎動物、植物和線蟲的通用引物分別進行擴增，目的擴增序列分別為細菌16S rDNA的V3區(qū)[32]，真菌ITS1[33]，無脊椎動物的線粒體COI[34]，植物葉綠體matK[35]，線蟲18S rDNA[36](表1)。

目前市售的土壤環(huán)境DNA提取試劑盒主要針對土壤微生物多樣性研究，因此相應(yīng)地對提取微生物DNA的效果進行了優(yōu)化，本研究實驗結(jié)果也可以看出，4個試劑盒都能有效提取土壤中的細菌DNA，PCR結(jié)果良好。在前人發(fā)表的論文中提到紅樹林土壤中含有腐殖酸等PCR抑制劑，需要去除后再進行PCR擴增，但本研究結(jié)果表明，這4種試劑盒無論是根據(jù)試劑盒說明書直接提取，還是用國產(chǎn)腐殖酸去除試劑盒以及One-step純化試劑盒處理后得到的DNA，均能實現(xiàn)對細菌引物和無脊椎動物引物的有效擴增，說明試劑盒本身已經(jīng)對PCR抑制劑實現(xiàn)了去除。稍意外的是，將土壤基因組DNA快速提取試劑盒中溶菌酶消化這一步給省去后，得到的實驗結(jié)果從電泳結(jié)果上看，與不省去步驟所得結(jié)果相比也并沒有差別。對于植物而言，需要兩次擴增后，土壤基因組DNA快速提取試劑盒、FastDNA Spin Kit for soil試劑盒、DNeasy PowerSoil試劑盒提取的DNA的擴增產(chǎn)物才出現(xiàn)單一的條帶，但即使兩次擴增，土壤基因組DNA快速提取試劑盒和FastDNA Spin Kit for soil試劑盒提取的DNA擴增的條帶也較暗，DNeasy PowerSoil試劑盒提取的DNA擴增效果最佳，可能是因為紅樹林中的植物落葉被微生物和動物快速分解和食用，導(dǎo)致土壤中含有植物的DNA量很少，所以較難擴增。本研究使用秋茄特異性引物對土壤環(huán)境DNA進行擴增時，也得到一樣的結(jié)果，說明DNeasy PowerSoil試劑盒雖然在提取DNA的量上并不突出，但所提取的DNA覆蓋面更加全面。由于土壤理化性質(zhì)的復(fù)雜性和真菌細胞壁結(jié)構(gòu)的特殊性，草頭村和山口土樣所提取的DNA在真菌擴增中存在明顯的差異，推測與土壤徑粒差異相關(guān)。有文獻表明，進行高速振蕩可以有效地提高真菌細胞的破壁率，所以本研究也嘗試在原有基礎(chǔ)上將樣品進行高速振蕩，但對結(jié)果并沒有實質(zhì)性的改變。底棲物種除微生物、植物、大型底棲動物外，還包括以線蟲為主的小型底棲動物，而線蟲由于體型小，傳統(tǒng)分類學(xué)的研究人員較少，多樣性的研究難度較大，所以本研究也嘗試采用文獻報道的線蟲的通用引物來進行擴增，發(fā)現(xiàn)也可以有效地擴增出DNA條帶。所提DNA的PCR擴增實驗結(jié)果在一定程度上反映提取到的總DNA中細菌、真菌、無脊椎動物、線蟲和植物的覆蓋率，但還不能量化說明所提的各類物種的覆蓋度和豐度，在后續(xù)實驗中，建議通過高通量測序?qū)Σ煌幚矸椒ǖ玫降腄NA中各類物種的覆蓋度和豐度并進行進一步的研究。

4 結(jié)論

本研究比較了不同的提取方法、純化方法在紅樹林土壤中提取環(huán)境DNA的效率，并使用細菌、真菌、底棲無脊椎動物、植物、線蟲的不同通用引物進行PCR擴增來討論提取的環(huán)境DNA中物種的覆蓋度。結(jié)果顯示，不同的方法提取不同類群生物產(chǎn)生的環(huán)境DNA的效率有一定的差異；但兩種方法純化前后DNA的質(zhì)量并沒有顯著差異；5種試劑盒方法提取的DNA均可以有效擴增出細菌和無脊椎動物的DNA；DNeasy PowerSoil試劑盒提取的DNA擴增植物引物結(jié)果最佳；來自不同區(qū)域紅樹林土壤的DNA在擴增真菌對應(yīng)引物時差異較大；使用FastDNA Spin Kit for Soil和DNeasy PowerSoil試劑盒直接提取的DNA可以有效擴增出線蟲的DNA。本研究為在紅樹林研究工作中進一步開展基于環(huán)境DNA技術(shù)的生物多樣性研究奠定了一定的基礎(chǔ)。今后的研究工作將對PCR擴增得到的產(chǎn)物進行高通量測序，并通過生物信息學(xué)來分析物種的種類及豐度，最終建立一套基于環(huán)境DNA技術(shù)的紅樹林生物多樣性調(diào)查方法，對傳統(tǒng)的生物多樣性監(jiān)測提供一個有力的補充，為紅樹林生物多樣性的監(jiān)測、保護和修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。