馬志林，陳先銳，葉柳健，李檢秀，黃艷燕，張?jiān)崎_(kāi)，蒙健宗**

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004；2.廣西科學(xué)院，國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西生物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007)

0 引言

乙偶姻(Acetoin,AC)，化學(xué)品名為3-羥基-2-丁酮，又名3-羥基丁酮或甲基乙酰甲醇，具有強(qiáng)烈的奶油、脂肪、黃油樣香氣，是多種天然食品和發(fā)酵食品的重要風(fēng)味物質(zhì)。我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014規(guī)定乙偶姻為允許使用的食用香料，F(xiàn)EMA安全號(hào)是2008[1-3]。而且，乙偶姻作為一種重要的四碳平臺(tái)化合物，已經(jīng)被美國(guó)能源部指定為優(yōu)先開(kāi)發(fā)的平臺(tái)化合物之一，在食品、化工、醫(yī)藥、煙草、化妝品、調(diào)酒等行業(yè)具有廣泛的用途[4-5]。乙偶姻具有(R)-乙偶姻和(S)-乙偶姻兩種旋光異構(gòu)體，單一構(gòu)型的(R)-乙偶姻在合成高附加值手性藥物中間體、化學(xué)中間體、液晶材料等方面具有重要應(yīng)用，因此光學(xué)純(R)-乙偶姻的價(jià)值要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于混合型乙偶姻[3-4]。

目前生產(chǎn)乙偶姻的方法主要為化學(xué)合成法[6]和微生物合成法[7-14]?；瘜W(xué)合成乙偶姻產(chǎn)品中容易摻雜致癌致病化合物，限制了乙偶姻作為食品香精香料的使用。微生物合成的乙偶姻屬于天然香料，其市場(chǎng)價(jià)格要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于化學(xué)合成的產(chǎn)品。自然界能夠合成乙偶姻的微生物有很多，如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytaca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)和部分芽孢桿菌屬(Bacillus)等[15-19]，但天然菌株往往合成乙偶姻的能力較弱、(R)-乙偶姻光學(xué)純度低或菌株具有致病性，不利于(R)-乙偶姻的微生物發(fā)酵生產(chǎn)，導(dǎo)致光學(xué)純(R)-乙偶姻的市場(chǎng)價(jià)格居高不下，極大地限制了其發(fā)展和應(yīng)用。

近年來(lái)，選育和改造天然微生物合成乙偶姻取得較多的研究成果。Xu等[20]通過(guò)誘變篩選得到高產(chǎn)菌株B.subtilisTH-49，以葡萄糖為碳源得到乙偶姻產(chǎn)量46.9 g/L；Sun等[21]利用紫外及LiCl進(jìn)行復(fù)合誘變后篩選得到S.marcescensH32，再以蔗糖為碳源進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，乙偶姻產(chǎn)量能達(dá)到60.5 g/L。誘變育種隨機(jī)性較高，通過(guò)代謝工程手段對(duì)細(xì)胞合成(R)-乙偶姻進(jìn)行定向改造逐漸成為研究的主流。Bai等[22]和Lv等[23]分別對(duì)菌株S.marcescens進(jìn)行遺傳操作，通過(guò)敲除meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因slaC，或過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因slaR，使其具有利用蔗糖生產(chǎn)(R)-乙偶姻的能力，產(chǎn)量分別為21.8 g/L和39.9 g/L；Wang等[24]敲除K.pneumoniaeCGMCC 1.6366的2,3-丁二醇脫氫酶編碼基因budC，可阻斷菌株將乙偶姻轉(zhuǎn)化為2,3-丁二醇；進(jìn)一步敲除乙偶姻脫氫酶編碼基因acoABCD，工程菌株利用葡萄糖在補(bǔ)料發(fā)酵條件下生產(chǎn)(R)-乙偶姻可達(dá)62.3 g/L，光學(xué)純度為98.0%。大腸桿菌Escherichiacoli屬于非致病菌株，并且其本身不合成乙偶姻，因此有利于定向改造成生產(chǎn)光學(xué)純(R)-乙偶姻的工程菌株。Xiao等[25]在E.coliBL21(DE3)中過(guò)量表達(dá)來(lái)自B.subtilis的2,3-丁二醇脫氫酶基因ydjL(bdhA) 和來(lái)自Lactobacillusbrevis的NADH氧化酶基因noxE，以(2R,3R)-2,3-丁二醇為原料進(jìn)行全細(xì)胞催化得到41.8 g/L(R)-乙偶姻，光學(xué)純度為96.0%；Xu等[3]克隆S.marcescens的budR、budA、budB基因以及L.brevis的NADH氧化酶基因，將其導(dǎo)入E.coliDH5α中進(jìn)行表達(dá)，葡萄糖補(bǔ)料分批發(fā)酵的(R)-乙偶姻產(chǎn)量為60.3 g/L，光學(xué)純度為97.3%。

在微生物細(xì)胞中，α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactate Synthase，AlsS)和α-乙酰乳酸脫羧酶(α-acetolactate Decarboxylase，AlsD)是發(fā)酵丙酮酸生成(R)-乙偶姻的兩個(gè)關(guān)鍵酶。另外，糖酵解和三羧酸循環(huán)會(huì)產(chǎn)生大量的還原型輔酶NADH，而由丙酮酸到(R)-乙偶姻的合成并沒(méi)有消耗NADH，因此如果單一增強(qiáng)(R)-乙偶姻的合成會(huì)造成NADH累積，細(xì)胞將啟動(dòng)各種雜醇雜酸合成途徑消耗過(guò)量的NADH來(lái)實(shí)現(xiàn)氧化型輔酶NAD+再生，必然會(huì)降低(R)-乙偶姻的合成效率和光學(xué)純度。本研究通過(guò)對(duì)細(xì)胞(R)-乙偶姻代謝途徑進(jìn)行系統(tǒng)分析，利用輔酶工程精確調(diào)控異源NADH氧化酶進(jìn)行合理表達(dá)來(lái)消耗胞內(nèi)過(guò)量的NADH，使胞內(nèi)NADH/NAD+氧化還原平衡，從而提高(R)-乙偶姻光學(xué)純度。以大腸桿菌E.coliMG1655為宿主細(xì)胞，將來(lái)源于E.cloacae的α-乙酰乳酸合成酶基因budB、α-乙酰乳酸脫羧酶基因budA和來(lái)源于L.brevis的NADH氧化酶基因noxE的核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，利用人工合成的方法獲得包含3個(gè)基因的基因簇，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A-budB-budA-noxE并導(dǎo)入大腸桿菌獲得工程菌株，達(dá)到提高目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和維持胞內(nèi)NADH/NAD+氧化還原平衡的雙重目的，進(jìn)一步優(yōu)化工程菌的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體

宿主菌株E.coliMG1655和表達(dá)載體pTrc99A由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

T4 DNA連接酶和各種限制性?xún)?nèi)切酶(NEB)；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和DNA純化試劑盒(Promega)；蛋白胨和酵母粉(OXOID，分析純)；葡萄糖、氯化鈉(分析純)、乙腈(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，HPLC級(jí)別)；乙酸乙酯(成都市科龍化工試劑廠，分析純)；乙偶姻(>98.0%)和2,3-丁二醇(>97.0%)(TCA)；氨芐(Amp,北京索萊寶科技有限公司)；甜菜堿(阿拉丁公司)；維生素B1(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.1.3 儀器

恒溫水浴搖床ZWY-110X50(上海智城分析儀器制造有限公司),生物傳感分析儀SBA-40D(山東省科學(xué)院生物研究所),3 L發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備工程有限公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-5000(上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),氣相色譜儀7890A(安捷倫科技有限公司),紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)DU800(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司),MIKRO 200離心機(jī)(德國(guó)Hettich科學(xué)儀器公司)。

1.1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，pH值調(diào)至7.0，轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)時(shí)添加氨芐0.1 g/L，固體培養(yǎng)基另加20 g/L瓊脂粉。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，酵母粉7 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉0.5 g/L，氨芐0.1 g/L，甜菜堿4 mmol/L，維生素B10.1 g/L，pH值調(diào)至7.0。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)(R)-乙偶姻工程菌株的構(gòu)建

將來(lái)源于E.cloacae的α-乙酰乳酸合成酶基因budB、α-乙酰乳酸脫羧酶基因budA和來(lái)源于L.brevis的NADH氧化酶基因noxE的核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在每個(gè)基因前面添加含核糖體結(jié)合位點(diǎn)和間隔序列TAAGGAGGATATACA連接成基因簇budB-budA-noxE，并由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行人工合成，利用酶切位點(diǎn)SacⅠ和BamHⅠ將基因簇budB-budA-noxE插入質(zhì)粒pTrc99A的啟動(dòng)子后面，獲得多順?lè)醋又亟M質(zhì)粒pTrc99A-budB-budA-noxE，再將重組質(zhì)粒pTrc99A-budB-budA-noxE轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliMG1655；以含質(zhì)粒pTrc99A的E.coliMG1655作為空白對(duì)照。分別挑取兩種轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒酶切驗(yàn)證、PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 產(chǎn)(R)-乙偶姻工程菌株的發(fā)酵

將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子接到含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，然后分別按照10%的接種量轉(zhuǎn)接于含有50 mL初始發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶(250 mL)中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各3瓶，37℃，250 r/min，培養(yǎng)36 h。取發(fā)酵液，經(jīng)離心機(jī)12 000 r/min離心2 min后，取上清液，經(jīng)過(guò)稀釋一定倍數(shù)后測(cè)殘?zhí)菨舛纫约?R)-乙偶姻含量。其中，(R)-乙偶姻得率為產(chǎn)物(R)-乙偶姻質(zhì)量與消耗葡萄糖質(zhì)量之比，生產(chǎn)強(qiáng)度為產(chǎn)物(R)-乙偶姻濃度與發(fā)酵周期之比。

1.2.3 產(chǎn)(R)-乙偶姻工程菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

利用搖瓶發(fā)酵分別對(duì)葡萄糖濃度、酵母粉濃度、蛋白胨濃度、最佳接種量以及最適初始pH值進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。

1.2.4 產(chǎn)(R)-乙偶姻工程菌株發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵

優(yōu)化初始發(fā)酵培養(yǎng)基后，將菌種接種于3 L發(fā)酵罐中，裝液量1.5 L，控制通氣量1.0 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，溫度37℃。當(dāng)殘?zhí)菨舛葹?0-40 g/L時(shí)補(bǔ)加葡萄糖至150-170 g/L，待發(fā)酵至殘?zhí)菨舛冉档?-8 g/L時(shí)停止發(fā)酵。

1.2.5 殘?zhí)菨舛鹊臋z測(cè)

取發(fā)酵液12 000 r/min離心處理2 min，取上清液稀釋100倍后，用生物傳感分析儀SBA-40D檢測(cè)殘?zhí)菨舛取?/p>

1.2.6 乙偶姻以及2,3-丁二醇濃度的檢測(cè)

使用氣相色譜儀測(cè)定乙偶姻和2,3-丁二醇的濃度。色譜柱為Phenomenex ZB-WAXplus毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度均為250℃，使用內(nèi)標(biāo)法并以乙腈作內(nèi)標(biāo)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 (R)-乙偶姻光學(xué)純度的測(cè)定

采用氣相色譜儀測(cè)定(R)-乙偶姻的光學(xué)純。色譜柱為Agilent Cyclosil-B毛細(xì)管手性柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；FID氫火焰檢測(cè)器，載氣為氮?dú)?，流?.6 mL/min。起始柱溫度100℃，保留1 min，然后以10℃/min的速度升溫至120℃，以6℃/min的速度升溫至130℃，以20℃/min的速度升溫至230℃，進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度均為240℃，以乙酸乙酯為萃取劑。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)(R)-乙偶姻工程菌株GXASR的構(gòu)建與發(fā)酵

將合成的基因簇budB-budA-noxE亞克隆至表達(dá)載體pTrc99A，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTrc99A-budB-budA-noxE，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliMG1655，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒酶切、PCR條帶電泳及DNA測(cè)序結(jié)果均驗(yàn)證正確，證明工程菌株構(gòu)建成功，命名為GXASR。同時(shí)本研究在各個(gè)基因前引入RBS序列來(lái)增強(qiáng)與核糖體間的親和力，提高蛋白翻譯效率[26]，以此來(lái)提高α-乙酰乳酸脫羧酶、α-乙酰乳酸合成酶以及氧化還原酶的表達(dá)，調(diào)控代謝流，以增加(R)-乙偶姻產(chǎn)量。

將對(duì)照菌株與工程菌株GXASR進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，36 h后發(fā)酵結(jié)束，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)照菌株發(fā)酵液中沒(méi)有檢測(cè)到(R)-乙偶姻產(chǎn)生，工程菌株GXASR能夠有效地合成(R)-乙偶姻(表1)。

表1 工程菌株GXASR在初始培養(yǎng)基中的發(fā)酵

Table 1 Fermentation performances of engineering strain GXASR in initial medium

菌種Strains殘還原糖濃度Concentration of residual sugar (g/L)(R)乙偶姻濃度Concentration of(R)Acetoin (g/L)2,3丁二醇濃度Concentration of2,3BD (g/L)得率Yield (g/g)生產(chǎn)強(qiáng)度Productivity(g/(L·h))MG1655/pTrc99A74.10±0.77NDND--GXASR0.0026.5±0.632.49±0.550.330.73

注：ND表示未檢測(cè)到

Note:ND means not detected

2.2 產(chǎn)(R)-乙偶姻工程菌株GXASR發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 葡萄糖濃度對(duì)GXASR工程菌株合成(R)-乙偶姻的影響

工程菌株GXASR在葡萄糖濃度80-120 g/L范圍內(nèi)，隨著碳源濃度的升高，(R)-乙偶姻產(chǎn)量也隨著提高。但是，隨著碳源濃度的升高，培養(yǎng)基變得更加黏稠使得傳質(zhì)效率變低，且較高的碳源濃度，使得菌體所受的滲透壓變得更大，不利于菌體生長(zhǎng)以及產(chǎn)物的合成。當(dāng)葡萄糖濃度>100 g/L時(shí)，發(fā)酵周期明顯延長(zhǎng)，并且殘?zhí)菨舛容^高，乙偶姻產(chǎn)量提高幅度較小而副產(chǎn)物2,3-丁二醇濃度提高幅度較大(表2)，從發(fā)酵周期、葡萄糖利用程度、乙偶姻產(chǎn)量、副產(chǎn)物生成量以及生產(chǎn)強(qiáng)度綜合考慮，將發(fā)酵培養(yǎng)基碳源濃度定為100 g/L。

表2 葡萄糖濃度對(duì)工程菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

Table 2 Effect of glucose concentration on (R)-acetoin produced by engineering strain GXASR

葡萄糖濃度Concentration of glucose (g/L)發(fā)酵周期Fermentation time (h)殘還原糖濃度Concentration of residual sugar (g/L)(R)乙偶姻濃度Concentration of (R)Acetoin (g/L)2,3丁二醇濃度Concentration of 2,3BD (g/L)得率Yield (g/g)生產(chǎn)強(qiáng)度Productivity(g/(L·h))80360.35±0.0326.10±0.862.17±0.340.330.7390380.43±0.0828.44±0.772.31±0.250.320.75100406.60±0.7330.49±0.823.54±0.460.330.761104816.47±0.8431.16±0.619.10±0.380.330.651205429.40±0.6133.24±0.6412.24±0.770.370.62

2.2.2 蛋白胨濃度對(duì)工程菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

工程菌株GXASR在蛋白胨濃度為15 g/L時(shí)，(R)-乙偶姻濃度、得率、生產(chǎn)強(qiáng)度都達(dá)到了最大；當(dāng)?shù)鞍纂藵舛瘸^(guò)15 g/L時(shí)，(R)-乙偶姻合成效率反而變低，得率以及生產(chǎn)效率也跟著下降(表3)，這可能是由于蛋白胨濃度不斷變高，使得氮源濃度過(guò)高導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)富余，菌體將多余的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于合成自身所需的其他物質(zhì)，從而致使(R)-乙偶姻合成效率低下，故將發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨濃度定為15 g/L。

表3 蛋白胨濃度對(duì)工程菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

Table 3 Effect of peptone concentration on (R)-acetoin produced by engineering strain GXASR

蛋白胨濃度Concentration of peptone (g/L)發(fā)酵周期Fermentation time (h)殘還原糖濃度Concentration of residual sugar (g/L)(R)乙偶姻濃度Concentration of (R)Acetoin (g/L)2,3丁二醇濃度Concentration of 2,3BD (g/L)得率Yield (g/g)生產(chǎn)強(qiáng)度Productivity(g/(L·h))5.0367.73±0.2528.01±0.260.98±0.130.300.787.5366.73±0.4329.73±0.171.21±0.060.320.8310.0361.73±0.3632.41±0.821.48±0.220.330.9012.5363.67±0.5433.31±0.611.62±0.040.350.9315.0366.23±0.6134.05±0.051.56±0.140.360.9517.5363.63±0.7133.48±0.881.62±0.250.350.9320.0368.97±0.8331.27±0.341.39±0.300.340.87

2.2.3 酵母粉濃度對(duì)工程菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

酵母粉濃度為15 g/L時(shí)，(R)-乙偶姻濃度、得率和生產(chǎn)強(qiáng)度最高；隨著酵母粉濃度繼續(xù)增大，3項(xiàng)指標(biāo)都略有下降(表4)，這是由于菌株將富余的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及能量用于副產(chǎn)物的合成，從而降低(R)-乙偶姻合成效率，因此將發(fā)酵培養(yǎng)基酵母粉濃度定為15 g/L。

表4 酵母粉濃度對(duì)工程菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

Table 4 Effect of yeast extract concentration on (R)-acetoin produced by engineering strain GXASR

酵母粉濃度Concentration of yeast extract (g/L)發(fā)酵周期Fermentation time (h)殘還原糖濃度Concentration of residual sugar (g/L)(R)乙偶姻濃度Concentration of (R)Acetoin (g/L)2,3丁二醇濃度Concentration of 2,3BD (g/L)得率Yield (g/g)生產(chǎn)強(qiáng)度Productivity(g/(L·h))5.0367.45±0.3230.74±0.581.91±0.030.310.857.5361.70±0.5332.68±0.832.71±0.210.330.9010.0362.83±0.6633.00±0.802.43±0.330.340.9212.5362.55±0.8234.36±0.242.86±0.540.370.9515.0360.20±0.1035.51±0.332.85±0.180.380.9917.5363.77±0.7535.13±0.222.52±0.390.370.9820.0360.27±0.1635.01±0.673.11±0.260.350.97

2.2.4 發(fā)酵初始pH值以及接種量對(duì)工程菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

pH值為6.0-7.5時(shí)，工程菌株耗糖效率均比較好，殘?zhí)菨舛刃∮?0 g/L，當(dāng)pH值為6.5時(shí)，菌株的(R)-乙偶姻產(chǎn)量最高(圖1)。首先菌株在pH值為7.0的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到pH值為6.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，由于pH值相近，菌種很容易適應(yīng)pH值的變化；其次菌種在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，培養(yǎng)基會(huì)呈現(xiàn)弱酸性的趨勢(shì)，選擇pH值為6.5的發(fā)酵條件，在發(fā)酵過(guò)程中不需要補(bǔ)加過(guò)多的堿以維持培養(yǎng)基呈中性，減少了堿液對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。接種量為10%時(shí)菌株耗糖效率最快、(R)-乙偶姻產(chǎn)量最高。接種量過(guò)低，菌種增殖速度慢，(R)-乙偶姻產(chǎn)量不理想；而接種量過(guò)高，菌種增殖速度快，細(xì)胞生長(zhǎng)額外消耗了較多的碳源，導(dǎo)致用于合成(R)-乙偶姻的葡萄糖減少，故(R)-乙偶姻不升反降(圖2)。因此，確定菌種最適發(fā)酵培養(yǎng)基pH值為6.5，最適接種量為10%。在優(yōu)化的條件下?lián)u瓶發(fā)酵(R)-乙偶姻產(chǎn)量為36.82 g/L，光學(xué)純?yōu)?9.1%。

圖1 初始pH值對(duì)菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

Fig.1 Effect of initial pH value on (R)-acetoin produced by GXASR

圖2 接種量對(duì)菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

Fig.2 Effect of inoculate volume on (R)-acetoin produced by GXASR

2.3 工程菌株GXASR發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵

經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定以100 g/L葡萄糖為碳源、15 g/L蛋白胨和15 g/L酵母粉為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基，pH值為6.5以及接種量10%進(jìn)行3 L發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在發(fā)酵過(guò)程中的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，檢測(cè)發(fā)酵液菌體濃度、(R)-乙偶姻濃度、2,3-丁二醇濃度以及殘?zhí)菨舛?。?dāng)殘?zhí)菨舛冉抵?0-40 g/L時(shí)一次補(bǔ)加葡萄糖至160 g/L。發(fā)酵初期菌體OD600增長(zhǎng)迅速，耗糖較快，發(fā)酵7.5 h時(shí)殘?zhí)菨舛冉档偷?0.2 g/L，菌體OD600達(dá)17.4，此時(shí)菌體濃度高、代謝活力強(qiáng)，通過(guò)補(bǔ)加葡萄糖，細(xì)胞可以高效合成(R)-乙偶姻，發(fā)酵液中(R)-乙偶姻濃度快速升高。發(fā)酵36 h時(shí)，殘?zhí)菨舛冉抵?.5 g/L，發(fā)酵液中(R)-乙偶姻濃度不再增加，發(fā)酵結(jié)束，(R)-乙偶姻產(chǎn)量達(dá)到67.65 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.88 g/(L·h)，得率為0.40 g/g(圖3)。

圖3 工程菌株GXASR補(bǔ)料發(fā)酵

Fig.3 The fed-batch fermentation of engineering strain GXASR

3 討論

化學(xué)法及天然菌種產(chǎn)生的乙偶姻都是(R)-乙偶姻和(S)-乙偶姻的混合物，兩者的物理化學(xué)性質(zhì)相近，手性拆分十分困難，存在高成本、高能耗、污染嚴(yán)重等問(wèn)題，極大地限制了光學(xué)純(R)-乙偶姻開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。因此，開(kāi)展微生物代謝網(wǎng)絡(luò)改造及高效生產(chǎn)光學(xué)純(R)-乙偶姻的研究具有重要的意義，也是近年來(lái)研究熱點(diǎn)之一。Kochius等[27]利用酶催化氧化meso-2,3-丁二醇的方法合成(R)-乙偶姻，濃度為48 mmol/L，反應(yīng)需要的輔酶NAD+由電化學(xué)方法再生；2016年，Guo等[28]在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)meso-2,3-丁二醇脫氫酶、NADH氧化酶和血紅蛋白的基因，將獲得的E.coli/pET-mbdh-nox-vgb作為全細(xì)胞生物催化劑，可以高效催化meso-2,3-丁二醇還原為(R)-乙偶姻，(R)-乙偶姻的產(chǎn)量為86.7 g/L，光學(xué)純度為97.9%。但全細(xì)胞催化法需要采用meso-2,3-丁二醇、(R,R)-2,3-丁二醇等作為底物，光學(xué)純的底物成本高昂，無(wú)法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)(R)-乙偶姻。有相當(dāng)多的報(bào)道[3,22-25]通過(guò)合成生物學(xué)方法和代謝工程方法在微生物細(xì)胞中高效表達(dá)(R)-乙偶姻合成的關(guān)鍵酶基因或敲除(R)-乙偶姻降解的相關(guān)基因，對(duì)菌株進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)改造，采用葡萄糖、蔗糖等碳源合成(R)-乙偶姻，其產(chǎn)量和光學(xué)純度都有較大的提高。但是工程菌株中代謝網(wǎng)絡(luò)的碳架物質(zhì)流量往往會(huì)發(fā)生重大改變，導(dǎo)致(R)-乙偶姻合成與細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡關(guān)系的失調(diào)，進(jìn)而限制(R)-乙偶姻產(chǎn)量和光學(xué)純度的進(jìn)一步提高，(R)-乙偶姻光學(xué)純度通常在98%以下。大腸桿菌遺傳背景清晰、轉(zhuǎn)化效率高、遺傳操作技術(shù)成熟，使其在代謝工程等研究領(lǐng)域備受青睞，是用于構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠合成生物基化學(xué)品首選宿主之一。本研究以大腸桿菌E.coliMG1655為宿主細(xì)胞，將來(lái)源于E.cloacae的α-乙酰乳酸合成酶基因budB、α-乙酰乳酸脫羧酶基因budA和來(lái)源于L.brevis的NADH氧化酶基因noxE組成基因簇，構(gòu)建大腸桿菌生產(chǎn)(R)-乙偶姻工程菌株，實(shí)現(xiàn)大腸桿菌高效合成(R)-乙偶姻和胞內(nèi)NADH/NAD+氧化還原平衡，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程，經(jīng)搖瓶發(fā)酵的(R)-乙偶姻產(chǎn)量為36.82 g/L，光學(xué)純度高達(dá)99.1%，發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵的(R)-乙偶姻產(chǎn)量達(dá)到67.65 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.88 g/(L·h)，得率為0.40 g/g，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)強(qiáng)度高，是具有潛力的(R)-乙偶姻生產(chǎn)方法。

同時(shí)在研究中發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖、酵母粉和蛋白胨等作為原料時(shí)成本仍較高，在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)不利于提高效益；發(fā)酵過(guò)程中隨著(R)-乙偶姻的積累，會(huì)出現(xiàn)2,3-丁二醇、乙醇、乳酸、乙酸等副產(chǎn)物的產(chǎn)出，副產(chǎn)物濃度升高時(shí)會(huì)降低目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率并導(dǎo)致生物毒性，對(duì)菌體的生長(zhǎng)速率、菌體濃度以及外源基因表達(dá)都會(huì)產(chǎn)生明顯的抑制作用。本研究下一步將探討利用廉價(jià)原料替代高價(jià)碳源氮源，并通過(guò)代謝工程、基因組學(xué)等手段對(duì)細(xì)胞內(nèi)(R)-乙偶姻的合成和分解代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行系統(tǒng)解析與優(yōu)化，為低成本、高效率生產(chǎn)高光學(xué)純(R)-乙偶姻提供操作性良好的技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了產(chǎn)光學(xué)純(R)-乙偶姻的大腸桿菌工程菌株GXASR，并通過(guò)搖瓶發(fā)酵對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，使得工程菌株GXASR能高效地合成(R)-乙偶姻。GXASR工程菌株在優(yōu)化后的培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件中，經(jīng)搖瓶發(fā)酵的(R)-乙偶姻產(chǎn)量為36.82 g/L，通過(guò)發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵36 h，(R)-乙偶姻產(chǎn)量能夠達(dá)到67.65 g/L，光學(xué)純?yōu)?9.1%，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.88 g/(L·h)，得率為0.40 g/g，顯著提高了(R)-乙偶姻合成效率。本研究為人工途徑合成(R)-乙偶姻提供了現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。