許萬(wàn)楓，蘇 潔，翁路安，孫晨晨，陳素紅，呂圭源?

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053； 2.浙江工業(yè)大學(xué)，浙江 杭州310014）

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarin insufficiency，POI） 指女性在40 歲以前出現(xiàn)卵巢功能減退，主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常、雌激素下降、促性腺激素升高等［1］。據(jù)調(diào)查［2］顯示，40 歲女性POI 發(fā)病率約為1%，30 歲為0.1%，20 歲為0.01%。近年來(lái)，POI 發(fā)病率呈逐年升高且向低齡化發(fā)展，嚴(yán)重威脅女性生殖健康。雷公藤多苷是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的常用藥物，其副作用會(huì)引起POI。目前臨床上一般采用激素替代療法治療POI，但其停藥后易復(fù)發(fā)且副作用大，因此尚缺乏治療POI 的有效藥物。

中醫(yī)認(rèn)為“腎虛精虧、血海枯竭” 為POI 的主要病因，并以補(bǔ)腎養(yǎng)血為主要治則。臨床研究［3-5］表明，補(bǔ)腎養(yǎng)血中藥能夠通過(guò)調(diào)節(jié)性激素，起到改善卵巢功能的作用。孕康口服液由山藥、黃芪、當(dāng)歸、菟絲子、杜仲（炒）、續(xù)斷等23 味中藥組成，具有補(bǔ)腎健脾、益氣養(yǎng)血的功效，臨床上能有效預(yù)防及治療流產(chǎn)［6-8］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已發(fā)現(xiàn)孕康口服液能增加腎虛型、復(fù)發(fā)性及LPS 誘導(dǎo)等多種流產(chǎn)模型動(dòng)物的性激素水平，促使卵巢黃體化，維持卵泡正常發(fā)育［9-13］。因此，本研究進(jìn)一步采用雷公藤多苷致POI 模型小鼠，通過(guò)對(duì)動(dòng)情周期、內(nèi)分泌激素、卵巢組織形態(tài)學(xué)以及卵巢顆粒細(xì)胞凋亡等進(jìn)行檢測(cè)，探索孕康口服液對(duì)POI 的作用及可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 ICR 雌性小鼠60 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（20±2） g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證編號(hào)20150000563246，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （滬） 2017-0005。

1.2 藥物與試劑 孕康口服液（回音必齊齊制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10970068）；醋酸甲羥孕酮片（浙江仙琚制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33020715，批號(hào)160922）；戊酸雌二醇片（法國(guó)Delpharm Lille S.A.S.公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20171038，批號(hào)411 A）；雷公藤多苷片（浙江得恩德制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z33020422，批號(hào)1804138B）；ELISA 試劑盒孕酮（P，批號(hào)E20190101A）、雌二醇（E2，批號(hào)E20190101A）、抗苗勒管激素（AMH，批 號(hào) E20190101A）、抑制素 B （INHB，批 號(hào)E20190101A）、催乳素（PRL，批號(hào)E20190101A）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；ELISA 試劑盒促黃體生成素（LH，批號(hào)MM-44039M1）、促卵泡生成素（FSH，批號(hào)MM-0555M1） 購(gòu)自江蘇科特生物技術(shù)有限公司；改良型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（貨號(hào)P0083）、BSA （貨號(hào)ST023）、一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)C1088） 購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；兔二步法免疫組化試劑盒（貨號(hào)PV-6001） 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Bax 抗體（貨號(hào)14796s） 購(gòu)自美國(guó)CST 公司；Bcl-2抗 體 （貨 號(hào) ab196495）、DAB 試劑盒 （貨 號(hào)ab64238） 購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.3 儀器 LEICARM2245 型半自動(dòng)切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；Tissue-TekVIP5Jr 自動(dòng)脫水機(jī)（日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會(huì)社）；MEIKOEC360 包埋機(jī)（德國(guó)Meiko 公司）；BA410 生物顯微鏡［麥克奧迪（廈門） 電氣股份有限公司］；Powerwave340 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）；AXIO SCOPE.A1 正置熒光顯微鏡（德國(guó)蔡司公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 通過(guò)陰道涂片法對(duì)60 只ICR 小鼠進(jìn)行動(dòng)情周期檢測(cè)，篩選得到56 只正常動(dòng)情周期ICR 小鼠用于正式實(shí)驗(yàn)，并將這56 只正常動(dòng)情周期ICR 小鼠，隨機(jī)分為正常組10 只、模型組10 只、陽(yáng)性組9 只、孕康口服液高劑量組9只，孕康口服液中劑量組9 只，孕康口服液低劑量組9 只。造模期間，除正常組外，其余各組灌胃給予40 mg／kg 雷公藤多苷溶液［14］，正常組灌胃給予生理鹽水，1 次／d。通過(guò)動(dòng)情周期變化，在第11周確認(rèn)造模成功后，開(kāi)始給藥，孕康口服液高、中、低劑量組為臨床等效劑量4、2、1 倍（36、18、9 mL／kg），陽(yáng)性組給藥劑量為臨床等效劑量（戊酸雌二醇0.15 mg／kg，連續(xù)4 d；用醋酸甲羥孕酮片1.5 mg／kg，僅1 d，停藥1 d，繼續(xù)按以上序貫方法用藥），連續(xù)給藥10 周。

2.2 動(dòng)情周期觀察 本實(shí)驗(yàn)觀察小鼠在不同給藥時(shí)間段的動(dòng)情周期變化，并以此來(lái)判斷是否有藥效。故將整個(gè)給藥過(guò)程分為3 個(gè)階段，給藥第1 階段為第1～2 周，給藥第2 階段為第4～5 周，給藥第3 階段為第9～10 周。每天早晨9 點(diǎn)對(duì)所有小鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，顯微鏡觀察脫落細(xì)胞形態(tài)。具體操作為用移液槍吸取150 μL生理鹽水，滴入小鼠陰道，反復(fù)抽吸3 次，將液體滴在載玻片上，蓋上蓋玻片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。判定標(biāo)準(zhǔn)為（1） 動(dòng)情前期，大量橢圓形有核上皮細(xì)胞，伴少量角化上皮細(xì)胞；（2） 動(dòng)情期，大量角化上皮細(xì)胞，呈落葉堆疊狀；（3）動(dòng)情后期，數(shù)量相近的角化上皮細(xì)胞、白細(xì)胞及有核上皮細(xì)胞；（4） 動(dòng)情間期，以白細(xì)胞為主，少量上皮細(xì)胞和黏液。

2.3 子宮和卵巢指數(shù)測(cè)定 末次給藥后，于動(dòng)情間期，眼眶取血，脫頸小鼠，取出完整子宮和雙側(cè)卵巢，用電子天平稱取子宮和雙側(cè)卵巢濕重后。卵巢指數(shù)＝ （臟器濕重／小鼠處死前體質(zhì)量） ×100%。

2.4 血清內(nèi)分泌激素水平檢測(cè) 末次給藥后，眼眶靜脈叢取血，37 ℃靜置0.5 h，3 500 r／min，離心10 min，吸取上清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELISA 法檢測(cè) 血清中E2、P、FSH、LH、PRL、AMH、INHB 水平。

2.5 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 將4%多聚甲醛固定的子宮和卵巢組織進(jìn)行脫水、包埋、切制4 μm 厚的石蠟切片后，進(jìn)行常規(guī)HE 染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)，并每組選取6 個(gè)切片，觀察卵巢中竇前卵泡、竇狀卵泡、排卵前卵泡、黃體和閉鎖卵泡數(shù)目。

2.6 卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況觀察 將卵巢組織石蠟切片脫蠟，梯度乙醇分化，滴加不含DNase 的蛋白酶K 37 ℃孵育30 min，PBS 洗滌后，滴加TUNEL 檢測(cè)液37 ℃避光孵育60 min，PBS 洗滌后，用抗熒光淬滅封片液封片后，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.7 卵巢顆粒細(xì)胞中Bcl-2、Bax 表達(dá)檢測(cè) 將卵巢組織石蠟切片脫蠟、梯度乙醇分化、微波抗原修復(fù)和3%過(guò)氧化氫處理后，5% BSA 37 ℃封閉1 h，滴加一抗Bcl-2 （1 ∶200）、Bax （1 ∶400），4 ℃過(guò)夜，PBS 洗滌后，滴加抗酶標(biāo)山羊抗兔IgG 聚合物37 ℃孵育30 min，PBS 洗滌后，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察拍照。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 孕康口服液對(duì)動(dòng)情周期的影響 正常小鼠動(dòng)情周期是1 個(gè)時(shí)間段，一般為5～6 d，一個(gè)完整的動(dòng)情周期表現(xiàn)為動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期的循環(huán)交替；而動(dòng)情周期不正常的小鼠，常表現(xiàn)為無(wú)動(dòng)情周期循環(huán)或動(dòng)情周期延長(zhǎng)。

與正常組比較，在整個(gè)給藥階段中，模型組動(dòng)情周期延長(zhǎng)的小鼠數(shù)量增加，平均動(dòng)情周期延長(zhǎng)（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，在整個(gè)給藥階段中，陽(yáng)性組動(dòng)情周期延長(zhǎng)的小鼠數(shù)量減少，平均動(dòng)情周期天數(shù)均縮短，其中給藥第1、3 階段，平均動(dòng)情周期天數(shù)縮短（P＜0.05）；給藥第2 階段，孕康口服液組動(dòng)情周期延長(zhǎng)的小鼠數(shù)量減少，平均動(dòng)情周期天數(shù)有縮短趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥第3 階段，孕康口服液高劑量組動(dòng)情周期延長(zhǎng)的小鼠數(shù)量減少，平均動(dòng)情周期天數(shù)縮短（P＜0.05）。見(jiàn)表1～2。

表1 孕康口服液對(duì)POI 模型小鼠動(dòng)情周期的影響（， n＝9～10）Tab.1 Effects of YKOL on estrous cycle of POI mouse models （， n＝9-10）

表1 孕康口服液對(duì)POI 模型小鼠動(dòng)情周期的影響（， n＝9～10）Tab.1 Effects of YKOL on estrous cycle of POI mouse models （， n＝9-10）

表2 孕康口服液對(duì)POI 模型小鼠平均動(dòng)情周期天數(shù)的影響（， n＝9～10）Tab.2 Effects of YKOL on average estrous cycle days of POI mouse models （， n＝9-10）

表2 孕康口服液對(duì)POI 模型小鼠平均動(dòng)情周期天數(shù)的影響（， n＝9～10）Tab.2 Effects of YKOL on average estrous cycle days of POI mouse models （， n＝9-10）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

3.2 孕康口服液對(duì)卵巢組織形態(tài)與各級(jí)卵泡數(shù)量的影響 與正常組比較，模型組顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，竇前卵泡、竇狀卵泡和黃體數(shù)量減少，閉鎖卵泡數(shù)量增加（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性組顆粒細(xì)胞層數(shù)增加，竇前卵泡和竇狀卵泡數(shù)量增加（P＜0.01）；孕康口服液高劑量組竇狀卵泡數(shù)量增加（P＜0.05）。孕康口服液各劑量組顆粒細(xì)胞層數(shù)增加，竇前卵泡、竇狀卵泡數(shù)量有增加趨勢(shì)，閉鎖卵泡數(shù)量有減少趨勢(shì)；孕康口服液高、中劑量組排卵前卵泡數(shù)量有增加趨勢(shì)，孕康口服液高、低劑量組黃體數(shù)量有增加趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1～2、表3。

3.3 孕康口服液對(duì)血清內(nèi)分泌激素水平的影響 與正常組比較，模型組血清E2、P、AMH 水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，孕康口服液高劑量組和陽(yáng)性組E2水平升高（P＜0.05），孕康口服液中劑量組和陽(yáng)性組AMH 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表4。

圖1 各組卵巢組織HE 染色（×40）Fig.1 HE staining of ovarian tissue in each group （×40）

圖2 各級(jí)卵泡HE 染色（×400）Fig.2 HE staining of follicular morphology at various levels （×400）

表3 孕康口服液對(duì)POI 模型小鼠各級(jí)卵泡數(shù)量的影響（， n＝6）Tab.3 Effects of YKOL on follicle number of POI mouse models （， n＝6）

表3 孕康口服液對(duì)POI 模型小鼠各級(jí)卵泡數(shù)量的影響（， n＝6）Tab.3 Effects of YKOL on follicle number of POI mouse models （， n＝6）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

表4 孕康口服液對(duì)POI 模型小鼠血清內(nèi)分泌激素水平的影響（， n＝9～10）Tab.4 Effects of YKOL on serum endocrine hormone levels of POI mouse models （， n＝9-10）

表4 孕康口服液對(duì)POI 模型小鼠血清內(nèi)分泌激素水平的影響（， n＝9～10）Tab.4 Effects of YKOL on serum endocrine hormone levels of POI mouse models （， n＝9-10）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.4 孕康口服液對(duì)子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響與正常組比較，模型組子宮指數(shù)與卵巢指數(shù)降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組子宮指數(shù)升高（P＜0.01），孕康口服液各劑量組子宮指數(shù)與卵巢指數(shù)有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表5。

表5 孕康口服液對(duì)POI 模型小鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響（， n＝9～10）Tab.5 Effects of YKOL on uterine and ovarian variables of POI mouse models （， n＝9-10）

表5 孕康口服液對(duì)POI 模型小鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)的影響（， n＝9～10）Tab.5 Effects of YKOL on uterine and ovarian variables of POI mouse models （， n＝9-10）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，##P＜0.01。

3.5 孕康口服液對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響 與正常組比較，模型組小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，Bcl-2 陽(yáng)性表達(dá)減少，Bax 陽(yáng)性表達(dá)增加。與模型組比較，孕康口服液各劑量組和陽(yáng)性組小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，Bcl-2 陽(yáng)性表達(dá)增多，Bax 陽(yáng)性表達(dá)減少。見(jiàn)圖3～5。

圖3 孕康口服液對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響（×400）Fig.3 Effects of YKOL on apoptosis of ovarian granulosa cells （×400）

4 討論

POI 是一種多病因所致的卵巢功能低下疾病，多數(shù)患者病因并不明確［15-16］。雷公藤多苷片常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腎病綜合征等疾病的同時(shí)，副作用也越來(lái)越引人注意，尤其是使用藥物過(guò)量引起的POI。臨床研究［17-18］表明，雷公藤多苷可導(dǎo)致POI，患者表現(xiàn)為月經(jīng)不調(diào)或閉經(jīng)，E2水平下降，F(xiàn)SH、LH 水平升高。同時(shí)現(xiàn)代藥理結(jié)果［19-20］表明，雷公藤多苷可制備POI 動(dòng)物模型，模型動(dòng)物出現(xiàn)動(dòng)情周期延長(zhǎng)或無(wú)動(dòng)情周期，各級(jí)卵泡數(shù)量減少，E2、P 等性激素水平紊亂，還能促使卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用雷公藤多苷制備POI 模型小鼠，結(jié)果顯示模型小鼠出現(xiàn)平均動(dòng)情周期延長(zhǎng)，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，竇前卵泡、竇狀卵泡和黃體數(shù)量減少，閉鎖卵泡數(shù)量增加，血清E2、P、AMH 水平降低，卵巢顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，提示造模成功。

圖5 孕康口服液對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞Bax 蛋白表達(dá)的影響（×400）Fig.5 Effects of YKOL on Bax protein expression in ovarian granulosa cells （×400）

西醫(yī)臨床上，POI 患者一般采用激素替代療法、贈(zèng)卵移植法、促排卵法、免疫抑制療法和基因療法。卵子捐贈(zèng)是患者實(shí)現(xiàn)懷孕的唯一可靠方法，但其存在一系列并發(fā)癥和倫理問(wèn)題，未得到有效應(yīng)用，故臨床上一般采用激素替代療法。激素替代療法目前常用于治療無(wú)生育要求的POI 患者，此法通過(guò)周期性補(bǔ)充雌孕激素，經(jīng)負(fù)反饋?zhàn)饔檬勾傩韵偌に厮浇档停瑥亩鴾p少卵泡受到的刺激，并協(xié)同體內(nèi)FSH 誘導(dǎo)卵泡顆粒細(xì)胞上的自身促性腺激素受體生成，使卵泡復(fù)蘇。但此法只能改善低雌激素引起的癥狀，并不能從根本上恢復(fù)卵巢正常的內(nèi)分泌功能，且停藥后易復(fù)發(fā)。有報(bào)道［21］表明，長(zhǎng)期用藥可加大中風(fēng)、心臟病、腿部及肺部栓塞的患病率，影響血糖、血脂、肝腎等功能，尤其是會(huì)增加患乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的患病率。因此，目前臨床上尚缺乏用于治療POI 的有效藥物。

中醫(yī)學(xué)將POI 歸為“經(jīng)閉” “血枯” “年未老經(jīng)水?dāng)唷?“不孕癥” 等范疇?！端貑?wèn)·上古天真論》載，“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長(zhǎng)；二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時(shí)下，故有子……；七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無(wú)子也”；《傅青主女科》 中論述，“經(jīng)水早斷，似乎腎水衰涸”。腎乃先天之本，主生殖，腎氣盛、天癸至、任通沖盛、胞宮定期藏泄，則月事以時(shí)下。腎藏精，腎中精氣為化血之源，若腎精虧損，則天癸不充，任沖氣血不足，胞脈失于濡養(yǎng)，致腎-天癸-沖任-胞宮軸功能紊亂，月經(jīng)不至。由此可見(jiàn)女子月經(jīng)不僅與腎中精氣有關(guān)，還與氣血的盈虧密切相關(guān)。故中醫(yī)認(rèn)為“腎虛精虧、血?？萁摺?為POI 的主要病因，并將補(bǔ)腎養(yǎng)血作為主要治則［22］。臨床研究［3-5］表明，補(bǔ)腎養(yǎng)血中藥能夠通過(guò)調(diào)節(jié)性激素，起到改善卵巢功能的作用。

孕康口服液由山藥、黃芪、當(dāng)歸、狗脊（去毛）、菟絲子、桑寄生、杜仲（炒）、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、黨參、茯苓、砂仁、白術(shù)（焦）、阿膠、苧麻根、地黃、山茱萸、枸杞子、烏梅、白芍、益智、黃芩、艾葉等23 味藥組成，其中續(xù)斷、桑寄生、杜仲、菟絲子和枸杞子等具有固腎納氣的功效；當(dāng)歸、芍藥、阿膠等可養(yǎng)血；黃芪、黨參、白術(shù)等具有健脾益氣的功效；諸藥合用，可達(dá)“補(bǔ)腎養(yǎng)血”的功效，臨床上能有效預(yù)防及治療流產(chǎn)［6-8］。本課題組前期研究［9-13］發(fā)現(xiàn)，采用腎虛型流產(chǎn)模型大鼠、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)模型小鼠以及LPS 誘導(dǎo)流產(chǎn)模型小鼠，孕康口服液能增加模型動(dòng)物的性激素水平，促使卵巢黃體化，維持卵泡正常發(fā)育。因此，基于孕康口服液“補(bǔ)腎養(yǎng)血” 的功效以及前期發(fā)現(xiàn)改善卵巢功能，推測(cè)其可能具有改善POI 的作用。本研究通過(guò)雷公藤多苷溶液灌胃成功建立POI 模型小鼠，觀察了孕康口服液對(duì)POI 小鼠的藥效作用。研究顯示，孕康口服液能明顯縮短POI 模型小鼠動(dòng)情周期，改善卵巢組織形態(tài)學(xué)并增加竇狀卵泡數(shù)量，表明孕康口服液具有改善雷公藤多苷所致POI 模型的作用。在明確藥效作用基礎(chǔ)上，還進(jìn)一步對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行了研究。

現(xiàn)代研究［23-24］表明，POI 與內(nèi)分泌激素之間有著密切的聯(lián)系。過(guò)高的LH 水平將引起卵母細(xì)胞的過(guò)早發(fā)育，但不成熟，導(dǎo)致卵泡閉縮或不排卵。異常（過(guò)高或過(guò)低） 的PRL 水平將引起黃體功能不全，卵泡中FSH 分泌不足，進(jìn)而導(dǎo)致卵泡發(fā)育不成熟。E2是由子宮和卵巢分泌的性激素，P 是由卵巢黃體細(xì)胞分泌，2 者的主要功能是促進(jìn)子宮、卵巢等性器官的發(fā)育成熟，同時(shí)E2能通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，降低高濃度的FSH 水平，從而調(diào)節(jié)卵泡的正常發(fā)育。AMH 是肽類生長(zhǎng)因子，最早在初級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞層表達(dá)，其濃度與發(fā)育卵泡數(shù)密切相關(guān)［25］。INHB 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B 超家族成員之一，其主要由卵巢竇卵泡顆粒細(xì)胞分泌，可反饋性地抑制FSH，對(duì)生殖功能具有調(diào)節(jié)作用［26-27］。由此可見(jiàn)，各種內(nèi)分泌激素的分泌水平與卵泡的發(fā)育或閉鎖密切相關(guān)。本研究顯示，孕康口服液能明顯升高POI 模型小鼠血清E2和AMH 水平，一定程度上可以降低FSH 和LH 水平，升高P 水平，對(duì)PRL 和INHB 無(wú)顯著影響。表明孕康口服液可以通過(guò)調(diào)節(jié)E2和AMH 等內(nèi)分泌激素，從而產(chǎn)生改善卵巢功能的作用。其中FSH、LH 水平未顯著下降的原因可能是在小鼠動(dòng)情間期取血，2 種激素水平表達(dá)較弱；對(duì)INHB 未有顯著影響的原因，可能是INHB較AMH 不敏感。

另有研究［28］表明，卵巢顆粒細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖、卵泡數(shù)目減少的主要原因。卵巢顆粒細(xì)胞為卵母細(xì)胞的成熟和減數(shù)分裂提供重要的營(yíng)養(yǎng)和信號(hào)；在一定條件下，卵巢顆粒細(xì)胞可以直接或間接地引起卵泡閉鎖加快，從而導(dǎo)致POI。Bcl-2 和Bax 屬于Bcl-2 家族，是參與顆粒細(xì)胞凋亡的重要因子，Bcl-2 具有抑制凋亡作用，Bax 具有促進(jìn)凋亡作用，Bax 的過(guò)度表達(dá)能拮抗Bcl-2 對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而促使細(xì)胞凋亡。TUNEL 檢測(cè)結(jié)果顯示，雷公藤多苷能引起卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，而孕康口服液能減少卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡；免疫組化結(jié)果顯示，雷公藤多苷能降低顆粒細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)，升高Bax 蛋白表達(dá)，而孕康口服液能升高顆粒細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)，降低Bax 蛋白表達(dá)。表明孕康口服液可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2 以及Bax 的蛋白表達(dá)，從而起到減少卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用。

因此，具有“補(bǔ)腎養(yǎng)血” 功效的孕康口服液對(duì)雷公藤多苷致早發(fā)性卵巢功能不全模型小鼠卵巢顆粒細(xì)胞具有改善作用，其機(jī)制可能是其能調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bax 的表達(dá)，繼而減少卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)E2和AMH 等內(nèi)分泌激素水平，從而增加卵巢竇狀卵泡，并改善卵巢功能。