王明煬 岳 琨 湛佳興 周 琦 劉慶陽(yáng) 徐凱智

華北理工大學(xué)研究生學(xué)院；

①附屬醫(yī)院腫瘤放化療科 河北唐山 063000；②應(yīng)急總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室與腎內(nèi)科；③唐山工人醫(yī)院麻醉科

黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥之一，常用作混合草藥煎劑中的免疫調(diào)節(jié)劑，用于治療感冒、腹瀉、疲勞、厭食和心臟病[1-2]。黃芪的藥理活性成分包括多種多糖、皂苷和黃酮類化合物[3]，目前對(duì)黃芪多糖(APS)藥理作用的研究最為廣泛，主要研究其免疫增強(qiáng)特性，如刺激小鼠免疫細(xì)胞增殖和體外細(xì)胞因子的產(chǎn)生[4]。除此之外，臨床研究還表明，APS可以減輕化療藥物的副作用，如可顯著降低癌癥患者骨髓抑制程度[5]。但是，APS在中樞免疫和非免疫器官中的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。據(jù)報(bào)道，膿毒癥被稱為手術(shù)中的頂級(jí)殺手之一，在過(guò)度炎癥反應(yīng)后會(huì)引起免疫麻痹，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞嚴(yán)重耗盡[6-9]。由于膿毒癥新定義的發(fā)展，說(shuō)明非免疫器官在敗血癥發(fā)病機(jī)制中的作用非常重要[9]。本研究旨在探討APS如何影響中樞免疫器官細(xì)胞和外周非免疫器官細(xì)胞以逆轉(zhuǎn)膿毒癥小鼠的免疫麻痹。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇6～8周齡、體質(zhì)量約20g的雄性BALB/c小鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物證號(hào)：SCKK(京)2014-004。在20℃～22℃、濕度(55±5)%的環(huán)境下分開(kāi)飼養(yǎng)一周，維持正常的晝夜規(guī)律，不限制攝入水和食物。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 培養(yǎng)皿、剪刀、離心機(jī)、細(xì)胞過(guò)濾器、流式細(xì)胞儀、超凈臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、黃芪多糖(批號(hào)021001B)、銅綠假單胞菌、膠原酶D 溶液、生物素化的小鼠樹(shù)突細(xì)胞富集混合物、RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100IU/ml和鏈霉素100IU/ml)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱?制備全層皮膚燒傷小鼠模型。小鼠腹部表面10%的燙傷，并在燒傷后1 天進(jìn)行銅綠假單胞菌腹膜內(nèi)注射(1×107CFU/ml)，將小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組和APS 低、中、高 劑 量 治 療 組(APS 40、100、250 mg/kg腹腔注射)，各10 只。自由進(jìn)食飲水，保持正常的晝夜節(jié)律變化，觀察各組小鼠在致死菌攻擊下的死亡率，分別在0、3、5、7天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲取骨髓和肝臟細(xì)胞，并觀察其數(shù)量變化。

1.2.2 獲取免疫細(xì)胞 使用25號(hào)針頭從小鼠的脛骨和股骨中吸出骨髓細(xì)胞。將肝臟和骨髓細(xì)胞的沉淀物重懸于PBS 1%牛血清白蛋白中，然后調(diào)節(jié)至1×106/ml，并通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選儀在明亮的綠色細(xì)胞上進(jìn)行分析。在2～3 mL RPMI 1640培養(yǎng)基中獲得外周血并用紅細(xì)胞溶素處理，離心后收集沉淀細(xì)胞。將分離的肝臟置于具有足夠膠原酶D 溶液的6c m培養(yǎng)皿中以完全覆蓋培養(yǎng)皿的底部。然后使用1 mL注射器和25G 針頭向肝臟注射膠原酶D溶液，將組織切成小塊。將肝臟置于膠原酶D溶液中37℃溫育30分鐘，將其輕輕地通過(guò)細(xì)胞過(guò)濾器。通過(guò)Ficoll Paque分離肝臟免疫細(xì)胞。

1.2.3 純化CD11c-CD45RBhigh DCs[10]采用小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞富集-DM 技術(shù)，在骨髓細(xì)胞和肝臟免疫細(xì)胞中陰性選擇DC。在純化的DCs中，使用生物素化抗小鼠CD11c單克隆抗體和I Mag 鏈霉親和素顆粒對(duì) CD11c-CD45RBhigh DCs進(jìn)行負(fù)選擇。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11c-細(xì)胞純度達(dá)95%以上。采用流式細(xì)胞儀(FACS Aria II)分離骨髓和肝臟CD11c-CD45RBhigh DCs。采用熒光活化細(xì)胞分選法(FACS)測(cè)定CD11c-CD45RBhigh DCs的純度為＞98%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析和處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料組間比較采用成組t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，數(shù)據(jù)用(ˉx±s)表示；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠死亡率比較 APS中、高劑量組與對(duì)照組相比死亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。APS高劑量組與中、低劑量組相比死亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由此可見(jiàn)APS能夠降低膿毒癥小鼠的死亡率，并且其保護(hù)作用與APS劑量呈正相關(guān)，見(jiàn)圖1。

圖1

2.2 骨髓細(xì)胞和肝臟細(xì)胞變化的比較

2.2.1 骨髓細(xì)胞比較 第3、5、7天：APS高、中劑量組與對(duì)照組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；APS高劑量組與低劑量組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.2.2 肝細(xì)胞比較 在第3、5、7天：APS高、中劑量組與對(duì)照組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；APS高劑量組與低劑量組相比細(xì)胞變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

骨髓和肝臟細(xì)胞中CD11c-CD45RBhigh DCs百分比在第3天與第7天變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

表1 骨髓中免疫細(xì)胞數(shù)量比較(ˉx±s，n=10)

圖2

3 討論

目前的研究已經(jīng)證實(shí)，APS對(duì)燒傷和感染引起的敗血癥小鼠有保護(hù)作用，可降低其死亡率。因此，我們?cè)噲D通過(guò)骨髓細(xì)胞增殖分化為CD11c-CD45RBhigh DCs突出免疫器官和非免疫器官之間的免疫協(xié)調(diào)，揭示APS通過(guò)其對(duì)免疫的影響治療燒傷后膿毒癥的機(jī)制。本研究注意到APS可以降低燒傷膿毒癥的死亡率(圖1)，并增加骨髓和肝細(xì)胞的數(shù)量(表1、2)。骨髓細(xì)胞負(fù)責(zé)外周免疫，樹(shù)突細(xì)胞(DCs)是專業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，專門用于捕獲、加工和轉(zhuǎn)運(yùn)抗原至淋巴器官，在淋巴器官中激活抗原特異性幼稚T 細(xì)胞[11]，DCs在控制適應(yīng)性免疫中也起重要作用[12]。最近有報(bào)道調(diào)節(jié)性DCs (CD11cdi mCD45RBhigh DCs/CD11c-CD45RBhigh DCs)通過(guò)負(fù)免疫調(diào)節(jié)誘導(dǎo)外周耐受[13]和免疫平衡的影響[14]。因此，在膿毒癥信號(hào)和APS刺激誘導(dǎo)的骨髓增殖和分化基礎(chǔ)上，闡明體內(nèi)CD11c-CD45RBhigh DCs在免疫器官和非免疫器官中變化的關(guān)鍵機(jī)制具有重要意義。

2016年Singer M 等[9]在JAMA 上提出了膿毒癥的新概念：即宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙，其高病死率和不易發(fā)現(xiàn)的多器官功能障礙綜合征(MODS)發(fā)病機(jī)制引導(dǎo)研究者關(guān)注于免疫器官，但是非免疫器官也不可忽視。根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，非免疫器官在免疫逆轉(zhuǎn)階段的功能似乎比垂死狀態(tài)更好。同時(shí)，免疫逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的膿毒癥小鼠可能通過(guò)CD11c-CD45RBhigh DC降低過(guò)度炎癥反應(yīng)，從而減少膿毒癥小鼠的死亡率。CD11c-CD45RBhigh DC 是DC 的 子 集，研 究 表 明，CD11c-CD45RBhigh DCs可以從存在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL)-10的骨髓細(xì)胞中提取，活化后分泌高水平的IL-10，在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)Treg1細(xì)胞的產(chǎn)生。與正常DC產(chǎn) 生 促 炎 性 細(xì) 胞 因 子 不 同，CD11c-CD45RBhigh DCs產(chǎn)生較少的促炎性細(xì)胞因子，而 是 優(yōu) 先 產(chǎn) 生IL-10[15]；而 CD11c-CD45RBhigh DCs中IL-12 的表達(dá)受到抑制。炎性細(xì)胞因子的增加可能加強(qiáng)病理改變并促進(jìn)肝功能衰竭的進(jìn)展[16]。膿毒癥小鼠CD11c-CD45RBhigh DCs的存在能明顯抑制炎癥因子的水平。此外，來(lái)自具有內(nèi)毒素耐受性的小鼠的CD11clowCD45RBhigh DC 比正常小鼠的CD11clowCD45RBhigh DC更有效地抑制肝臟炎癥[17]。

Mandragos E 等[18]在研究中得出結(jié)論：多發(fā)傷能提高患者的免疫力，對(duì)感染具有防護(hù)作用，并且認(rèn)為IL-10在其中起主導(dǎo)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素抵抗的C3 H/HeJ小鼠菌株也能抵抗出血性休克引起的死亡。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)單純的燒傷膿毒癥小鼠在后期免疫細(xì)胞也增加。所以我們認(rèn)為感染甚至是燒傷等物理?yè)p傷都能不同程度得引起機(jī)體免疫狀態(tài)的增強(qiáng)，以抵御機(jī)體受到二次攻擊。

綜上所述，我們認(rèn)為APS通過(guò)刺激骨髓細(xì)胞的增殖分化，增加骨髓以及肝臟中的CD11c-CD45RBhigh DCs來(lái)降低燒傷膿毒癥小鼠的死亡率。