劉震 徐玉鵬 趙忠祥 黃素芳 劉效朋 白艷梅 閻旭東

摘要：為研究不同年限苜蓿根際土壤細菌群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)變化，選取了0、4年苜蓿的根際土壤，采用高通量基因測序技術(shù)研究其細菌構(gòu)成。結(jié)果表明，4年苜蓿根際土壤中細菌分類單元（OTU）和多樣性指數(shù)高于0年苜蓿，苜蓿連作會改變細菌群落數(shù)量及結(jié)構(gòu)。通過主坐標分析（PCoA）及熱圖分析發(fā)現(xiàn)，不同年限苜蓿細菌群落差異性較大，連作后酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門細菌群落豐度提高，變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門細菌群落相對豐度降低。

關(guān)鍵詞：苜蓿;細菌群落;細菌分類單元;多樣性指數(shù);根際土壤;主坐標分析;熱圖分析;序列拼接;解釋度;高通量基因測序技術(shù)

中圖分類號： S154.38+1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0184-05

收稿日期：2019-03-19

基金項目：河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系草業(yè)創(chuàng)新團隊栽培與信息化管理技術(shù)崗位項目（編號：HBCT2018160202）;河北省重點研發(fā)計劃-奶業(yè)振興重大技術(shù)創(chuàng)新專項（編號：19226437D）。

作者簡介：劉?震（1985—），男，河北滄州人，碩士，助理研究員，主要從事作物栽培與施肥研究。Tel：（0317）2128657;E-mail：liuzhen84575151@163.com。

通信作者：閻旭東，碩士，研究員，主要從事作物栽培技術(shù)研究。Tel：（0317）2128657;E-mail：yxd7826@126.com。

苜蓿（Lotus corniculatus L.）為“牧草之王”，以產(chǎn)量高、品質(zhì)好、營養(yǎng)豐富和適應(yīng)性好而著稱[1]，在河北地區(qū)被選為“首選牧草”而被大力推廣[2]。同時，由于苜蓿的根瘤菌及其殘留在地下的須根系形成腐殖質(zhì)可以增加土壤有機質(zhì)，改善土壤團聚體結(jié)構(gòu)[3]，進一步影響土壤有機碳的分解，增強土壤碳吸附作用。因此，種植苜蓿常被作為改良貧瘠干旱地區(qū)土壤的方法之一。

目前，苜蓿栽培的研究方向主要集中于栽培措施對苜蓿產(chǎn)量及品質(zhì)的影響[4-7]，關(guān)于苜蓿連作后對土壤環(huán)境影響的研究較少。楊敏等研究發(fā)現(xiàn)，連作魔芋可以增加土壤細菌數(shù)量，減少真菌及放線菌數(shù)量，同時影響土壤蛋白酶、過氧化氫酶和脲酶活性[8]。張玥等通過對不同年限茶園進行比較發(fā)現(xiàn)，連作后土壤pH值顯著降低，土壤中優(yōu)勢菌種發(fā)生變化，茶園根際土壤肥力提高[9]，說明土壤作為一個復雜的環(huán)境，其中存在的微生物及土壤酶等均參與了土壤中養(yǎng)分形成、發(fā)育及循環(huán)[10]。細菌群落在植物-土壤生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)中扮演著重要角色[11]。但苜蓿連作后對土壤細菌群落構(gòu)成的影響如何，尚須進一步研究。

本研究利用滄州市農(nóng)林科學院苜蓿長期試驗，探討連作不同年限苜蓿根際細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性差異，探索連作苜蓿對土壤細菌群落的影響，明確苜蓿對土壤生態(tài)環(huán)境的影響，為苜蓿改良土壤、牧草產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供科學依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗設(shè)計及樣品采集

試驗土壤選擇0年苜蓿土壤作為對照（Y0，未種植過苜蓿的土壤，重復序號為M01、M02、M03）和4年苜蓿土壤（Y4，4年生苜蓿土壤，重復序號為M04、M05、M06）作為研究對象，田間按照正常管理措施進行。

采樣地點位于滄州市農(nóng)林科學院試驗基地（116.36°E、38.31°N），選擇“五點法”取樣。各采樣點內(nèi)選取生長良好的苜蓿樣品，去除其周邊及表層雜草后，取耕層0～20 cm苜蓿根際土壤約50 g作為1個采樣點，待5個采樣點全部取完后充分混勻，采用四分法選取混合均勻后土壤樣品保存為1份土壤待測樣品，每個處理設(shè)3次重復。將待測樣品裝入無菌密封袋，放入裝有干冰的泡沫箱中保存。待全部樣品采集完成后運回實驗室，超低溫冰箱-80 ℃ 保存。

1.2?土壤樣品DNA提取及測序

將土壤提取基因組后采用NanoDrop-ND1000測定總DNA濃度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA提取質(zhì)量。用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）[12]和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[13]擴增細菌16S rDNA基因 V3～V4 區(qū)域，回收PCR產(chǎn)物并測定濃度，將不同重復間多個樣品混勻。測序工作由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.3?序列拼接及信息分析

使用 FLASH v1.2.7軟件，通過重疊（overlap）對每個樣品的堿基序列進行拼接，得到的拼接序列即原始序列數(shù)據(jù)后，再使用 Trimmomatic v0.33軟件，對拼接得到的原始序列進行過濾，得到高質(zhì)量的重疊數(shù)據(jù)，最后使用 UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效序列（effective tags）。根據(jù)得出的有效序列進行信息分析。

1.4?細菌群落多樣性及結(jié)構(gòu)分析

采用Chao 指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、ACE指數(shù)、辛普森指數(shù)及覆蓋度表示細菌群落物種的豐富程度及測序深度。同時利用優(yōu)化后的有效序列同細菌數(shù)據(jù)庫進行比對，鑒定細菌種類，確定細菌歸屬，并進一步比較苜蓿土壤中不同水平下細菌群落構(gòu)成狀況。

2?結(jié)果與分析

2.1?連作苜蓿根際土壤細菌群落基因序列數(shù)據(jù)分析

樣品經(jīng)高通量測序后，經(jīng)過雙端堿基序列拼接、過濾后共產(chǎn)生 338 043 條有效序列。對照處理獲得 54 534 條平均有效序列，連作苜蓿處理獲得56 349條平均有效序列，其余序列數(shù)據(jù)見表1。

從樣本中隨機抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計這些序列所代表的物種數(shù)目，以序列數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建曲線。由圖1可知，各樣本間稀釋曲線平滑，表示測序數(shù)據(jù)結(jié)果合理，M01、M02、M03稀釋曲線斜率及位置低于M04、M05、M06，說明對照處理能檢測出的分類單元（OTU）數(shù)量少于連作苜蓿處理，可見連作苜蓿后可以增加根際土壤中細菌群落種類。

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