林彥均 楊天燕 朱嵐倩 鄭亦佳 王瑩瑩 斯舒謹 郭澤豪

摘要：為了開展龍頭魚遺傳多樣性和近緣物種間的遺傳變異分析，建立龍頭魚的簡單序列重復區(qū)間標記（inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR）-PCR反應(yīng)體系，擬篩選龍頭魚ISSR-PCR多態(tài)性引物的最佳退火溫度。參考加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的100條ISSR引物，采用溫度梯度PCR的方法，得到適用于龍頭魚基因組DNA擴增的12條ISSR分子標記引物，分別為811、834、836、840、841、842、844、853、873、880、881、899。12條引物中，最高退火溫度為58.9 ℃，最低退火溫度為47 ℃，兩者間的差異達到了11.9 ℃。12條引物的變異系數(shù)為7.71%，相關(guān)系數(shù)為0.23。結(jié)果表明，龍頭魚ISSR多態(tài)性引物的最佳退火溫度與理論退火溫度間沒有顯著相關(guān)性，同一種引物的退火溫度在不同物種中也存在一定的差異，需要通過溫度梯度試驗進行具體分析。

關(guān)鍵詞：龍頭魚;ISSR-PCR;退火溫度;引物篩選

中圖分類號： S917文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0070-04

收稿日期：2019-03-17

基金項目：2018年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（編號：201810340010）;浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃（編號：2019R411013）;浙江海洋大學人才引進科研基金（2016-2017）;浙江省一流學科（A類）大學生創(chuàng)新性科研項目（編號：11034060216）。

作者簡介：林彥均（1998—），女，福建寧德人，主要從事海洋資源與環(huán)境研究。E-mail：esperzione@163.com。

通信作者：楊天燕，博士，高級工程師，主要從事魚類種群遺傳學研究。E-mail：hellojelly1130@163.com。

龍頭魚[Harpadon nehereus （Hamilton，1822）]俗稱狗母魚、豆腐魚、鼻涕魚等，是海洋近岸或河口區(qū)常見的底層中小型經(jīng)濟魚類，我國黃海南部、東海和南海均產(chǎn)之，龍頭魚尤其喜歡棲息于泥沙底質(zhì)的環(huán)境中，具有較強的溫度和鹽度適應(yīng)性[1]。龍頭魚肉質(zhì)松軟、營養(yǎng)豐富、鮮食美味，其干制品“龍頭烤”更是倍受消費者喜愛。近年來，由于過度捕撈和環(huán)境污染等因素的影響，導致東海區(qū)資源結(jié)構(gòu)及魚類種群分布發(fā)生改變[2-3]。傳統(tǒng)經(jīng)濟物種資源的衰退，使得龍頭魚等中小型經(jīng)濟魚類的產(chǎn)量呈逐年上升的趨勢，逐漸在我國東海和南海漁業(yè)中占據(jù)重要地位。目前，龍頭魚已經(jīng)成為江浙沿海張網(wǎng)漁獲物中數(shù)量較大的優(yōu)勢種類之一，多年來的漁業(yè)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，龍頭魚資源數(shù)量穩(wěn)定，具有較好的開發(fā)前景和潛力[4]。為了保護和合理開發(fā)利用這一重要漁業(yè)資源，避免出現(xiàn)種質(zhì)資源的衰退和低齡化、小型化現(xiàn)象，需要對龍頭魚種群結(jié)構(gòu)和遺傳現(xiàn)狀進行調(diào)查研究。目前，國內(nèi)外針對龍頭魚遺傳學方面的研究不多，主要集中在其線粒體DNA全序列的擴增測定、微衛(wèi)星（microsatellite）和序列相關(guān)擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP）分子標記的開發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域[5-7]。

簡單序列重復區(qū)間標記（inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR）是Zietkeiwitcz等于1994年在簡單重復序列（simple sequence repeats，簡稱SSR）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型分子標記技術(shù)，該技術(shù)是利用包含微衛(wèi)星重復序列并在3′或5′端錨定的寡聚核苷酸引物對基因組DNA進行PCR擴增的標記系統(tǒng)[8]。ISSR標記技術(shù)具有成本較低、操作簡單、快速靈敏、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性較高等系列優(yōu)點[9]，被認為是集合了隨機擴增多態(tài)性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）技術(shù)和SSR技術(shù)二者優(yōu)勢的一種新型分子標記技術(shù)。目前，ISSR己在多種動植物的種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性檢測、基因定位、遺傳多樣性親緣關(guān)系分析和遺傳圖譜構(gòu)建等研究方面得到廣泛應(yīng)用[10-11]。

退火溫度（annealing temperature）是PCR反應(yīng)過程中不可缺少的組成部分，也是決定ISSR試驗成功與否的重要因素之一[12-13]。一般而言，人工設(shè)計的低于20個堿基的ISSR-PCR引物，可以根據(jù)DNA熔解溫度（Tm）計算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）[14]計算得出最佳退火溫度。但是在實際操作中，由于受到緩沖液、引物和DNA模板濃度等因素的影響，該溫度往往不能保證PCR擴增的有效性。因此，合理設(shè)計ISSR-PCR退火溫度，對于節(jié)約試驗成本、提高試驗效率具有重要意義。本研究開展了龍頭魚ISSR-PCR多態(tài)性引物退火溫度的篩選，試驗結(jié)果以期為進一步研究龍頭魚遺傳多樣性和近緣物種間的遺傳變異分析奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?樣本采集和DNA提取

本研究所用龍頭魚樣本于2018年10月采集自浙江舟山沿海，剪取新鮮龍頭魚背部肌肉組織并將其浸泡于無水乙醇中，于-20 ℃冰箱冷凍保存。參考《分子克隆實驗指南（第四版）》中的相關(guān)操作要求，采用傳統(tǒng)的Tris平衡酚-三氯甲烷法提取基因組DNA[15]，將自然風干的30 ng DNA溶解于 100 μL滅菌水中，并于4 ℃保存。使用分光光度計測定波長為260、280 nm處的吸光度比值D260 nm/280 nm以估算基因組DNA的純度和濃度，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳（電壓為8～10 V/cm）檢測DNA的提取效果，綜合選擇提取效果較好的DNA作為PCR擴增的模板。

1.2?引物序列和退火溫度的設(shè)定

依據(jù)加拿大哥倫比亞大學（University of British Columbia，簡稱UBC）公布的約100條ISSR引物，并參考海水魚類中具有較好擴增多態(tài)性的引物，采用溫度梯度PCR的方法，篩選出適合龍頭魚的、有較高分辨率和特異性的12條ISSR引物（表1），從而建立具有最佳退火溫度的ISSR-PCR反應(yīng)體系。

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