張?chǎng)危?孫方丹， 宋雨陽(yáng)， 金鐵巖

( 延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 吉林 延吉 133002 )

青楷槭(AcertegmeutosumMaxim)屬于槭樹(shù)科、落葉喬木[1]，主要產(chǎn)于中國(guó)長(zhǎng)白山和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)[2].青楷槭在民間常被用于治療創(chuàng)傷性出血、膿腫、皮炎等[3-4].目前，從青楷槭中已分離出多種具有生物活性的成分，如黃酮、木質(zhì)素等[5-8].研究表明，黃酮類(lèi)化合物對(duì)由酒精引起的肝損傷具有保護(hù)作用[9].目前為止，未見(jiàn)有關(guān)青楷槭皮熱水提取物的抗氧化性和抗菌性的報(bào)道.基于此，本文研究青楷槭皮熱水提取物的抗氧化性和抗菌性，為開(kāi)發(fā)和利用青楷槭皮提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青楷槭采集于琿春市密江鎮(zhèn)下洼子村，由延邊大學(xué)張華老師鑒定；福林試劑、蘆丁、單寧酸、抗壞血酸(Vc)、DPPH、ABTS，上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；過(guò)硫酸鉀、氯化鐵、碳酸鈉、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、三氯乙酸、乙酸乙酯、石油醚、二甲基亞砜(DMSO)均為分析純，科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn).

1.2 儀器與設(shè)備

U-3900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日立天美公司； QFST-250SQ索式提取儀，浙江普托儀器有限公司； KDN-08A凱式定氮儀，上海明嘉電子有限公司； MA45紅外水分測(cè)定儀，深圳市分析儀器制造有限公司； SH-1000酶標(biāo)儀，天美科技有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)菌及培養(yǎng)基

Staphylococcusaureus(金黃色葡萄球菌)4220；Streptococcusmutans(變形鏈球菌)3289；Escherichiacoli(大腸桿菌)1924； MHB肉湯培養(yǎng)基； BHI腦心浸出液培養(yǎng)基.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1青楷槭皮熱水提取物的制備 將青楷槭皮粉碎，過(guò)孔徑180 μm篩.取青楷槭皮粉200 g，按1∶10料液比，于95 ℃下水浴加熱6 h，冷卻過(guò)濾.

1.4.2總酚含量的測(cè)定 采用福林酚法[10]測(cè)定總酚含量.稱(chēng)取0.1 g青楷槭皮粉末，制成1 mg/mL的樣品溶液.吸取2 mL樣品溶液于試管中，加入2 mL 10%福林試劑，充分搖勻后加入1.6 mL 7.5%碳酸鈉溶液，搖勻靜置0.5 h后于750 nm處測(cè)定溶液的吸光度，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算總酚的含量.

1.4.3總黃酮含量的測(cè)定 采用紫外分光光度法[11]測(cè)定總黃酮的含量.吸取4 mL樣品溶液(1 mg/mL)于試管中，依次加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液和0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min后加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，用水加至10 mL，搖勻靜置10 min后于510 nm處測(cè)量溶液的吸光度，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算總黃酮的含量.

1.4.4DPPH清除率的測(cè)定 稱(chēng)取0.003 9 g DPPH，用無(wú)水乙醇溶解后轉(zhuǎn)移入100 mL棕色容量瓶，定容后制得1×10-4mol DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，在4 ℃下避光保存.配制0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/mL的樣品溶液，然后取4 mL不同濃度的樣品溶液，分別加入4 mL DPPH，混勻，避光放置0.5 h.用紫外分光光度計(jì)于517 nm處測(cè)量溶液的吸光度Ai， 同時(shí)測(cè)量4 mL無(wú)水乙醇與4 mL樣品混合液的吸光度Aj以及4 mL DPPH與4 mL無(wú)水乙醇混合液的吸光度Ac.DPPH自由基清除率(CLDPPH)的計(jì)算公式為

CLDPPH=(Ai-Aj)/Ac×100%.

(1)

1.4.5ABTS清除率的測(cè)定 取0.2 mL 7.4×10-3mol/L ABTS 置于試管中，加入2.6×10-3mol/L過(guò)硫酸鉀0.2 mL，均勻混合，在室溫下黑暗靜置12 h后用無(wú)水乙醇稀釋50倍即制得ABTS工作液(在734 nm下ABTS工作液的吸光度A=0.7±0.02).配制0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/mL的樣品溶液.取2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，加入8 mL ABTS工作液，搖勻靜置6 min后于517 nm處測(cè)定其吸光度Ai； 再用水替換空白組的樣品溶液，測(cè)定其吸光度A0.ABTS自由基清除率(CLABTS)的計(jì)算公式為

CLABTS=(A0-Ai)/A0×100%.

(2)

1.4.6鐵離子還原能力的測(cè)定 取磷酸二氫鈉1.74 g、磷酸氫二鈉2.7 g、氯化鈉1.7 g，定容成400 mL溶液，得到磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)；稱(chēng)取1 g鐵氰化鉀溶于99 g水中，制得0.1%的鐵氰化鉀溶液.配制0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/mL的樣品溶液.取5 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，加入5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和5 mL 0.1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴0.5 h后加入5 mL 10%三氯乙酸溶液，離心10 min.取5 mL上層清液，加5 mL水和1 mL 0.1%氯化鐵溶液，反應(yīng)10 min后于700 nm處測(cè)量溶液的吸光度，Vc作為對(duì)照.

1.4.7抗菌活性的測(cè)定 將2 g青楷槭皮熱水提取物溶解在水中，用等體積的石油醚和乙酸乙酯萃取3次，得到石油醚層、乙酸乙酯層和水層浸膏，然后分別用相應(yīng)體積的DMSO溶解.將100 μL培養(yǎng)液加入無(wú)菌96孔板中，通過(guò)雙倍連續(xù)稀釋法[12]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并建立空白對(duì)照組.用酶標(biāo)儀在650 nm處測(cè)量96孔板加入細(xì)菌后的吸光度，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值為A′1， 空白對(duì)照組的吸光度值為A′0.將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，再次測(cè)定實(shí)驗(yàn)組的吸光度值A(chǔ)1和空白對(duì)照組的吸光度值A(chǔ)0.抑菌率(IR)的計(jì)算公式為

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 青楷槭皮總酚和總黃酮含量

圖1為蘆丁和單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線.由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)物溶液濃度與吸光度值之間具有線性相關(guān).單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 1x+0.027 2，R2= 0.995 3； 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001x-0.003 2，R2=0.999 6.根據(jù)方程計(jì)算得青楷槭皮熱水提取物的總酚和總黃酮含量分別為(289.02±5.72) mg/g， (33.56±3.32) mg/g.

圖1 蘆丁和單寧酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 青楷槭皮熱水提取物的DPPH清除能力

圖2為青楷槭皮熱水提取物的DPPH清除率.由圖2可以看出，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，提取物的DPPH清除率隨提取物濃度的增加而增加，說(shuō)明青楷槭皮熱水提取物的DPPH清除率與提取物濃度之間存在良好的量效關(guān)系.當(dāng)濃度范圍在0.01～0.5 mg/mL時(shí)，提取物對(duì)DPPH的清除率顯著低于相同濃度的Vc；當(dāng)濃度大于0.05 mg/mL時(shí)，提取物對(duì)DPPH的清除率與Vc接近.

圖2 青楷槭皮熱水提取物的DPPH清除率

2.3 青楷槭皮熱水提取物的ABTS清除能力

圖3為青楷槭皮熱水提取物的ABTS清除率.由圖3可以看出，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，青楷槭皮熱水提取物對(duì)ABTS的清除率與Vc接近.當(dāng)提取物濃度超過(guò)0.1 mg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS的清除率達(dá)到94.76%，高于青楷槭樹(shù)葉提取物對(duì)ABTS的清除率(最高清除率為93.84%)[13].

圖3 青楷槭皮熱水提取物的ABTS清除率

2.4 青楷槭皮熱水提取物對(duì)鐵離子的還原能力

圖4為青楷槭皮熱水提取物對(duì)鐵離子的還原能力.由圖4可以看出，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，隨著提取物濃度的增加，其對(duì)鐵離子的還原力逐漸增加，但其還原能力略低于Vc.當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，鐵離子還原力的吸光值達(dá)到最高，為2.60.

圖4 青楷槭皮熱水提取物的鐵離子還原能力

2.5 青楷槭皮熱水提取物的抗菌活性

表1為青楷槭皮熱水提取物對(duì)不同細(xì)菌的MIC.由表1可知，提取物的石油醚層對(duì)變形鏈球菌(3289)、金黃色葡萄球菌(4220)、大腸桿菌(1924)均無(wú)抗菌活性，提取物的乙酸乙酯和水層對(duì)大腸桿菌(1924)有抗菌活性，其MIC分別為128 μg/mL和16 μg/mL，但對(duì)變形鏈球菌(3289)、金黃色葡萄球菌(4220)沒(méi)有抗菌活性.該結(jié)果與PARK等[14]的研究結(jié)果一致.

表1 青楷槭皮熱水提取物對(duì)不同細(xì)菌的MICμg/mL

注： >256為無(wú)抗菌活性.

3 結(jié)論

本文研究表明，青楷槭皮熱水提取物中的總酚和總黃酮含量分別為(289.02±5.72) mg/g，(33.56±3.32) mg/g.青楷槭皮熱水提取物具有很好的抗氧化性，且其抗氧化性與提取物濃度呈明顯的量效關(guān)系.青楷槭皮熱水提取物對(duì)變形鏈球菌(3289)、金黃色葡萄球菌(4220)沒(méi)有抗菌活性，而其乙酸乙酯層和水層對(duì)大腸桿菌(1924)有抗菌性，MIC分別為128 μg/mL和16 μg/mL.本文研究結(jié)果可為進(jìn)一步分離和純化青楷槭皮中的抗氧化和抗菌性物質(zhì)，以及開(kāi)發(fā)利用青楷槭皮提供理論依據(jù).