劉爽爽 劉東超 孫凡越 李德海* 王占斌

(1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040； 2.黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

膽酸鹽是膽汁中由膽固醇衍生而來的具有甾核結(jié)構(gòu)的大分子，對(duì)膽固醇和脂肪的消化吸收起重要作用。因此將膽酸鹽排出體外可降低膽酸鹽在肝腸循環(huán)過程中的積累，促進(jìn)膽固醇的代謝，達(dá)到降血脂的目的[1]。辛伐他汀可以通過吸收膽酸鹽來降低高血脂癥，但長(zhǎng)時(shí)間服用會(huì)有損害肝腎、血糖升高等副作用[2]。因此，開發(fā)有效降低血脂的天然功能性成分藥物成為熱點(diǎn)。已有研究表明三萜類化合物是一類有較好降血脂作用的天然產(chǎn)物，具有開發(fā)和應(yīng)用前景[3]。

粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)屬于擔(dān)子菌亞門，主要分布在東北和新疆地區(qū)，是一種具有降血脂、抗氧化等生物活性的藥用真菌[4]，常被用于降三高以及治療消化不良、癌癥等疾病[5]。三萜類化合物是粗毛纖孔菌產(chǎn)生的主要生物活性成分之一，藥理試驗(yàn)證明，其具有抗癌、抗病毒、降血脂等多種功能[6]。三萜類化合物提取過程中含有糖，脂類等雜質(zhì)，影響了其純度和生物活性[7]。為了提高三萜類化合物的純度，不少學(xué)者致力于三萜類化合物的純化。王亞紅等[8]采用大孔樹脂來提高瓦松總?cè)频募兌龋側(cè)坪靠梢赃_(dá)到40.56%。蘇永昌等[9]采用分段沉淀法來提高海參三萜皂苷的純度。大孔樹脂雖然具有吸附性強(qiáng)，解吸條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，但其分離純度差，不利于總?cè)萍兌鹊奶岣遊10]。分段沉淀法雖然操作簡(jiǎn)便，但難將皂苷分離完全[11]。萃取可以利用有機(jī)溶劑與三萜的相似相溶原理，將極性相似的總?cè)迫芙庠谟袡C(jī)溶劑中，從而提高總?cè)频募兌取９枘z可以利用其表面硅醇基較強(qiáng)的吸附作用來提高總?cè)频募兌萚12]。為了獲得高純度的粗毛纖孔菌總?cè)疲驹囼?yàn)擬以粗毛纖孔菌子實(shí)體及菌絲體為原材料，采用有機(jī)溶劑萃取與硅膠純化聯(lián)用的方法，分析有機(jī)溶劑種類、高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)、上樣量和硅膠量質(zhì)量比、洗脫體系、洗脫劑比例對(duì)粗毛纖孔菌總?cè)萍兌鹊挠绊?。同時(shí)利用紅外光譜分析經(jīng)萃取和硅膠純化后的粗毛纖孔菌菌絲體和子實(shí)體總?cè)平Y(jié)構(gòu)，進(jìn)一步通過體外模擬體內(nèi)環(huán)境試驗(yàn)研究了粗提物和純化物總?cè)频捏w外膽酸鹽結(jié)合能力，為選擇粗毛纖孔菌三萜類化合物高效純化方法和降血脂藥物研發(fā)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年9月在東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)的水曲柳上采集粗毛纖孔菌子實(shí)體，將其置于42 ℃烘箱中烘干，用小型粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，收集篩下物，備用。

粗毛纖孔菌東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，獲得菌絲體，將其置于42 ℃烘箱中烘干，用小型粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，收集篩下物，備用。

1.2 試劑及設(shè)備

氯仿、甲醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；香草醛(Sigma 公司)；柱層析硅膠(精制型)200～300 目(青島海洋化工)；大孔樹脂D101(東鴻化工有限公司)；膽酸鈉(北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠)；牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉(上海源葉生物技術(shù)有限公司)。

722 紫外分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器公司)；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；硅膠層析柱50×Φ2.2 cm(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；IS10 傅立葉變換型紅外光譜儀(Thermo Fisher)。

1.3 方法

1.3.1粗毛纖孔菌總?cè)频妮腿?/p>

稱取600 g粗毛纖孔菌子實(shí)體和200 g菌絲體粉末，加入72%的乙醇，在超聲功率210 W輔助下萃取31 min后室溫浸提24 h，反復(fù)萃取5 次。合并5 次萃取液在45 ℃下旋蒸，然后在42 ℃烘箱中烘干備用。將樣品烘干后懸浮在H2O中，然后分別用相同體積的乙酸乙酯和正丁醇在室溫下萃取24 h。反復(fù)2 次，合并2 次萃取物，旋蒸后烘干，得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，備用。

1.3.2粗毛纖孔菌總?cè)乒枘z純化工藝比較

1)高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)、上樣量和硅膠量質(zhì)量比的篩選：準(zhǔn)確取4 mL子實(shí)體粗提物，按一定高徑比(25∶22、40∶22、55∶22、70∶22、85∶22)、上樣量和硅膠量質(zhì)量比(1∶80、2∶80、3∶80、4∶80、5∶80)條件下，以V氯仿∶V甲醇=1∶1為洗脫劑，在流速1 mL/min下進(jìn)行洗脫。每10 mL一管收集樣品，每管樣品中總?cè)坪康挠?jì)算公式為：

(1)

式中：Y為OD值。

2)洗脫體系和洗脫劑體積比的篩選：準(zhǔn)確取 4 mL 菌絲體和子實(shí)體乙酸乙酯萃取物，在篩選得到的最佳高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)、上樣量和硅膠量質(zhì)量比前提下按一定的洗脫體系(氯仿∶甲醇、丙酮∶石油醚、乙酸乙酯∶丙酮)和洗脫劑體積比(1∶1、2∶1、3∶1、5∶1、1∶2)在流速為 1 mL/min 的條件下進(jìn)行洗脫。根據(jù)上述方法進(jìn)行樣品的收集，通過數(shù)據(jù)分析篩選出最佳的洗脫體系和洗脫劑比例。

3)洗脫樣品的處理和測(cè)定：參照文獻(xiàn)[13]利用香草醛-冰乙酸-高氯酸分光光度比色法測(cè)定總?cè)频姆椒ú⑸宰餍薷?，具體方法如下：每管樣品吸取0.05 mL分別置于5 mL 容量瓶中，在100 ℃水浴蒸干后加入0.20 mL新制的5%香草醛-冰乙酸溶液和0.80 mL高氯酸，搖勻后放入溫度為70 ℃的水浴鍋中反應(yīng)15 min后，常溫下放置3～5 min，再加入乙酸乙酯定量到5 mL搖勻，用不加樣品的溶液做空白對(duì)照，采用分光光度計(jì)測(cè)定樣品在551 nm處測(cè)定吸光度(OD值)。根據(jù)公式(1)計(jì)算各管中樣品的總?cè)坪?，繪制洗脫曲線。

將所有收集的樣品混合旋蒸后于42 ℃烘箱中烘干，然后稱取0.03 g溶解于10 mL無水乙醇中，從中吸取0.05 mL置于5 mL 容量瓶中，根據(jù)上述方法測(cè)定三萜含量?？?cè)频寐屎图兌鹊挠?jì)算公式為：

(2)

式中：B1為柱層析后總?cè)坪浚琺g；B2總?cè)坪?，mg。

(3)

式中：C1為柱層析后總?cè)瀑|(zhì)量，mg；C2為柱層析后總樣品質(zhì)量，mg。

4)不同純化方法的比較：分別用的硅膠純化法[14]和大孔樹脂吸附法[15]對(duì)粗毛纖孔菌菌絲體和子實(shí)體原料進(jìn)行純化，將純化得到的樣品按照上述方法進(jìn)行總?cè)萍兌鹊臏y(cè)定。

1.3.3粗毛纖孔菌總?cè)频募t外光譜分析

參照參考文獻(xiàn)[16]的方法，利用傅立葉變換型紅外光譜儀，以溴化鉀為背景，采用溴化鉀壓片法在500～4 000/cm-1掃描經(jīng)乙酸乙酯萃取和硅膠純化后的菌絲體和子實(shí)體總?cè)瞥煞?。通過數(shù)據(jù)分析粗毛纖孔菌菌絲體和子實(shí)體的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)。

1.3.4粗毛纖孔菌總?cè)企w外膽酸鹽結(jié)合能力檢測(cè)

參照文獻(xiàn)劉榮等[17]利用分光光度計(jì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法并稍作修改, 具體方法如下：分別取2 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(甘氨膽酸鈉0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mmol/L，?；悄懰徕c0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mmol/L，膽酸鈉0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mmol/L)于具塞試管中，加入6 mL 60%的H2SO4于70 ℃水浴20 min，取出冰浴5 min，采用分光光度計(jì)測(cè)定樣品在387 nm處測(cè)定吸光度，最后，以膽酸鹽濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參照參考文獻(xiàn)[17]體外模擬體內(nèi)環(huán)境測(cè)定膽酸鹽結(jié)合能力的方法并稍作修改，具體方法如下：分別移取1 mL樣品(菌絲體粗提總?cè)啤⒆訉?shí)體粗提總?cè)?、菌絲體純化后總?cè)?、子?shí)體純化后總?cè)?，加入1 mL(10 mg/mL)胃蛋白酶，3 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，在37 ℃恒溫振蕩消化1 h，以 0.10 mol/L 的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.30，隨后加入4 mL(10 mg/mL)胰蛋白酶，在37 ℃恒溫振蕩消化1 h，最后加入4 mL(1 mmol/L)膽酸鹽消化1 h，400 0 r/min離心20 min，對(duì)上清液中的膽酸鹽進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)中的測(cè)試均平行檢測(cè)3次。基礎(chǔ)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Excel 軟件，圖表均采用Origin 9.0處理完成，顯著性分析采用SPSS 21.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗毛纖孔菌總?cè)频妮腿?/h3>

比較不同萃取劑對(duì)總?cè)坪康挠绊懀Y(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯和正丁醇萃取后菌絲體和子實(shí)體粗提總?cè)频募兌鹊玫矫黠@提高(表1)：600 g粗毛纖孔菌子實(shí)體在72%乙醇提取下可得到總?cè)萍兌葹?.20%的粗提物86.19 g(留4 g備用)。乙酸乙酯和正丁醇萃取后總?cè)萍兌鹊玫斤@著提高，其中乙酸乙酯萃取后純度可以達(dá)到32.70%，是子實(shí)體粗提物的3.55 倍，正丁醇萃取后純度達(dá)到了13.07%，是子實(shí)體粗提物的1.42 倍。200 g粗毛纖孔菌菌絲體在72%乙醇提取下可得到純度為15.33%的粗提物35 g(留1 g備用)。乙酸乙酯萃取后純度可達(dá)到46.70%，是菌絲體粗提物的3.04 倍，正丁醇萃取后純度可達(dá)到18.16%，是菌絲體粗提物的1.18倍。

表1 不同萃取劑對(duì)粗毛纖孔菌總?cè)坪康挠绊慣able 1 Effect of different solvents on the content of total triterpenoids from Inonotus hispidus

注：同行不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。不同萃取劑萃取純度之間的差異用a、b表示。同列不同大寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。菌絲體和子實(shí)體純度之間的差異用C、D表示。

Note： Different small letters within same raw indicate significant differences (P<0.05). Purity differences among different solvents are represented by a and b. Different capital letters within same column indicate significant differences (P<0.05). Purity differences between fruiting body and mycelium are represented by C and D.

2.2 硅膠柱層析分離條件對(duì)粗毛纖孔菌總?cè)萍兌鹊挠绊?/h3>

2.2.1不同高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)對(duì)總?cè)萍兌鹊挠绊?/p>

采用不同的硅膠高度對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，通過對(duì)收集樣品總?cè)萍兌?、得率和洗脫效果的分析，篩選出最佳的高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)，結(jié)果見圖1(a)和(b)。當(dāng)高徑比<55∶22時(shí)，總?cè)频募兌?、得率和洗脫效果隨著高徑比的增加而提高。當(dāng)高徑比55∶22時(shí)，三萜類化合物的洗脫效果最好，總?cè)萍兌群偷寐实淖畲笾捣謩e為28.18%、95.16%。當(dāng)高徑比>55∶22時(shí)，總?cè)频募兌?、得率和洗脫效果隨著高徑比的增加而降低。故高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)選擇55∶22。

2.2.2不同上樣量和硅膠量質(zhì)量比對(duì)總?cè)萍兌鹊挠绊?/p>

在不同的上樣量情況下對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，通過收集樣品進(jìn)行總?cè)萍兌?、得率和洗脫效果的分析，篩選出最佳的上樣量和硅膠量質(zhì)量比，具體結(jié)果見圖2(a)和(b)。在上樣量和硅膠量質(zhì)量比為 4∶80 時(shí)，總?cè)频南疵撔Ч詈?，純度和得率最大，分別為28.18%、95.16%；當(dāng)上樣量和硅膠量質(zhì)量比< 4∶80時(shí)，總?cè)频募兌?、得率和洗脫效果隨著上樣量和硅膠量質(zhì)量比的增加而提高；當(dāng)上樣量和硅膠量質(zhì)量比>4∶80時(shí)，隨著比例的增大，總?cè)频募兌?、得率和洗脫效果不僅降低，且在洗脫過程中產(chǎn)生了嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。故上樣量和硅膠量質(zhì)量比選擇4∶80。

2.2.3不同洗脫體系對(duì)乙酸乙酯萃取物總?cè)萍兌鹊挠绊?/p>

采用不同的洗脫體系對(duì)粗毛纖孔菌菌絲體和子實(shí)體進(jìn)行洗脫，通過對(duì)收集樣品總?cè)萍兌取⒌寐屎拖疵撔Ч姆治?，篩選出最佳的洗脫體系，結(jié)果見圖3(a)、(b)和(c)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：丙酮∶石油醚體系對(duì)乙酸乙酯萃取后總?cè)频南疵撔Ч詈茫訉?shí)體和菌絲體總?cè)萍兌茸畲?，分別為36.01%、54.00%。由圖3(a)、3(b)可知，在洗脫體系為氯仿∶甲醇時(shí)，總?cè)七€沒來得及分離就已被完全洗脫；乙酸乙酯∶丙酮體系總?cè)葡疵撔Ч^差，產(chǎn)生拖尾。故洗脫體系選擇丙酮∶石油醚。

(a)高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)三萜純度和得率圖；(b)洗脫曲線(收集樣品30 管，后20 管的三萜含量趨近于0，故圖顯示10 管樣品) 不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。純度之間的差異用a、b、c表示。得率之間的差異用d、e、f表示。圖2同。
(a)The purity and yield of total triterpenoids under different height-to-diameter ratios (height of silica gel∶diameter of silica gel); (b) The elution curve (A total of 30 tubes of samples are collected. The content of total triterpenoids of the last 20 tubes tended to be zero. Therefore only first 10 tubes are shown in the figure) Different small letters indicate significant differences (P<0.05). Differences among purity are represented by a, b and c. Differences among yield are represented by d, e and f. The same in
Fig.2.
圖1 不同高徑比對(duì)總?cè)萍兌鹊挠绊?br/>Fig.1 Effect of different height-to-diameter ratios on purity of total triterpenoids

(a)上樣量和硅膠量質(zhì)量比三萜純度和得率圖；(b)洗脫曲線
(a) The purity and yield of total triterpenoids with different sample mass-to-silica gel mass. (b) The elution curve
圖2 不同上樣量和硅膠量質(zhì)量比對(duì)總?cè)萍兌鹊挠绊?br/>Fig.2 Effect of different sample and silica gel ratios on the purity of total triterpenoids

2.2.4不同洗脫劑比例對(duì)乙酸乙酯萃取總?cè)萍兌鹊挠绊?/p>

采用不同的洗脫劑比例對(duì)粗毛纖孔菌菌絲體和子實(shí)體進(jìn)行洗脫，通過對(duì)收集樣品的總?cè)萍兌取⒌寐屎拖疵撔Ч治?，篩選出最佳的洗脫劑比例，具體結(jié)果見圖4(a)、(b)和(c)。當(dāng)V丙酮∶V石油醚=3∶1 時(shí)，乙酸乙酯萃取總?cè)频南疵撔Ч詈茫訉?shí)體和菌絲體總?cè)萍兌茸畲?，分別為42.32%、65.35%。由圖4(a)和(b)洗脫曲線可知，隨著丙酮比例的增加，各管中總?cè)频暮棵黠@的增加。當(dāng)V丙酮∶V石油醚>3∶1時(shí)，各管中總?cè)频暮棵黠@的減少。故V丙酮∶V石油醚選擇3∶1。

(a)子實(shí)體洗脫曲線；(b)菌絲體洗脫曲線；(c)洗脫體系對(duì)總?cè)萍兌扔绊憟D 不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。子實(shí)體總?cè)萍兌戎g的差異用a、b表示。菌絲體總?cè)萍兌戎g的差異用c、d表示。圖4同。
(a) The elution curve of fruiting body; (b) The elution curve of mycelium; (c) The effect of elution system on purity of total triterpenoids Different small letters indicate significant differences (P<0.05). Differences of among total triterpenoids purity of fruiting body are represented by a and b. Differences among total triterpenoids purity of mycelium are represented by c and d. The same in
Fig.4.
圖3 不同洗脫體系對(duì)乙酸乙酯萃取物總?cè)萍兌鹊挠绊?br/>Fig.3 Effect of different elution systems on purity of total triterpenoids extracted by ethyl acetate

2.3 不同分離純化方法對(duì)總?cè)萍兓Ч挠绊?/h3>

比較不同純化方法對(duì)粗毛纖孔菌總?cè)萍兌鹊挠绊?，結(jié)果見表2。子實(shí)體經(jīng)萃取和硅膠純化后的總?cè)萍兌葹?2.32%，是大孔樹脂純化和單純硅膠純化所得總?cè)萍兌鹊?.02、1.56 倍。菌絲體經(jīng)萃取和硅膠純化后的總?cè)萍兌葹?5.35%，是大孔樹脂純化和單純硅膠純化所得總?cè)萍兌鹊?.12和1.39倍。

2.4 粗毛纖孔菌純化物總?cè)萍t外光譜分析

通過紅外光譜對(duì)粗毛纖孔菌子實(shí)體和菌絲體純化后的總?cè)七M(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，菌絲體和子實(shí)體可能因培養(yǎng)環(huán)境的不同造成結(jié)構(gòu)之間的差異。總?cè)圃? 551/cm-1和3 415/cm-1處存在O-H鍵伸縮振動(dòng)峰。菌絲體純化后，總?cè)圃?2 926/cm-1處存在較強(qiáng)的吸收峰，其可歸因于對(duì)稱或者非對(duì)稱的—CH2、—CH3的伸縮振動(dòng)；子實(shí)體純化后，總?cè)圃诖颂幍恼駝?dòng)峰減弱。菌絲體純化后總?cè)圃?1 613/cm-1處存在較強(qiáng) C=C 伸縮振動(dòng)峰，子實(shí)體純化后總?cè)频腃=C縮振動(dòng)峰減弱。子實(shí)體純化后總?cè)圃? 548/cm-1存在較強(qiáng)的非對(duì)稱變型的—CH3伸縮振動(dòng)峰；菌絲體純化物總?cè)频姆菍?duì)稱變型的—CH3伸縮振動(dòng)峰減弱。菌絲體純化后總?cè)圃? 372/cm-1處存在弱的吸收峰，歸因于對(duì)稱變形的—CH3存在；子實(shí)體純化后總?cè)圃诖颂幉淮嬖趯?duì)稱變形的—CH3。

(a)子實(shí)體洗脫曲線；(b)菌絲體洗脫曲線；(c)洗脫比例對(duì)純度影響圖
(a) The elution curve of fruiting body; (b) The elution curve of mycelium; (c) The effect of eluent ratio on purity of total triterpenoids
圖4 不同洗脫劑比例對(duì)乙酸乙酯萃取總?cè)萍兌鹊挠绊?br/>Fig.4 Effect of different eluent ratios on purity of total triterpenoids extracted by ethyl acetate

表2 不同純化方法對(duì)總?cè)萍兌鹊挠绊?br/>Table 2 Effects of different purification methods on the purification of total triterpenoids %

粗毛纖孔菌Inonotus hispidus萃取后硅膠純化Purified with silicagel after extraction硅膠純化Purified withsilica gel大孔樹脂純化Purified withmacroporous resin子實(shí)體總?cè)萍兌萈urity of total triterpenoids in fruiting body42.32±1.54 aC27.06±1.63 bC20.94±1.63 bC菌絲體總?cè)萍兌萈urity of total triterpenoids in mycelium65.35±1.67 aD46.92±1.21 bD30.80±1.21 cD

注：同行不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。不同純化方法純度之間的差異用a、b、c表示。同列不同大寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。菌絲體和子實(shí)體純度之間的差異用C、D表示。

Note： Different small letters within same raw indicate significant differences (P<0.05). Purity differences among different purification methods are represented by a, b and c. Different capital letters within same column indicate significant differences (P<0.05). Purity differences between fruiting body and mycelium are represented by C and D.

子實(shí)體純化后總?cè)圃? 294/cm-1處存在—S-O反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；菌絲體純化后總?cè)圃诖颂幉淮嬖凇猄-O反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰。子實(shí)體純化后總?cè)圃?12/cm-1處存在=C-H振動(dòng)峰；菌絲體純化后總?cè)圃诖颂幉淮嬖?C-H振動(dòng)峰。子實(shí)體純化后總?cè)圃?62/cm-1處存在C-O和C-C振動(dòng)峰；菌絲體純化后總?cè)圃诖颂幉淮嬖?C-O和C-C振動(dòng)峰。說明菌絲體和子實(shí)體總?cè)乒倌軋F(tuán)存在差異，但都符合三萜類物質(zhì)的特征結(jié)構(gòu)。

2.5 粗毛纖孔菌總?cè)茖?duì)體外膽酸鹽結(jié)合能力的影響

比較粗提和純化后粗毛纖孔菌總?cè)茖?duì)體外膽酸鹽結(jié)合能力的影響，結(jié)果見圖5。粗毛纖孔菌菌絲體和子實(shí)體粗提物的總?cè)平?jīng)純化后，膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉的結(jié)合能力增強(qiáng)。其中菌絲體總?cè)平?jīng)純化后，對(duì)三種膽酸鹽的結(jié)合能力最強(qiáng)分別為1.14、1.78和2.06 μmol/100 mg，是菌絲體粗提物總?cè)颇懰猁}結(jié)合能力的1.56、1.73和1.72 倍。

不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。膽酸鈉之間的差異用a、b、c表示。甘氨膽酸鈉之間的差異用d、e、f 表示。?；悄懰徕c之間的差異用j、h、k表示。 Different small letters indicate significant differences (P<0.05). Differences among sodium cholate treatments are represented by a, b and c. Differences among sodium glycocholate treatments are represented by d, e and f. Differences among sodium taurocholate treatments are represented by j, h and k.
圖5 總?cè)企w外膽酸鹽結(jié)合量
Fig.5Invitrobile salt binding amount of total triterpenoids

3 討論與結(jié)論

三萜類化合物具有抗癌、抗病毒、降血脂等多種功能[6]。為了提高三萜類化合物的純度和生物活性，已有研究采用成本低廉的大孔樹脂用于三萜類化合物純化，例如：徐紅云[18]采用大孔樹脂純化粗毛纖孔菌三萜，純度可以達(dá)到27.82%；金文芳等[15]純化馬蘭總?cè)?，純度可以達(dá)到17.81%。大孔樹脂雖然具有吸附性強(qiáng)、解吸條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，但其分離純度差，不利于總?cè)萍兌鹊奶岣遊10]。本試驗(yàn)基于有機(jī)溶劑萃取法，具有操作簡(jiǎn)便、可以避免活性成分損失的優(yōu)點(diǎn)，而且硅膠干擾因素少、選擇性高、可循環(huán)利用和表面硅醇基較強(qiáng)吸附作用[12,19-20]。研究了有機(jī)溶劑萃取與硅膠聯(lián)用對(duì)粗毛纖孔菌總?cè)萍兌鹊挠绊憽１狙芯堪l(fā)現(xiàn)高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)55∶22、上樣量和硅膠量質(zhì)量比4∶80、洗脫體系為丙酮∶石油醚、洗脫劑體積比為3∶1時(shí)，菌絲體和子實(shí)體經(jīng)乙酸乙酯萃取后的總?cè)萍兌蕊@著提高，分別為65.35%、42.32%。其中，子實(shí)體乙酸乙酯萃取及硅膠純化后的總?cè)萍兌仁侵拔墨I(xiàn)通過大孔樹脂純化粗毛纖孔菌三萜的1.52 倍[18]。本試驗(yàn)方法用于粗毛纖孔菌三萜的純化，不僅操作簡(jiǎn)單方便，還可以大幅度提高三萜的純度和生物活性，可以為粗毛纖孔菌三萜類化合物高效純化方法的選擇提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。有研究表明三萜類化合物可以促使膽固醇在肝臟中更快地轉(zhuǎn)化膽汁酸，能較好地與膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉結(jié)合。其中?；悄懰徕c的結(jié)合量最大，可能是在羥基含量相同時(shí)，?；悄懰徕c的疏水性比膽酸鈉和甘氨膽酸鈉更強(qiáng)，可以通過疏水作用能更好地吸附于其他羥基中，從而達(dá)到較好的降血脂效果[16, 21]。

本研究發(fā)現(xiàn)：菌絲體總?cè)萍兓蟮哪懰徕c、甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉結(jié)合能力都得到了增強(qiáng)，分別為1.14、1.78和2.06 μmol/100 mg；子實(shí)體純化后總?cè)频哪懰徕c、甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c結(jié)合能力分別為0.89、1.49和1.77 μmol/ 100 mg；子實(shí)體總?cè)平?jīng)萃取和硅膠純化后的膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c分別是前期課題組[22]大孔樹脂純化后總?cè)频?.39、1.18和1.12 倍。上述結(jié)果表明說明本試驗(yàn)通過有機(jī)溶劑的初步萃取和硅膠條件的優(yōu)化，顯著提高了粗毛纖孔菌總?cè)萍兌群腕w外膽酸鹽的結(jié)合能力，然而粗毛纖孔菌菌絲體和子實(shí)體總?cè)茊误w的分離和結(jié)構(gòu)仍需深入鑒定。粗毛纖孔菌作為一種藥用真菌，對(duì)人體有保健作用，對(duì)疾病有治療、預(yù)防或抑制作用。因此，進(jìn)一步研發(fā)粗毛纖孔菌的功能成分尤其是三萜類化合物的功，對(duì)藥用真菌的研究和利用具有重要意義。