張美蓮，王志星，胡 艷，冉坤念，韓 為*，彭小忠,2*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心 神經(jīng)科學(xué)中心，北京 100005；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118)

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)是最常見(jiàn)且極具致命性的顱內(nèi)腫瘤[1]，目前除替莫唑胺以外，缺少其他有效治療膠質(zhì)瘤的藥物[2]。而膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展以及放化療抵抗有關(guān)[3-4]，故篩選能夠有效且特異性抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cell，GSC)的藥物對(duì)膠質(zhì)瘤的治療至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)藥物篩選，發(fā)現(xiàn)了一種可有效抑制GSC的小分子藥物氯?？朔?clofoctol)，并通過(guò)依賴于靶點(diǎn)穩(wěn)定性的藥物親和反應(yīng)(drug affinity responsive target stability，DARTS)技術(shù)找尋到了該藥物的作用靶點(diǎn)，一種RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein，RBP)N-ras上游蛋白(upstream of N-ras，UNR)，氯?？朔涌赏ㄟ^(guò)與UNR的結(jié)合而上調(diào)凋亡相關(guān)因子Krüppel樣因子13(krüppel-like factor 13，KLF13)的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的凋亡，從而起到治療膠質(zhì)瘤的效果[5]。但氯?？朔优c其靶點(diǎn)UNR結(jié)合后是如何上調(diào)KLF13的表達(dá)，以及氯?？朔涌鼓z質(zhì)瘤的其他作用途徑尚不清楚，本研究旨在進(jìn)一步探索氯?？朔涌鼓z質(zhì)瘤的機(jī)制，從而為氯?？朔佑糜谀z質(zhì)瘤的靶向治療提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(LN229)(ATCC公司)。

1.1.2 主要試劑：UNR抗體(ABclonal Biotechnology公司)；氯?？朔?MicroSource Discovery公司)；Streptavidin Sepharose 珠子(GE公司)；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、NE-PER試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；基因芯片(CapitalBio公司)。

1.2 方法

1.2.1 Biotin pull-down實(shí)驗(yàn)：為探究UNR與KLF13mRNA的互作，以及氯福克酚對(duì)二者互作能力的影響，實(shí)施pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。參考實(shí)驗(yàn)室前期生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的KLF13mRNA上潛在的UNR結(jié)合位點(diǎn)[5]，設(shè)計(jì)并制備200～300 bp長(zhǎng)度的生物素標(biāo)記的6條探針。采用核質(zhì)分離(NE-PER)試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)分別提取未處理、DMSO、10 μmol/L和1 mmol/L氯福克酚處理的LN229細(xì)胞總蛋白，體外進(jìn)行探針與細(xì)胞總蛋白的孵育，streptavidin sepharose珠子與混合物結(jié)合、洗雜、收集與探針結(jié)合的蛋白樣品并進(jìn)行Western blot檢測(cè)與探針結(jié)合UNR的含量。

1.2.2 氯?？朔覦ARTS樣品質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組學(xué)芯片聯(lián)合分析：為分析氯?？朔釉谀z質(zhì)瘤中的其他作用靶點(diǎn)以及對(duì)其他下游靶基因的預(yù)測(cè)，做聯(lián)合分析。氯福克酚DARTS樣品質(zhì)譜結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組學(xué)芯片分析使用Cytoscape軟件(version 3.7.1，Affymetrix公司)分析。首先，對(duì)3 μmol/L和10 μmol/L氯?？朔犹幚鞧SC后上下調(diào)差異明顯的基因取交集，滿足foldchange>2且P<0.05，篩選在GSC中受氯福克酚所調(diào)控的下游差異表達(dá)基因。其次，分析氯?？朔覦ARTS樣品質(zhì)譜結(jié)果，關(guān)注氯?？朔幼饔玫慕?jīng)典RBP(RNA-binding protein)，滿足foldchange>5且P值<0.05，人類RBP數(shù)據(jù)來(lái)自EuRBPDB數(shù)據(jù)庫(kù)[6]。再次，分別對(duì)氯?？朔幼饔玫慕?jīng)典RBP所直接結(jié)合的RNA或調(diào)控的下游靶基因與氯?？朔愚D(zhuǎn)錄組差異基因取交集，其中人類UNR iCLIP數(shù)據(jù)來(lái)自L.；人類真核翻譯起始因子3B(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B，EIF3B)PAR-CLIP數(shù)據(jù)來(lái)自CLIPdb數(shù)據(jù)庫(kù)[7]；輸出蛋白7(exportin 7，XPO7)所調(diào)控的基因來(lái)自小鼠敲低后的芯片數(shù)據(jù)[8]，并利用UniProt網(wǎng)站對(duì)涉及的基因進(jìn)行人同源覆蓋度分析；受亮氨酰tRNA合成酶(leucyl-tRNA synthetase，LARS)所主要調(diào)控的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號(hào)通路基因集來(lái)自KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。最后，分析氯福克酚轉(zhuǎn)錄組芯片與基因表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的影響，預(yù)測(cè)氯?？朔幼饔糜诮?jīng)典RBP的其他下游靶基因，患者基因表達(dá)水平與預(yù)后相關(guān)性數(shù)據(jù)來(lái)自基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Cytoscape (version 3.7.1) 軟件進(jìn)行多組學(xué)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 氯?？朔涌稍鰪?qiáng)UNR與KLF13 mRNA之間的互作

針對(duì)KLF13mRNA的CDS區(qū)和3′UTR區(qū)制備的6條生物素探針中(圖1A)，與其他幾條探針相比，3#和6#探針與UNR之間存在明顯的結(jié)合(圖1B)。并且相對(duì)于DMSO組，10 μmol/L和1 mmol/L氯?？朔?clofoctol)處理均可增強(qiáng)3#探針與UNR的結(jié)合(圖1C)。

2.2 氯?？朔幼饔糜赨NR的下游靶基因預(yù)測(cè)分析

3 μmol/L和10 μmol/L的氯?？朔犹幚砟z質(zhì)瘤干細(xì)胞后的這兩個(gè)芯片數(shù)據(jù)取交集，得到了249個(gè)上下調(diào)差異表達(dá)明顯的基因(圖2A)。對(duì)藥靶UNR的iCLIP-seq基因集，與這249個(gè)差異基因取交集，篩選出了11個(gè)氯?？朔幼饔糜赨NR的下游靶基因(圖2B)。在氯福克酚治療后表達(dá)上調(diào)的5個(gè)基因中，RPL6、LDHB和ATP6V0D1這3個(gè)基因的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者較好的預(yù)后相關(guān)，而在表達(dá)下調(diào)的6個(gè)基因中，CDH24和SRP7這2個(gè)基因的低表達(dá)也與膠質(zhì)瘤患者較好的預(yù)后相關(guān)(圖2B,C)。

2.3 氯?？朔涌勺饔糜诮?jīng)典RNA結(jié)合蛋白

氯?？朔映饔糜赨NR以外，還可作用于另外3個(gè)經(jīng)典RNA結(jié)合蛋白XPO7、LARS和EIF3B(圖3A)。在小鼠中敲低XPO7后所調(diào)控的基因中有85個(gè)人同源基因，這85個(gè)基因與249個(gè)差異基因取交集，得到1個(gè)基因CACNA1S(圖3B,C)。由LARS所主要調(diào)控的mTOR信號(hào)通路基因集與249個(gè)差異基因取交集，得到AKT2和RPS6KB2這2個(gè)基因。EIF3B PAR-CLIP基因集與249個(gè)差異基因取交集，得到64個(gè)基因。

2.4 氯福克酚可作用于其他經(jīng)典RBP的下游靶基因預(yù)測(cè)分析

在上述篩選得到的3個(gè)可能的下游靶基因CACNA1S、AKT2和RPS6KB2中，存在1個(gè)基因RPS6KB2的低表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者較好的預(yù)后相關(guān)，這與氯福克酚治療可下調(diào)其表達(dá)的結(jié)果一致(圖4A)。EIF3BPAR-CLIP基因集與249個(gè)差異基因取交集得到的64個(gè)基因，主要富集在由腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL) 所激活的凋亡信號(hào)通路上(圖4B)。

A.schematic of the 6 indicated candidate biotin-labeled probes ofKLF13mRNA; B.biotin pull-down assay analysis of the binding between UNR and probes ofKLF13mRNA,PABPC1 was the positive control, the results showed there had a binding between 3# and 6# probes withKLF13mRNA; C.clofoctol treatment (10 μmol/L) 1 hour at 37 ℃invivoand treatment (1 mmol/L) 1 hour at 25 ℃invitroall increased the binding between UNR andKLF13mRNA-3# probes, but notKLF13mRNA-6# probes

圖1 氯?？朔釉鰪?qiáng)UNR與KLF13mRNA之間的互作
Fig 1 Clofoctol enhanced the interaction between UNR andKLF13mRNA

A.Venn diagram depicting the overlap of genes regulated by clofoctol-treated with 3 μmol/L and 10 μmol/L, as determined by microarray data,foldchange>2,P<0.05; B.Venn diagram depicting the overlap of genes regulated by clofoctol at the steady-state level and UNR iCLIP targets,foldchange>2,P<0.05; C.high expression ofRPL6, andLDHBcorrelated with great survival of patients and low expression ofCABLES1andSRP72correlated with great survival of patients by analyzing information fromGEPIAwebsite,P<0.05

圖2 氯福克酚作用于UNR的下游靶基因預(yù)測(cè)分析
Fig 2 Prediction analysis of the downstream target genes of clofoctol on UNR

3 討論

RNA結(jié)合蛋白(RBP)通過(guò)調(diào)控RNA從而發(fā)揮特定的生物學(xué)功能。RBP可通過(guò)影響癌細(xì)胞凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移等過(guò)程，而參與惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展[9-10]，因此可以通過(guò)改變RBP自身的表達(dá)水平或者影響RBP與RNA的相互作用，以期實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療[11]，然而以RBP為靶點(diǎn)來(lái)治療膠質(zhì)瘤的研究尚少。

本實(shí)驗(yàn)室前期篩選出了一種以RNA結(jié)合蛋白UNR為靶點(diǎn)的可有效治療膠質(zhì)瘤的潛在新藥氯?？朔?，但藥靶UNR調(diào)控靶基因KLF13表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚。為了證明靶基因KLF13mRNA與藥靶UNR之間存在互作，克隆并制備了包含UNR潛在結(jié)合位點(diǎn)的6條探針，體外pull-down篩選到了2條包含GAAGGA、GAAGAA序列的KLF13mRNA所在探針片段可結(jié)合UNR，利用pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)氯?？朔犹幚砜稍鰪?qiáng)其中一條探針與UNR的結(jié)合能力，這提示氯?？朔涌赡苤饕ㄟ^(guò)該探針?biāo)谄?，增?qiáng)UNR與KLF13mRNA的結(jié)合能力。為了找尋氯?？朔涌鼓z質(zhì)瘤的其他重要作用靶點(diǎn)以及下游途徑，通過(guò)氯?？朔覦ARTS樣品質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果結(jié)合轉(zhuǎn)錄組芯片分析，發(fā)現(xiàn)除了UNR蛋白外，另外3個(gè)經(jīng)典RNA結(jié)合蛋白XPO7、LARS和EIF3B也可以作為氯福克酚的靶點(diǎn)，這4個(gè)RBP均具有可結(jié)合RNA的保守結(jié)構(gòu)域[6]。利用網(wǎng)上已公開(kāi)的數(shù)據(jù)進(jìn)一步預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，氯?？朔舆€可能通過(guò)調(diào)控mTOR信號(hào)通路以及TRAIL激活的凋亡信號(hào)通路而起到抗膠質(zhì)瘤的效果，但氯?？朔又委熌z質(zhì)瘤的這些潛在機(jī)制還尚未進(jìn)一步證實(shí)。

A.summary of canonical RBP, non-canonical RBP, and non-RBP for clofoctol DARTS,foldchange>5,P<0.05; B.venn diagram depicting the homologous coverage of XPO7 by human and mouse; C-E.Venn diagram depicting the overlap of genes regulated by clofoctol at the steady-state level and XPO7-regulated targets, LARS-regulated mTOR pathway targets, and EIF3B PAR-CLIP targets,foldchange>2,P<0.05

圖3 氯?？朔幼饔糜诮?jīng)典RBP
Fig 3 Clofoctol acted on canonical RNA-binding proteins

A.low expression ofRPS6KB2correlated with great survival of patients by analyzing information fromGEPIAwebsite, butAKT2not,P<0.05; B.GO analysis of64genes

圖4 氯?？朔幼饔糜谄渌?jīng)典RBPs的下游靶基因預(yù)測(cè)分析
Fig 4 Prediction analysis of downstream target genes of clofoctol on other canonical RBPs

總之，本研究證實(shí)了氯?？朔油ㄟ^(guò)藥靶UNR治療膠質(zhì)瘤的機(jī)制，并另外發(fā)現(xiàn)了3個(gè)氯福克酚的RNA結(jié)合蛋白潛在藥靶，并分析預(yù)測(cè)到了一些其他下游靶基因，這為氯福克酚可作為治療惡性膠質(zhì)瘤的潛在新藥提供了強(qiáng)有力的證據(jù)支持。