張 浩，陳代文，余 冰，何 軍，虞 潔，毛湘冰，羅玉衡，黃志清，羅鈞秋，鄭 萍

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所/動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，四川雅安 625014）

現(xiàn)代種豬選育技術(shù)提高了母豬窩產(chǎn)仔數(shù)，但是也造成低出生重（low birth weigh，LBW）仔豬發(fā)生率明顯上升，自然發(fā)生的LBW仔豬比例高達(dá)15%～20%[1-2]。LBW仔豬是指出生重低于1.0 kg的仔豬[3]，其產(chǎn)生的主要原因是宮內(nèi)發(fā)育遲緩，即哺乳動物妊娠期胚胎或胎兒發(fā)育受阻[2，4]。前人研究發(fā)現(xiàn)，LBW提高了仔豬斷奶前死亡率，而且即使成活的LBW仔豬其生長性能也顯著低于正常出生重（normal birth weight，NBW）仔豬[5-7]。

有關(guān)報道表明，出生和斷奶時LBW新生兒的抗氧化能力顯著下降[3，8-9]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，與NBW仔豬比較，LBW仔豬抗氧化系統(tǒng)遭到顯著破壞，氧化損傷明顯增強(qiáng)，表明LBW仔豬遭受到了氧化應(yīng)激[3]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是細(xì)胞代謝不可避免的產(chǎn)物[10]，如果細(xì)胞內(nèi)ROS無法被及時有效清除，其能作用于線粒體，將會對細(xì)胞線粒體功能造成嚴(yán)重?fù)p傷，造成細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷[11]。當(dāng)線粒體遭受損傷時，電子傳遞鏈、氧化磷酸化、細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)以及線粒體蛋白的表達(dá)等都發(fā)生異常變化，不能合成足夠的ATP，造成細(xì)胞生長代謝紊亂，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，嚴(yán)重時造成細(xì)胞死亡[12]。

白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種非黃酮類的多酚化合物，廣泛存在于葡萄、松樹、虎杖、決明子和花生等天然植物或果實當(dāng)中[13]。腸道、肝臟和肺臟都是RES在動物體內(nèi)代謝的主要器官[14]。RES是一種Nrf2的激活劑，可以通過激活Nrf2/HO-1通路，上調(diào)下游抗氧化基因表達(dá)、提高抗氧化酶活性和機(jī)體抗氧化能力，緩解機(jī)體氧化損傷[15-21]。但是，飼糧添加RES對LBW哺乳仔豬氧化損傷主要位點線粒體功能的研究較少；因此，本研究通過揭示飼糧添加RES改善LBW哺乳仔豬肝臟氧化還原狀態(tài)和線粒體功能的作用機(jī)制，為生產(chǎn)中利用RES改善LBW哺乳仔豬健康發(fā)育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

試驗選取胎次接近、產(chǎn)期一致的初產(chǎn)母豬所產(chǎn)仔豬，參考Zheng P.等[3]的選擇標(biāo)準(zhǔn)，首先標(biāo)記出40頭（0.8～1.0）kg的新生 LBW 仔豬和 20 頭（1.5～1.7）kg的新生NBW仔豬，前三天充分采食初乳，4日齡時，將原來的20頭LBW（BW：1.16 kg+0.07 kg）仔豬分為LBWC組和LBW+RES組，并從原來的20頭NBW仔豬選取10頭NBW（BW：2.07 kg+0.10 kg）仔豬，每組按體重相近、公母比例一致的原則分組，每個處理10個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。LBWC組和NBWC組飼喂基礎(chǔ)飼糧，LBW+RES組飼喂基礎(chǔ)飼糧添加600 mg/kg RES基礎(chǔ)飼糧為人工乳。飼養(yǎng)21天。

1.2 試驗材料

RES由陜西慈緣生物有限公司提供，純度為98%。

1.3 試驗飼糧

試驗飼糧為人工配方乳，基礎(chǔ)飼糧組成見表1。LBW+RES組飼糧在基礎(chǔ)飼糧中添加600 mg/kg RES。飼喂前按照代乳粉∶水=1∶4的比例加入40℃溫開水中充分溶解，奶瓶飼喂，吃飽為準(zhǔn)。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所教學(xué)科研基地進(jìn)行，所有仔豬單籠飼養(yǎng)于仔豬代謝籠中。試驗前對圈舍及代謝籠進(jìn)行全面消毒，試驗期間圈舍溫度控制在28～30℃。每天飼喂7次，時間分別為 06:00、09:00、12:00、15:00、18:00、21:00 和 24:00，每次飼喂以仔豬吃飽為準(zhǔn)。試驗期間不對豬只使用任何抗生素類藥物，其余按基地要求進(jìn)行操作管理。

1.5 樣品采集與處理

1.5.1 血液樣品采集

試驗第22天清晨，對所有試驗豬進(jìn)行空腹采血，將采集的前腔靜脈血緩緩注射入采血管中，3 500 r/min離心15 min，分離血清，分裝，-20℃保存待測。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets（air-dry basis） %

1.5.2 肝臟組織樣品采集

屠宰后，分離仔豬肝臟組織，用濾紙吸干表面，于冰上剪取肝臟組織，置于無菌凍存管中，錫箔紙包好，液氮速凍，-80℃保存待測。

1.6 測定指標(biāo)與方法

1.6.1 血清氧化還原指標(biāo)

血清CAT、SOD、GPx酶活和MDA含量均采用試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國）進(jìn)行檢測，操作均按照試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行。

1.6.2 肝臟氧化還原指標(biāo)

測定之前將肝臟組織樣品進(jìn)行勻漿，制成10%勻漿液待測。肝臟CAT、SOD和GPx酶活以及MDA和TP含量均采用試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國）進(jìn)行檢測，操作均按照試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行。

1.6.3 肝臟游離Ca2+濃度、ATP和線粒體mPTP含量

肝臟組織Ca2+濃度、ATP和TP含量均采用試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國）進(jìn)行檢測，操作均按照試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行。

肝臟線粒體mPTP采用Elisa試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，中國）測定，操作均按照試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行。

1.6.4 肝臟基因表達(dá)測定

采用實時定量PCR法測定肝臟氧化還原和線粒體功能相關(guān)基因mRNA表達(dá)量?？俁NA提取按照試劑盒（Trizol Reagent，TakaPa，日本）說明進(jìn)行，RNA質(zhì)量檢測使用核酸蛋白檢測儀（Beckman DU-800，CA，美國）檢測260 nm和280 nm處吸光度，A260/A280比值表示RNA的純度，該比值位于1.8～2.0之間表明RNA純度較好。cDNA合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMregent kit，TaKaRa，日本），具體操作步驟參照說明書進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后-20℃保存。引物均由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表2。樣品的實時熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 10 μL：5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×），0.5 μL 上游引物，0.5 μL 下游引物，3 μL 雙蒸水，1 μL cDNA模板。采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：模板預(yù)變性，95 ℃，30 s；擴(kuò)增，95 ℃，5 s，適宜的退火溫度，30 s，共 42 個循環(huán)；溶解曲線，55～95 ℃，溫度以0.5℃/s速率提升。組織中各基因的相對表達(dá)量以 β-actin 作為內(nèi)參基因，采用 2-△△Ct法計算[22]。

表2 實時定量PCR引物序列及參數(shù)Table 2 Sequences and parameters of primers for the real-time qPCR

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)首先采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行整理，再采用SPSS 22.0軟件中的GLM模型進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)合Duncan氏多重比較，分析各處理間的差異顯著性，所有試驗數(shù)據(jù)均以平均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05視為差異顯著，0.05≤P＜0.10視為有變化趨勢。

2 結(jié)果

2.1 飼糧添加白藜蘆醇對低出生重哺乳仔豬血清抗氧化酶活性與MDA含量的影響

如表3所示，飼糧補(bǔ)充RES顯著提高LBW仔豬血清 CAT 活性（P＜0.05），而對血清 SOD、GPx活性和MDA含量均無顯著影響（P＞0.05）。

表3 飼糧添加白藜蘆醇對低出生重哺乳仔豬血清抗氧化酶活性與MDA含量的影響Table 3 Effects of dietary RES supplementation on serum antioxidant enzyme activities and MDA content of LBW suckling piglets

2.2 飼糧添加白藜蘆醇對低出生重哺乳仔豬肝臟抗氧化酶活性與MDA含量的影響

如表4所示，與NBWC仔豬比較，LBWC仔豬肝臟CAT活性顯著降低（P＜0.05）；飼糧補(bǔ)充RES顯著提高LBW仔豬肝臟CAT活性（P＜0.05）。

2.3 飼糧添加白藜蘆醇對低出生重哺乳仔豬肝臟Ca2+、mPTP和ATP含量的影響

如表5所示，與NBWC仔豬比較，LBWC仔豬肝臟ATP含量顯著降低（P＜0.05）；飼糧補(bǔ)充RES顯著提高LBW仔豬肝臟ATP含量（P＜0.05）。

2.4 飼糧添加白藜蘆醇對低出生重哺乳仔豬肝臟線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)的影響

如表6所示，與NBWC仔豬比較，LBWC仔豬肝臟COX I mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；飼糧添加白藜蘆醇顯著提高LBW仔豬肝臟NRF1 mRNA 表達(dá)量（P＜0.05）。

表4 飼糧添加白藜蘆醇對低出生重哺乳仔豬肝臟抗氧化酶活性與MDA含量的影響Table 4 Effects of dietary RES supplementation on hepatic antioxidant enzyme activities and MDA content of LBW suckling piglets

表5 飼糧添加白藜蘆醇對低出生重哺乳仔豬肝臟Ca2+、mPTP和ATP含量的影響Table 5 Effects of dietary RES supplementation on free Ca2+，mPTP and ATP contents in LBW suckling piglets

表6 飼糧添加白藜蘆醇對低出生重哺乳仔豬肝臟線粒體生物合成與功能相關(guān)基因表達(dá)的影響Table 6 Effects of dietary RES supplementation on mitochondrial biogenesis and function indexes in liver of LBW suckling piglets

3 討論

前人研究報道表明，LBW顯著影響仔豬生長發(fā)育[2，23-25]，且有大量研究顯示LBW可能更容易造成動物氧化還原平衡破壞[4，23]。前人研究證明，LBW仔豬更容易遭受氧化損傷[29-32]。王遠(yuǎn)孝等[31]研究哺乳仔豬腸道氧化還原狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，與NBW仔豬比較，LBW仔豬空腸T-AOC、GSH含量和SOD、GPx、CAT活性顯著降低。本試驗結(jié)果表明，LBW降低肝臟CAT活性，說明LBW仔豬肝臟抗氧化系統(tǒng)受損，這與前人研究結(jié)果一致[5，29，33]。RES 是高效的抗氧化劑，抗氧化能力強(qiáng)[34-36]。近年研究顯示，RES可以顯著抑制動物機(jī)體內(nèi)ROS產(chǎn)生，減輕氧化損傷，修復(fù)線粒體內(nèi)結(jié)構(gòu)功能損傷，增強(qiáng)仔豬抗氧化能力[17-18，26]。R.Turkmen等[17]在添加375 mg/kg亞慢性口服草甘膦類除草劑的大鼠飼糧中，補(bǔ)充20 mg/kg RES顯著緩解大鼠脂質(zhì)過氧化、改善抗氧化系統(tǒng)。本試驗結(jié)果表明飼糧添加RES能顯著提高LBW仔豬血清和肝臟CAT活性，表明飼糧補(bǔ)充RES對LBW仔豬抗氧化功能有提高作用。

線粒體呼吸鏈的功能是進(jìn)行生物氧化，并與ATPS相偶聯(lián)，共同完成氧化磷酸化過程，并生產(chǎn)能量分子ATP[37]。Cyt C、COX I和COX IV都是呼吸鏈中重要的酶，其表達(dá)量降低說明線粒體的電子傳遞功能受損[5]。Liu J.等[23]在仔豬上研究顯示，LBW顯著降低仔豬肝臟CytC和COX IV mRNA表達(dá)量。本試驗中，與NBW比較，LBW顯著降低肝臟COX I mRNA表達(dá)量，表明LBW仔豬呼吸鏈關(guān)鍵蛋白基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈電子傳遞功能受損。A.Csiszar等[38]研究發(fā)現(xiàn)，RES在人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生，增加線粒體質(zhì)量和mtDNA含量，上調(diào)呼吸鏈關(guān)鍵蛋白表達(dá)。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RES能夠提高肝臟NRF1 mRNA表達(dá)量，表明RES促進(jìn)仔豬肝臟的線粒體生物合成。線粒體是產(chǎn)生ATP的主要場所，因此，細(xì)胞內(nèi)ATP的含量可以作為檢測線粒體功能的重要指標(biāo)[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，與NBW比較，LBW顯著降低仔豬肝臟ATP含量，進(jìn)一步驗證了LBW仔豬線粒體功能受損；而飼糧補(bǔ)充600 mg/kg RES提高LBW哺乳仔豬肝臟ATP含量，說明RES對LBW仔豬線粒體能量代謝產(chǎn)物ATP的產(chǎn)生有調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

與NBW仔豬相比，LBW仔豬血清和肝臟抗氧化能力下降，線粒體代謝功能受阻；而飼糧添加600 mg/kg RES顯著提高LBW仔豬肝臟抗氧化能力，改善線粒體功能。