林偉其， 柏友萍， 孫 林

(安徽師范大學 體育學院，安徽 蕪湖 241003)

隨著第四次工業(yè)革命興起，人們的生活方式發(fā)生了根本性改變，現(xiàn)代社會老齡化狀態(tài)日益嚴重，老年肥胖人群的比例在不斷攀升。老年肥胖人群比一般老年人群更容易發(fā)生糖代謝紊亂、胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)和血脂代謝異常等相關疾病，老齡化和老年肥胖已成為重要的公共衛(wèi)生問題[1]。近年大量研究證明脂肪組織可分泌多種脂肪因子，其中內(nèi)臟脂肪組織分泌的脂肪因子在老年和老年肥胖人群上述相關疾病中發(fā)揮重要的病理生理作用。Resistin[2]和Visfatin[3]是近年發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，最初被認為促進肥胖和肥胖相關疾病發(fā)生發(fā)展，但隨著研究深入，很多研究發(fā)現(xiàn)Resistin和Visfatin存在有益影響，與促進肥胖的觀點相悖[4,5]。運動對老年及老年肥胖人群Resistin和Visfatin的影響目前尚不清楚。因此，本研究通過建立老年大鼠及老年肥胖大鼠模型，探討運動處方在老年肥胖大鼠的減肥中對Resistin和Visfatin影響，為運動預防老年及老年肥胖相關疾病提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

清潔級3周齡雄性SD大鼠50只，普通飼料喂養(yǎng)至大鼠55周齡。大鼠在18℃-20℃，相對濕度50%-70%的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。采用體重無差異原則(P>0.05)分為對照組與肥胖組，對照組12只喂普通飼料(脂肪含量比為6.0%)，肥胖組38只喂高脂飼料(脂肪含量比為40.0%)，喂養(yǎng)5周。建模成功標準為：老年大鼠的標準為鼠齡60周，老年肥胖大鼠的標準為肥胖大鼠體重>120%對照組平均體重[6]。建模成功后，選取11只老年大鼠隨機分為對照組(W)5只、運動組(WE)6只，隨機選取老年肥胖大鼠12只分為對照組(F)6只、運動組(FE)6只。在建模和干預中各死亡1只大鼠。本次實驗大鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司(合格證號：2007000546402，許可證號：SCXK(滬)2012—0002)，獲得安徽師范大學動物倫理學會同意(20150225)，符合中華人民共和國科學技術部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》要求。

1.2 試劑與儀器

Resistin和Visfatin ELISA試劑盒(美國TSZ公司生產(chǎn)，上海研域生物科技有限公司代理，上海)。M-MLV反轉錄酶(M1705，Promega)，Trizol(SN114，SunShineBioTM)，GoTaq qPCR Master Mix(A600，Promega)，Oligo dT15(SunShineBioTM)，Random prime(SunShineBioTM)，RNase Inhibitor(SunShineBioTM，R0004)，100bp DNA Ladder(SN124，SunShineBioTM)。

大鼠跑臺(Wi32812，北京)，電子秤(JM-A20001，中國)，電子分析天平(BS223S，北京)，冷凍高速離心機(Centrifuge5417，Eppendorf)，qRT-PCR儀(line-gene KFQD-48A，博日)，酶標儀(Tecan Sunrise，瑞士)，洗板機(Tecan Columbus Washer，瑞士)。

1.3 運動處方

此次實驗的運動處方在本實驗室前期的運動方案基礎上進行改良[7]。干預前，大鼠適應跑臺運動訓練5天，每天3-5次。運動處方為跑臺的坡度為0°，速度為15m/min，15min/組，4組/次，組間休息5min，總運動時間60min，1次/天，5次/周，持續(xù)運動8周。

1.4 樣本采集

干預8周后，安靜籠養(yǎng)2天，禁食12h，禁水6h，測大鼠體重。用10%的水合氯醛溶液(3.0mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉，麻醉成功后剖腹，取腹主動脈血，分離血漿，用ELISA測定血漿Resistin和Visfatin濃度。取睪周及腎周的內(nèi)臟脂肪組織，先用濾紙吸干表面組織液，然后稱其脂肪重量，取含血管少的一部分脂肪立即置于Trizol中，用qRT-PCR技術測Resistin和Visfatin的mRNA表達。

1.5 熒光定量PCR檢測Resistin和Visfatin的mRNA表達及Visfatin Tm值

根據(jù)GenBank公布的SD大鼠Resistin和Visfatin基因和β-actin基因序列設計相應的引物，委托上海生工技術有限公司合成。

表1 Resistin and Visfatin的引物序列設計

用Trizol提取總RNA，以總RNA為模板逆轉錄合成cDNA。PCR擴增:在95℃反應條件下預變性2min，95℃變性10s→60℃退火60s→60℃延伸60s，40次循環(huán);熔解曲線:60℃→95℃，每5s升溫0.3℃，Resistin Tm值為87℃，Visf-atin Tm值為82℃。臺階檢測，數(shù)據(jù)閾值與Ct值由軟件自動得出。采用2-△Ct法來進行相對定量，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)。得出的Resistin和Visfatin數(shù)值均擴大1000倍。

1.6 ELISA檢測Resistin和Visfatin的血漿濃度

血漿Resistin和Visfatin采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測試，所有操作均按照試劑盒使用說明書嚴格執(zhí)行。血漿Resistin和Visfatin濃度值均以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標繪制標準品的線性回歸方程。Resistin濃度的回歸方程為y=0.087x+0.052，r=0.997，Visfatin濃度的回歸方程為y=0.002x+0.008，r=0.998。代入Excel中得出數(shù)值乘以5即為樣本實際濃度。

1.7 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行整理分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(M±SD)表示，組間差異比較均以單因素方差分析(one-way ANOVA)的LSD進行。P>0.05表示無顯著性差異，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有非常顯著性差異。

2 結果

2.1 運動后大鼠體重、內(nèi)臟脂肪量及內(nèi)臟脂肪率的比較

由表2知，(1)大鼠體重的表現(xiàn)為WE低于W，無顯著性差異(P>0.05)。FE明顯低于F，有非常顯著性差異(P<0.01)。(2)大鼠內(nèi)臟脂肪量的表現(xiàn)為F明顯高于W，有非常顯著性差異(P<0.01)，WE低于W，有顯著性差異(P<0.05)，F(xiàn)E明顯低于F，有非常顯著性差異(P<0.01)。(3)大鼠內(nèi)臟脂肪率的表現(xiàn)為F高于W，無顯著性差異(P>0.05)，WE明顯低于W，有非常顯著性差異(P<0.01)，F(xiàn)E明顯低于F，有非常顯著性差異(P<0.01)。

表2 各組大鼠的體重、內(nèi)臟脂肪量和內(nèi)臟脂肪率的比較(X±SD)

注：elderly rats(W：control group，WE：exercise group)；elderly obese rats(F：control group，F(xiàn)E：exercise group)；內(nèi)臟脂肪率=內(nèi)臟脂肪量/體重×100%。與W組比較：△為P<0.05，△△為P<0.01；與F組比，▲為P<0.05，▲▲為P<0.01。

2.2 運動后大鼠Resistin的變化

2.2.1 運動后大鼠內(nèi)臟脂肪Resistin mRNA比較 由表3可知，運動后大鼠內(nèi)臟脂肪組織Resistin的mRNA表現(xiàn)為F高于W，無顯著性差異(P>0.05)，WE高于W，有顯著性差異(P<0.05)，F(xiàn)E高于F，無顯著性差異(P>0.05)。

2.2.2 運動后大鼠血漿Resistin濃度比較 由表4可知，運動后大鼠血漿Resistin濃度的表現(xiàn)為F低于W，無顯著性差異(P>0.05)，WE低于W，無顯著性差異(P>0.05)，F(xiàn)E低于F，無顯著性差異(P>0.05)。

表3 運動后各組大鼠Resistin的mRNA比較(X±SD)

Table 3 Comparison of resistin mRNA in rats after exercise

組別NResistin mRNA95%CIW523.286±10.16810.661-35.912WE650.491±23.242△26.100-74.881F523.897±6.63615.657-32.137FE639.881±18.59220.370-59.393

表4 干預后大鼠Resistin血漿濃度的比較(X±SD)(單位：pg/ml)

Table 4 Comparison of plasma concentrations of resistin in rats after intervention

組別NResistin95%CIW54.644±0.7793.676-5.611WE62.845±1.0211.774-3.916F54.299±1.9261.908-6.690FE63.669±2.2371.321-6.016

2.3 運動后大鼠Visfatin的變化

2.3.1 運動后大鼠內(nèi)臟脂肪Visfatin mRNA比較 由表5可知，運動后大鼠內(nèi)臟脂肪組織Visfatin mRNA的表現(xiàn)為F高于W，無顯著性差異(P>0.05)，WE高于W，無顯著性差異(P>0.05)，F(xiàn)E高于F，無顯著性差異(P>0.05)。

2.3.2 運動后大鼠血漿Visfatin濃度比較 由表6可知，運動后大鼠血漿Visfatin濃度的表現(xiàn)為F低于W，無顯著性差異(P>0.05)，WE高于W，無顯著性差異(P>0.05)，F(xiàn)E高于F，無顯著性差異(P>0.05)。

表5 運動后各組大鼠Visfatin的mRNA比較(X±SD)

表6 運動后大鼠Visfatin血漿濃度的比較(X±SD)(單位：pg/ml)

Table 6 Comparison of plasma concentrations of visfatin in rats after exercise

組別NVisfatin95%CIW5288.000±103.220159.835-416.165WE6311.667±91.483215.661-407.672F5246.000±57.353174.787-317.213FE6283.750±42.004239.669-327.831

3 討論

3.1 運動對老年大鼠和老年肥胖大鼠減肥效果的影響

Matsuzawa[8]等人研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪組織在IR和心血管疾病的病理生理學中的重要性高于皮下脂肪。Preis[9]等人研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪與BMI之間相互作用，內(nèi)臟脂肪與IR的相關性高于皮下脂肪，且肥胖患者的內(nèi)臟脂肪與IR關系更密切。Fernández[10]等人研究表明，超重和肥胖會增加個體IR的風險，內(nèi)臟脂肪的增加會導致慢性炎癥增加，從而加重IR，隨著內(nèi)臟脂肪的增加，疾病易感性上升。有一項研究報告指出了內(nèi)臟肥胖與年齡、空腹血糖水平、血脂、血壓和性別之間存在相關性，其中年齡的增加與內(nèi)臟脂肪增量密切相關[11]。衰老和肥胖是大多數(shù)心血管疾病的危險因素，會增加個體患2型糖尿病、脂肪肝、血脂異常、高血壓等疾病的風險[12]，伴隨老年肥胖人群成為了上述疾病的易感群體，有的老年肥胖患者可能同時患有上述幾種疾病。運動作為一種科學有效的減肥方法，已經(jīng)廣泛應用于肥胖患者的治療處方中。Keating[13]等人的研究表明，不同運動量和運動強度都能有效降低內(nèi)臟脂肪，雖然有些運動方式對體重影響不明顯，但是內(nèi)臟脂肪都會隨著運動時間的延續(xù)而明顯下降。本實驗室前期研究證實，運動處方能顯著降低超重肥胖男女大學生BMI、體脂及腰臀比，改善身體形態(tài)[14]，8周運動可以導致大鼠的內(nèi)臟脂肪量顯著下降[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導的老年肥胖大鼠體重、內(nèi)臟脂肪明顯增多，在接受運動處方干預后，老年肥胖大鼠的體重和內(nèi)臟脂肪量均下降明顯，且運動后的內(nèi)臟脂肪量與對照組老年大鼠相似，而老年大鼠減重效果不明顯，但內(nèi)臟脂肪量顯著下降，可能是老年大鼠本身不肥胖，運動僅僅減去了老年大鼠的內(nèi)臟脂肪。運動對老年肥胖大鼠的體重減輕和內(nèi)臟脂肪的消除有很好的影響，對老年大鼠內(nèi)臟脂肪的消除也有很好的影響，說明運動對老年和老年肥胖人群的健康十分有益。

3.2 運動對老年大鼠和老年肥胖大鼠Resistin的影響

Resistin在2001年由Steppan[2]等人首次描述，它首先在脂肪組織中被發(fā)現(xiàn)，因為其直接參與IR作用而命名。隨后Moon[15]等人重組了老鼠Resistin，發(fā)現(xiàn)飲食誘導的小鼠和基因肥胖小鼠會糖耐量受損，阻斷Resistin會改善肥胖小鼠的血糖濃度和葡萄糖耐受量，證實了Resistin過量表達會增加肥胖和IR的患病風險。Shuldiner[16]等人研究認為Resistin對胰島素敏感性和葡萄糖轉運影響較大，是肥胖導致IR的直接原因。但隨著研究的深入，人們對Resistin與IR的關系產(chǎn)生質(zhì)疑。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，8周運動處方減肥效果明顯，但Resistin水平變化不明顯，Resistin與女大學生的體重、體脂和BMI無相關性，與男女大學生的血糖也無相關性[17]。Koebnick[4]對肥胖受試者進行4個月的減肥干預后，發(fā)現(xiàn)人的Resistin是不可缺少的，Resistin參與調(diào)節(jié)胰島素敏感性，是脂代謝的調(diào)節(jié)因子，維持脂肪組織的儲存，誘導脂肪酸再酯化，隨著受試者的體重與肥胖指標得到改善，血漿Resistin濃度上升。De Luis[18]等人通過對重度肥胖患者減肥手術后隨訪一年發(fā)現(xiàn)，患者的體重、腰圍、體脂率、血壓、總膽固醇均明顯下降，但甾醇、低密度脂蛋白、膽固醇、甘油三酯水平無明顯變化，且Resistin水平在術后小幅度上升。Olszanecka[19]等人對比了19名肥胖受試者與22名正常受試者后發(fā)現(xiàn)，Resistin在肥胖和正常受試者中沒有相關性，提示Resistin與肥胖沒有直接關系。Baris[20]等對3000多老年人進行10個月的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)Resistin與代謝炎癥標志物C反應蛋白(C-Reactive protein，CRP)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF-α)和IL-6關系不大，提示Resistin與炎癥也沒有直接關系。Hayashino[21]等人研究發(fā)現(xiàn)，運動使2型糖尿病(Type 2 diabetes，T2D)患者的IL-6和CRP降低，且隨著運動持續(xù)時間延長，IL-6和CRP水平下降更明顯，但Resistin、瘦素等脂肪因子的水平?jīng)]有發(fā)生變化。本研究顯示，老年大鼠與老年肥胖大鼠Resistin的mRNA表達和血漿濃度沒有差異，提示Resistin作為一個脂肪因子可能并不參與老年肥胖進程，Resistin的生理功能有待進一步研究。運動處方能明顯升高老年大鼠Resistin的mRNA表達，對老年大鼠及老年肥胖大鼠血漿濃度影響不明顯，運動對Resistin的影響結果存在不一致性，具體原因有待進一步研究。

3.3 運動對老年大鼠和老年肥胖大鼠Visfatin的影響

Visfatin是一種脂肪細胞因子，在脂肪細胞和免疫細胞中表達。先前的一些研究認為Visfatin與肥胖關系密切，血漿Visfatin在肥胖和T2D患者中表達增加，被認為是有害的，但是具體的生理作用機制還不完全清楚[3]。盡管大多數(shù)實驗研究都指向Visfatin的有害作用，但近年來，有些研究表明Visfatin可能是正常生理活動中必不可少的蛋白。Kim[5]等人切除糖尿病大鼠部分胰腺后，血漿Visfatin沒有發(fā)生變化，而中樞Visfatin增多改善了糖尿病大鼠下丘腦的胰島素分泌和胰島素敏感性，維持血糖穩(wěn)態(tài)，證實中樞Visfatin是一種調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)的正向調(diào)節(jié)劑。Hallschmid[22]等人對38名受試者進行分析，發(fā)現(xiàn)腦脊液中存在Visfatin，且腦脊液的Visfatin水平隨著體重增加而降低。Ingelsson[23]等人調(diào)查了374名社區(qū)居民，發(fā)現(xiàn)Visfatin水平與年齡和甘油三酯水平無關，與臨床用于檢測內(nèi)臟脂肪的指標也沒有顯著相關性，同時與血脂異常、肥胖以及糖尿病也無明顯關系。Ersoy[24]等人研究發(fā)現(xiàn)女性的Visfatin與脂肪分布沒有關系，Visfatin與肥胖參數(shù)BMI、腰臀比和IR沒有相關性，與血脂參數(shù)之間也沒有相關性。Dimitriadis[25]等人重組了小鼠的Visfatin后發(fā)現(xiàn)，Visfatin增加了分化的T37i細胞的表達，上調(diào)末端結合蛋白1，末端結合蛋白2和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7，通過激活IL-6/STAT3通路阻止巨噬細胞的凋亡。Lim[26]等人通過誘導小鼠心肌缺血，再給該小鼠心肌注射Visfatin發(fā)現(xiàn)能明顯減少心肌梗死面積，可能機制為Visfatin在心肌再灌注時是通過激活PI3K/Akt和MEK1/2和抑制MPTP開放而介導的直接細胞效應來保護心肌的。Veer[27,28]等人發(fā)現(xiàn)Visfatin是一種調(diào)節(jié)輔酶I生物合成、輔酶I依賴性蛋白去乙?；?、血管平滑肌細胞生存能力的細胞內(nèi)蛋白，能夠防止小鼠神經(jīng)元突變，Visfatin的增多能夠促進血管平滑肌細胞的存活，激活SIRT2；他的另一項研究將Visfatin基因導入衰老的人平滑肌細胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Visfatin可以延緩衰老，延長細胞壽命，增加細胞抵抗氧化應激的能力，Visfatin通過降低p53在SIRT1的靶標賴氨酸382上乙?；谋壤?，抑制了細胞衰老，說明Visfatin可通過優(yōu)化SIRT1介導的p53降解來增加人血管平滑肌細胞的壽命。Plinta[29]等人對50名青年職業(yè)籃球和手球運動員在集訓期的研究發(fā)現(xiàn)，3個月的密集速度訓練會使Visfatin水平上升。本研究顯示，老年大鼠與老年肥胖大鼠Visfatin mRNA表達和血漿Visfatin濃度差異不明顯，沒有發(fā)現(xiàn)Visfatin可以促進肥胖；本運動處方對老年大鼠與老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織Visfatin mRNA表達和血漿Visfatin濃度影響甚微，可能是由于Visfatin在老年大鼠和老年肥胖內(nèi)臟脂肪組織和血漿中含量過低導致的，具體原因有待進一步研究。

綜上所述，本運動處方能夠降低老年大鼠和老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪量以及內(nèi)臟脂肪率，具有顯著減肥效果。老年大鼠和老年肥胖大鼠的Resistin和Visfatin mRNA表達及血漿Resistin和Visfatin濃度差異不明顯，Resistin和Visfatin對老年肥胖的發(fā)生發(fā)展影響較小，運動僅對老年大鼠內(nèi)臟脂肪組織Resistin mRNA表達有影響。運動對老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織Resistin和Visfatin mRNA表達及血漿濃度影響甚微，可能是Resistin和Visfatin本身在老年肥胖大鼠中含量較少，Resistin和Visfatin在老年肥胖的發(fā)生發(fā)展中影響較小導致的，具體機制有待進一步研究。