康文翠，林 顥，左 敏，王 卓，段雅嫻，陳全勝，林金金

江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

引 言

小麥在儲(chǔ)運(yùn)過程中其抗霉性差，極易在儲(chǔ)藏不當(dāng)?shù)那闆r下感染霉菌發(fā)生霉變[1-2]，不僅造成巨額經(jīng)濟(jì)損失，甚至還產(chǎn)生真菌毒素，嚴(yán)重威脅人畜健康。糧食上的霉菌種類多樣，曲霉屬和青霉屬是最常見的菌群[3]，也是造成糧食損失最為關(guān)鍵的兩種菌類群。常規(guī)儲(chǔ)藏糧食條件的初期，田間型霉菌如鏈隔抱霉、鐮刀菌、螺孢霉、枝抱霉等的數(shù)量會(huì)以較快的速率下降，在霉菌總數(shù)中所占的比例大大減少。當(dāng)局部有少量的水分升高時(shí)，會(huì)首先達(dá)到灰綠曲霉、白曲霉、黑曲霉等這些干生型霉菌生長的條件，這些霉菌會(huì)率先生長[4]。在貯藏過程中發(fā)生不同霉變程度的小麥，某些霉菌會(huì)產(chǎn)生不同類型和含量比例的揮發(fā)性氣體，例如灰綠曲霉和白曲霉的代謝會(huì)產(chǎn)生以醇酮醛等為主的有機(jī)化合物，使得小麥帶有霉腐味和酸敗味[5]。感染霉菌后的小麥會(huì)逐漸揮發(fā)出各種特異性的有機(jī)氣體，通過對(duì)揮發(fā)性氣體的檢測(cè)分析來判別霉變狀況是小麥霉變感染檢測(cè)的一個(gè)重要途徑。Anna Müller[6]通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)檢測(cè)分析不同谷物霉菌菌種的揮發(fā)性物質(zhì)，并利用PCA法建立模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同菌種的揮發(fā)性物質(zhì)之間存在著一定的差異。Olsson[7]等將氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合電子鼻技術(shù)，定量檢測(cè)大麥樣品在自然霉變過程中麥角固醇含量和相應(yīng)的霉菌菌落總數(shù)，基此建立的偏最小二乘模型(PLS)具有良好的預(yù)測(cè)麥角固醇含量能力。Campos使用GC-MS測(cè)得發(fā)霉的小麥會(huì)產(chǎn)生多種揮發(fā)性有機(jī)氣體，如醇類，醛類，呋喃類，酮類，單萜類以及含氮和含硫化合物等[8]。

近紅外光譜是一種有效快速檢測(cè)分析有機(jī)成分的檢測(cè)技術(shù)，近年來在農(nóng)產(chǎn)品的成分檢測(cè)上[9-10]，取得較好的檢測(cè)結(jié)果。本研究開發(fā)一種以納米化色敏傳感器捕獲揮發(fā)氣體為中間介質(zhì)的可見/近紅外光譜技術(shù)檢測(cè)霉菌感染的小麥新方法。以霉菌感染的小麥為研究對(duì)象，以納米化處理過的色敏傳感器作為中間介質(zhì)捕獲感染特定霉菌后的特征揮發(fā)氣體，采用可見/近紅外光譜檢測(cè)分析揮發(fā)氣體與納米色敏傳感結(jié)合前后的可見和近紅外區(qū)域光譜變化特征，結(jié)合多變量分析模型預(yù)測(cè)小麥的霉菌菌落數(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 霉菌感染小麥樣本的制作

樣品選取新鮮優(yōu)質(zhì)山東小麥種子“魯農(nóng)116”品種。感染了兩種霉菌綠曲霉和白曲霉的不同霉變程度小麥的制備主要是通過調(diào)控接種一定量霉菌的小麥在生化培養(yǎng)箱中的貯藏時(shí)間來實(shí)現(xiàn)的，具體操作包括： 活化與培養(yǎng)霉菌，對(duì)小麥滅菌并調(diào)節(jié)水分和給小麥接種霉菌。

1.2 色敏傳感-可見/近紅外光譜系統(tǒng)

采用自主搭建的近紅外光譜檢測(cè)系統(tǒng)，如圖1所示，該系統(tǒng)的硬件主要包括色敏傳感器、近紅外光纖探頭、鹵素?zé)舻墓庠?、SONY公司的線陣CCDILX554B的光譜儀，便攜式近紅外光譜儀以及收集處理數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)。

圖1 近紅外-納米色敏傳感器檢測(cè)系統(tǒng)Fig.1 Visible/near-infrared combined with nanoscaledcolorimetric sensor array detection system

光源選用的是鹵素?zé)艨筛采w整個(gè)可見光直至近紅外光譜區(qū)，照射性能穩(wěn)定且顯色較好； 光譜儀采用的是索尼公司(SONY)的CCDILX554B線陣，能夠檢測(cè)的光譜范圍為300～1 000 nm，可獲取近紅外的光譜波段。近紅外-色敏傳感器系統(tǒng)的檢測(cè)原理，是通過獲取與感染了霉菌的小麥的揮發(fā)性有機(jī)氣體反應(yīng)后的傳感器的近紅外光譜，即通過近紅外光譜檢測(cè)色敏傳感器的顯色差異來探知小麥的霉變情況。

1.3 色敏傳感-可見/近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集

利用近紅外-納米色敏傳感器檢測(cè)系統(tǒng)獲取納米色敏傳感器與霉變小麥反應(yīng)后的光譜數(shù)據(jù)。以灰綠曲霉為例，用電子天平分別稱量25 g新鮮小麥、貯藏3，5，7和9 d的霉變小麥樣本，將上述制備好的傳感器正面朝上地固定在保鮮膜上并將保鮮膜密封于稱量瓶口并用皮筋固定好，待傳感器與霉變小麥揮發(fā)性氣體反應(yīng)達(dá)到平衡取出傳感器； 最后用近紅外光譜裝置獲取反應(yīng)之后納米色敏傳感器的光譜數(shù)據(jù)。由于色敏傳感器是固體板狀，采集的是光譜的反射率，這樣可以避免樣本大小、形狀、密實(shí)度和均勻度等不同造成的偶然誤差。在平均次數(shù)為5次，平滑點(diǎn)數(shù)為5，積分時(shí)間為20 ms下分別獲取與霉變小麥揮發(fā)性氣體反應(yīng)后的各個(gè)傳感器單元的光譜信息，獲得的光譜數(shù)據(jù)中共有1 799個(gè)變量。

圖2 NO2BDP傳感器反應(yīng)前后的光譜圖Fig.2 Spectra of NO2BDP sensor before and after response

按照上述步驟采集與小麥霉變特征揮發(fā)性物質(zhì)反應(yīng)前后的色敏傳感器的可見-近紅外光譜，如圖2所示，色敏傳感器與小麥特征霉變氣體反應(yīng)之后采集可見-近紅外光譜與反應(yīng)之前的相比，有明顯的變化，反射率有所增加，且在400～500 nm波段內(nèi)，波峰的位置有所左移。

1.4 小麥霉菌數(shù)預(yù)測(cè)模型的建立

首先分別建立了NO2BrBDP、NO2BDP、納米化NO2BrBDP和納米化NO2BDP四個(gè)傳感器單元的光譜與霉菌菌落總數(shù)的聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘法(Si-PLS)模型，從中找出最具代表性的區(qū)間。為了提高傳感器的整體檢測(cè)性能，整合各個(gè)傳感器單元中的最佳光譜數(shù)據(jù)構(gòu)成新的光譜段。采用GA和UVE兩種不同的變量篩選算法進(jìn)一步篩選各個(gè)聯(lián)合傳感器的光譜數(shù)據(jù)，建立GA-Si-PLS檢測(cè)模型和UVE-Si-PLS檢測(cè)模型。從而確定檢測(cè)帶菌小麥中灰綠曲霉和白曲霉的菌落總數(shù)的最佳模型。

1.5 霉菌菌落平板計(jì)數(shù)檢測(cè)法

霉菌菌落總數(shù)的測(cè)定方法參照國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.15—2016中的“食品微生物學(xué)試驗(yàn)霉菌與酵母菌數(shù)(GB 4789.15—2016)”。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種霉菌感染小麥的菌落總數(shù)的測(cè)定

將完成灰綠曲霉霉菌和白曲霉霉菌接種的小麥分別在30 ℃，90%濕度的無菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)第3，5，7和9 d分別取樣，對(duì)統(tǒng)計(jì)的菌落總數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)處理。

圖3(a)為接種灰綠曲霉的小麥菌落總數(shù)的變化規(guī)律，圖3(b)為白曲霉的菌落總數(shù)的變化規(guī)律。從圖中可以看出，當(dāng)兩種帶菌小麥各自在培養(yǎng)箱培養(yǎng)到第3 d，兩種霉菌菌落總數(shù)開始持續(xù)顯著提升，在培養(yǎng)5 d左右后，總數(shù)增長的速度均達(dá)到最快。繼續(xù)培養(yǎng)到第7～9 d時(shí)，灰綠曲霉的菌落總數(shù)增長趨于平緩，白曲霉的也呈現(xiàn)一定的平緩趨勢(shì)，可能還會(huì)有一定程度的漲幅。

圖3 帶菌小麥中的霉菌菌落總數(shù)變化規(guī)律Fig.3 Change rule of the total number of coloniesof mildew wheat

2.2 霉菌感染小麥的色敏傳感-可見/近紅外光譜分析

納米化色敏材料能夠有效地增大與介質(zhì)襯底結(jié)合交界處的比表面，有利于色敏粒徑均勻分布，從而有助于提高色敏介質(zhì)襯底與氣體分子的結(jié)合力，為高靈敏度的傳感器的制作提供基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步探究納米化色敏材料和非納米材料在制成傳感器后的區(qū)別，分別測(cè)定了兩者的紫外-可見光譜。圖4是納米化色敏材料(nano-NO2BDP)和非納米分散色敏材料(NO2BDP)的紫外-可見光譜圖?？梢钥闯?，兩種光譜在紫外可見區(qū)域均具有特征吸收，具有一個(gè)相同的λmax值507 nm，但各自顯示出不同的吸光度值，其中NanoNO2BDP在507 nm處的吸光度為1.54，NO2BDP的吸光度為0.73。此外，NanoNO2BDP的R帶和K帶吸收峰都發(fā)生劈裂及變寬現(xiàn)象，這種現(xiàn)象具有增色效果。

將上述制備好的納米化色敏傳感器用于對(duì)不同霉變程度小麥(新鮮小麥、貯藏3，5，7，9 d的霉變小麥)揮發(fā)性物質(zhì)信息的捕捉，如圖5(a)是感染了不同霉菌灰綠曲霉的小麥及對(duì)其揮發(fā)物質(zhì)捕捉的圖片，從圖中可看出，隨著貯藏時(shí)間的延長，感染了灰綠曲霉的小麥霉變程度在逐漸加深，小麥表面的霉菌在不斷第滋生。霉變一個(gè)星期之后，由平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定小麥中灰綠曲霉總數(shù)達(dá)到6.99 lgcfu·g-1，此時(shí)小麥表面上生長得霉菌清晰可見。利用納米化色敏傳感器檢測(cè)小麥霉變過程中的揮發(fā)性氣體的變化，通過Matlab軟件計(jì)算傳感器反應(yīng)前后的顏色變化差值圖，得到不同貯藏時(shí)間的該色敏傳感器陣列與其反應(yīng)后均有肉眼可見的顏色變化，說明該傳感器能夠有效地鑒別出不同霉變程度的小麥。之后用可見-近紅外光譜系統(tǒng)采集納米化色敏傳感器反應(yīng)之后的信息，納米化色敏傳感器(NanoNO2BrBDP)與感染了灰綠曲霉的小麥在不同貯藏時(shí)間的光譜變化信息如圖5(b)所示。由圖中的光譜圖可以發(fā)現(xiàn)，含有不同霉菌菌落總數(shù)的光譜有著相似的整體趨勢(shì)，其反射率在波長400～500 nm內(nèi)都有一個(gè)波峰，之后均會(huì)有一個(gè)急增，當(dāng)波長達(dá)到600 nm時(shí)，采集的反射率呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢(shì)。且隨著霉菌的增多，在同一波段范圍內(nèi)，由傳感器獲得的近紅外光譜的反射率在逐漸增大，這表明不同霉變程度的小麥可以通過納米化色敏傳感器捕捉到揮發(fā)性氣體變化特征，此特征可以通過可見-近紅外光譜技術(shù)檢測(cè)到相關(guān)規(guī)律。

圖4 色敏材料在CCl2溶液中的紫外和可見吸收光譜Fig.4 Ultraviolet and visible absorption spectraof the dyes in CCl2 solution

圖5 感染灰綠曲霉的不同霉變程度小麥的傳感器響應(yīng)(a)和可見-近紅外光譜(b)

Fig.5 Sensor response (a) and spectra (b) of sensor affected by the wheat infectedAspergilluswith different moldy degrees

圖6 檢測(cè)灰綠曲霉霉菌菌落總數(shù)的最優(yōu)Si-UVE-PLS模型(a)： UVE算法篩選結(jié)果；(b)： 霉菌菌落總數(shù)實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值散點(diǎn)圖Fig.6 Optimal Si-UVE-PLS model of the total numberof Aspergillusglaucus colonies(a)： Result of variables selection by UVE；(b)： Scatter plot of measured and prediction values

2.3 霉菌菌落檢測(cè)模型的建立

2.3.1 灰綠曲霉感染后菌落總數(shù)預(yù)測(cè)模型的建立

利用同一次區(qū)間劃分中精度較高的幾個(gè)子區(qū)間建立起一種預(yù)測(cè)樣本指標(biāo)的Si-PLS模型，為了進(jìn)一步提高檢測(cè)灰綠曲霉菌落總數(shù)的精度，考慮聯(lián)合同類傳感器單元以聯(lián)合其通過Si-PLS篩選出的相應(yīng)的光譜的特征區(qū)間，先后建立Si-GA-PLS模型和UVE-GA-PLS模型，結(jié)果見附件表1。比較所有的預(yù)測(cè)模型，發(fā)現(xiàn)以納米化NO2BrBDP+納米化NO2BDP的2X1式傳感器基礎(chǔ)所建立的Si-UVE-PLS模型為最佳預(yù)測(cè)霉變小麥中灰綠曲霉菌落總數(shù)的模型。該模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相關(guān)性散點(diǎn)圖見圖6。在最佳模型下主成分?jǐn)?shù)為10時(shí)，訓(xùn)練集的RMSECV最小，為0.423 6 lgcfu，預(yù)測(cè)集的RMSEP為0.444 4 lgcfu； 訓(xùn)練集中的灰綠曲霉菌落總數(shù)的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)Rc為0.978 3，預(yù)測(cè)集中的相關(guān)系數(shù)Rp為0.981 1。

2.3.2 白曲霉感染后菌落總數(shù)預(yù)測(cè)模型的建立

同樣地，為建立預(yù)測(cè)性能較好的檢測(cè)白曲霉菌落總數(shù)的模型通過對(duì)比模型預(yù)測(cè)結(jié)果見附件表2，選用NO2BrBDP+NO2BDP+納米化NO2BrBDP+納米化NO2BDP的2X2式傳感器，根據(jù)其采集的光譜信息建立的Si-GA-PLS模型為最佳選擇。該模型的結(jié)果如圖7，訓(xùn)練集的RMSECV為0.434 9 lgcfu，霉菌菌落總數(shù)的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相關(guān)系數(shù)Rc為0.980 1； 預(yù)測(cè)集中，RMSEP為0.655 45 lgcfu,Rp為0.977 2。

圖7 檢測(cè)白曲霉霉菌菌落總數(shù)的最優(yōu)Si-GA-PLS模型(a)： GA算法曬選結(jié)果；(b)： 霉菌菌落總數(shù)實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值散點(diǎn)圖Fig.7 Optimal Si-GA-PLS model of the total number ofAspergillus candidus colonies(a)： Result of variables selection by GA；(b)： Scatter plot of measured and prediction values

3 結(jié) 論

以灰綠曲霉和白曲霉為感染小麥的目標(biāo)菌種，分別接種至無菌小麥中以培養(yǎng)出不同帶菌量(灰綠曲霉菌和白曲霉菌)的小麥樣本，按照國標(biāo)法對(duì)含兩種霉菌的各個(gè)樣本進(jìn)行菌落總數(shù)的測(cè)定。以NO2BrBDP、NO2BDP、納米化NO2BrBDP和納米化NO2BDP構(gòu)建傳感器，結(jié)合可見/近紅外技術(shù)采集不同帶菌量的各個(gè)小麥樣本的光譜信息，并對(duì)光譜信息進(jìn)行變量篩選，從而分別建立灰綠曲霉和白曲霉菌落總數(shù)的定量預(yù)測(cè)模型。利用納米化色敏傳感器技術(shù)以及可見/近紅外光譜分析技術(shù)分別完成了對(duì)小麥中灰綠曲霉和白曲霉的菌落總數(shù)的定量分析。