周添標(biāo) 鐘紅珍 鐘志青 謝偉基 翁文娟

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東省汕頭市 515041，電子郵箱：zhoutb@aliyun.com)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)是導(dǎo)致終末期腎病的共同病理變化，目前其發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，缺乏有效的治療手段及藥物[1]。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是維生素A的衍生物之一，其在體內(nèi)通過維甲酸受體(retinoic acid receptor,RAR)發(fā)揮作用，目前發(fā)現(xiàn)RAR有3種，分別是RARα、RARβ和RARγ[2]。阻抑素是一種抗增殖蛋白，目前發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)控細(xì)胞分化及參與細(xì)胞線粒體呼吸鏈的作用及功能[3-4]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，阻抑素參與細(xì)胞外基質(zhì)的積聚和RIF的發(fā)病過程，而ATRA可以通過調(diào)控阻抑素的表達(dá)而發(fā)揮抗RIF的作用[5-6]，但具體的作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討ATRA是否可通過RARα調(diào)控阻抑素表達(dá)，從而發(fā)揮延緩RIF進(jìn)展的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只無特定病原體級(jí)雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量120～150 g，購(gòu)于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2017-0017]。所有大鼠常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 EliVisionTMplus廣譜檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)公司(批號(hào)：KIT-9902)；RARα、阻抑素、Ⅳ型膠原蛋白(collagen Ⅳ,ColⅣ) 和纖維連接蛋白(fibronectin,FN)抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(批號(hào)依次為ab28767、ab75766、ab236640、ab2413)；TRIzolTMLS Reagent試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司(貨號(hào)：10296010)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司(貨號(hào)：RR047A)。Vectra成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司；ABI 7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司。

1.3 RIF模型建立及干預(yù)方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為ATRA組﹑RIF模型組和假手術(shù)組，每組12只。腹腔注射濃度為30 mL/L的水合氯醛(30 mL/kg)麻醉大鼠后，RIF模型組和ATRA組，在大鼠左背側(cè)做長(zhǎng)約3 cm左右的切口，然后暴露腎臟，使用棉簽尋找并鈍性分離左側(cè)輸尿管，在腎盞和腎下極處采用3-0絲線分別結(jié)扎輸尿管，并離斷輸尿管，術(shù)畢縫合肌肉及皮膚；假手術(shù)組大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后開腹只探及腎包膜。從術(shù)前第1天開始，ATRA組大鼠給予ATRA灌胃[15 mg/(kg·d)]，1次/d，其余兩組大鼠采用等量生理鹽水灌胃，直至處死。分別在造模后第2周末及第4周末，每組各處死6只大鼠，摘取左側(cè)腎臟組織分成兩份，其中一份采用100 ml/L的甲醛溶液固定用于病理及免疫組化檢測(cè)，另一份于液氮中速凍后，置于-80℃冰箱中用于mRNA檢測(cè)。

1.4 腎臟組織病理檢查 采用常規(guī)石蠟包埋方法制作標(biāo)本，切片厚3 μm，行Masson染色后，顯微鏡下觀察腎臟組織的病理改變情況。隨機(jī)選擇腎間質(zhì)區(qū)域20個(gè)視野(400倍)，計(jì)算RIF指數(shù)[7]，RIF指數(shù)(%)=(纖維化面積/腎小管間質(zhì)總面積)×100%。

1.5 檢測(cè)腎臟組織中RARα、阻抑素、ColⅣ和FN的蛋白表達(dá) 按照EliVisionTMplus廣譜檢測(cè)試劑盒說明書，采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)[8]。石蠟切片放置在60℃溫箱中烘烤3 h，采用二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后，使用自來水沖洗，磷酸緩沖鹽溶液(0.1 mol/L)沖洗3次，3 min/次；采用檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)對(duì)腎臟組織抗原進(jìn)行高溫高壓修復(fù)10 min，室溫冷卻20 min后，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3 min/次；滴加3%過氧化氫溶液，常溫孵育10 min以封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3 min/次；滴加兔抗大鼠RARα(1 ∶300)、阻抑素(1 ∶200)、ColⅣ(1 ∶100)及FN(1 ∶100)抗體，4℃孵育過夜，常溫復(fù)溫30 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3min/次；滴加聚合物增強(qiáng)劑(試劑A)，室溫下孵育20 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3 min/次；滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3 min/次；滴加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺顯色劑；蘇木素復(fù)染(約15 s)，0.1%鹽酸酒精分化，后使用磷酸緩沖鹽溶液返藍(lán)；自來水沖洗，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。同時(shí)用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作為陰性對(duì)照。隨機(jī)選擇腎間質(zhì)區(qū)域20個(gè)視野(400倍)，盡量避開大血管，選擇黃色區(qū)域?yàn)楸磉_(dá)區(qū)域，采用Vectra成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。分別統(tǒng)計(jì)3組切片陽性反應(yīng)的平均吸光度(A)值。

1.6 檢測(cè)腎臟組織中RARα和阻抑素mRNA的表達(dá) 從-80℃冰箱中取50 mg的新鮮冰凍腎臟組織，采用TRIzolTMLS Reagent試劑盒提取組織的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)A260、A280值及其比值，并計(jì)算RNA含量，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA的完整性和是否有降解，確定RNA完整后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。冰上充分溶解反轉(zhuǎn)錄試劑盒中相關(guān)試劑后行下列操作：PCR管中加入總RNA 0.3 μg,Oligo(dT)Primer 1 μL,再加無RNA酶水至12 μL,置于65℃下孵育5 min；然后在各個(gè)PCR管中加入2 μL 10 mmol/L dNTP混合物、4 μL 5×反應(yīng)緩沖液、1 μL RevertAidTMM-MuLv和1 μL核糖核酸酶抑制劑，反應(yīng)體系總體積20 μL，PCR儀上42℃ 60 min、70℃ 5 min完成返轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。將cDNA放置于-20℃冰箱中貯存和備用。根據(jù)TakaRa公司生產(chǎn)的PCR反應(yīng)體系(貨號(hào)：RR820A)配置反應(yīng)體系。反應(yīng)體系(20 μL)：cDNA 1 μL,PCR上游引物(10 μM)0.5 μL,PCR下游引物(10 μM)0.5 μL，2.5×RealMasterMix/SYBR溶液9 μL，超純水9 μL。 PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性時(shí)間為95℃ 10 min，變性68℃ 15 s，退火60℃ 30 s，延伸68℃ 30 s，循環(huán)數(shù)設(shè)定為40。于ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，引物由上海生工公司設(shè)計(jì)和合成。RARα上游引物為5′-ATGTTCCCCAAGATGCTGAT-3′，下游引物為5′-CTGTCCGCTTAGAGTGTCCAA-3′；阻抑素：上游引物為5′-AAGCAGAGAGAGCCAGATTTGT-3′，下游引物為5′-TGATAAGCAATGTCCTCAGCAG-3′；β肌動(dòng)蛋白：上游引物為5′-GCCCCTGAGGAGCACCCTGT-3′，下游引物為5′-ACGCTCGGTCAGGATCTTCA-3′。采用相對(duì)定量2-△△Ct法[9]計(jì)算RARα、阻抑素mRNA的相對(duì)表達(dá)量，其中△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，△△Ct=△Ct(試驗(yàn)組)-△Ct(對(duì)照組)。以假手術(shù)組為對(duì)照組，其各目的基因mRNA表達(dá)量為1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)；采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠的RIF指數(shù)比較 Masson染色顯示，腎小管及腎間質(zhì)細(xì)胞胞漿、肌纖維染為紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色，膠原纖維則染為綠色為陽性。RIF模型組腎間質(zhì)綠色陽性面積較假手術(shù)組明顯增大，說明RIF模型構(gòu)建成功。造模后的第2周末和第4周末，假手術(shù)組、ATRA組、RIF模型組的RIF指數(shù)依次升高(均P<0.05)；在ATRA組、RIF模型組，第4周末的RIF指數(shù)均高于第2周末(均P<0.05)。見圖1和表1。

表1 3組大鼠的RIF指數(shù)比較(x±s，%)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與RIF模型組比較，&P<0.05。

圖1 3組大鼠腎臟組織Masson染色結(jié)果(×400)

2.2 3組大鼠腎小管間質(zhì)ColⅣ和FN蛋白表達(dá)水平比較 造模后的第2周末和第4周末，假手術(shù)組、ATRA組、RIF模型組的ColⅣ和FN蛋白相對(duì)表達(dá)水平依次升高(均P<0.05)；在ATRA組、RIF模型組，第4周末的ColⅣ和FN蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于第2周末(均P<0.05)。見圖2～3和表2。

表2 3組大鼠腎小管間質(zhì)ColⅣ和FN蛋白的相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與RIF模型組比較，&P<0.05。

圖2 3組大鼠腎臟組織ColⅣ蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

圖3 3組大鼠腎臟組織FN蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

2.3 3組大鼠腎臟組織RARα、阻抑素蛋白和mRNA的表達(dá)水平比較 造模后的第2周末和第4周末，假手術(shù)組、ATRA組、RIF模型組的RARα、阻抑素的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)；在ATRA組、RIF模型組，第4周末RARα、阻抑素的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于第2周末(均P<0.05)。見表3～4及圖4～5。

表3 3組大鼠腎臟組織RARα及阻抑素蛋白的相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與RIF模型組比較，&P<0.05。

表4 3組大鼠腎臟組織RARα及阻抑素mRNA的相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與RIF模型組比較，&P<0.05。

圖4 3組大鼠腎臟組織RARα蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

圖5 3組大鼠腎臟組織阻抑素蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

2.4 相關(guān)性分析 模型組中，第2、4周末時(shí)，RARα蛋白表達(dá)水平與阻抑素蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.776，P=0.001；r=0.896，P=0.001)；RAR α蛋白表達(dá)水平與RIF指數(shù)、ColⅣ蛋白和FN蛋白表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.823、-0.845、-0.875，P=0.001、0.001、0.001；r=-0.889、-0.879、-0.816，P=0.001、0.001、0.001)。

3 討 論

ATRA是維生素A重要的一種衍生物，目前有不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)其具有抗細(xì)胞外基質(zhì)積聚及抗纖維化的作用[10-12]，但其抗RIF的機(jī)制尚不明確。部分研究表明ATRA可以發(fā)揮腎臟保護(hù)性作用。如Zhang等[13]通過阿霉素構(gòu)建腎小球硬化大鼠模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ATRA可能通過抑制瞬時(shí)受體電位陽離子通道6的表達(dá)，起到延緩腎小球硬化的作用。Tamaki等[14]對(duì)糖尿病腎病小鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ATRA可能通過RARα抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的表達(dá)，發(fā)揮減輕糖尿病小鼠腎小球基質(zhì)積聚的作用。Liu等[15]通過5/6腎臟組織切除方法構(gòu)建腎小球硬化大鼠模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)ATRA治療后腎小球硬化大鼠腎臟組織纖溶酶原激活物抑制劑-1和α平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)下降，腎小球硬化延緩，腎功能得到改善。本研究進(jìn)一步探討ATRA是否可通過RARα調(diào)控阻抑素的表達(dá)，起到延緩RIF的作用。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，RIF模型組大鼠腎臟組織RIF指數(shù)、ColⅣ和FN蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，且第4周末的水平均高于第2周末，說明該組大鼠的RIF在進(jìn)展；而RIF模型組RARα、阻抑素的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較假手術(shù)組下降，且第4周末的水平更低，且RAR α蛋白表達(dá)水平與RIF指數(shù)、ColⅣ蛋白和FN蛋白表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)，這提示RARα可能是RIF的保護(hù)性因子。采用ATRA治療后，雖然第4周末ATRA組大鼠RIF指數(shù)、ColⅣ和FN蛋白表達(dá)亦高于第2周末，但各個(gè)時(shí)間點(diǎn)其水平均較RIF模型組下降(P<0.05)，提示ATRA可延緩大鼠RIF的進(jìn)展。此外，造模后的第2周末和第4周末，ATRA組大鼠RARα、阻抑素的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于RIF模型組，且RIF大鼠的RARα蛋白表達(dá)與阻抑素蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(均P<0.05)，因此我們推測(cè)ATRA可能通過上調(diào)RARα表達(dá)，對(duì)阻抑素表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而發(fā)揮延緩RIF進(jìn)展的作用。

綜上所述， ATRA能抑制RIF大鼠腎臟組織ColⅣ和FN的表達(dá)，同時(shí)，還可能通過上調(diào)RARα表達(dá)，以調(diào)控阻抑素的表達(dá)，從而起到延緩RIF進(jìn)展的作用，但具體機(jī)制有待體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。