王 偉 李桂賢 蘇 攀 徐 晴 鄭超偉 李 敏 文亦磊
(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科,南寧市 530023,電子郵箱:wangweizx@163.com;2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院,南寧市 530001)
潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC) 是一種原因尚不明確的慢性非特異性炎癥性腸病,臨床表現(xiàn)主要有腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重,或發(fā)熱、便秘、體重減輕、貧血等全身癥狀,病情輕重不等,病程遷延并反復(fù)發(fā)作[1]。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的表達(dá)水平對判斷UC的嚴(yán)重程度及預(yù)后具有重要意義[2]。本病屬于中醫(yī)學(xué)的“泄瀉”“痢疾”“腸澼”“休息痢”等范疇。加味柴芍六君顆粒是全國名老中醫(yī)李桂賢教授的驗方,具有疏肝健脾、活血化瘀、清熱止瀉、理氣止痛的功效,是治療UC的較好方法。本課題組前期臨床及實驗研究結(jié)果表明,加味柴芍六君顆粒具有很好的調(diào)節(jié)免疫功能作用,且可緩解UC患者的臨床癥狀,療效顯著[3-5]。在此基礎(chǔ)上,本研究分析不同劑量加味柴芍六君顆粒治療UC的效果及其基于MyD88通路改善UC模型大鼠免疫失衡情況的可能機制。
1.1 實驗動物 SD大鼠60只,雌雄各半,體重為150~250 g,5~6周齡,飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗室內(nèi),飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持(23±2)℃,恒濕(52%~65%),光照黑暗交替12 h,混合飼料喂養(yǎng),自由飲水。新西蘭大白兔4只,雌雄不限,體重(2.5±0.2)kg,6~7周齡為主。實驗動物均購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK桂2009-0002)。
1.2 藥物 (1)加味柴芍六君顆粒組成:柴胡10 g,陳皮6 g,茯苓15 g,白芍15 g,半夏10 g,炒白術(shù)15 g,太子參15 g,三七10 g,鳳尾草20 g,白花蛇舌草20 g,甘草6 g。采用免煎顆粒配方,以上免煎中藥均購自江蘇省江陰市天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的免煎中藥(批號:1209082)。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科分別配制成濃度為0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL的加味柴芍六君顆粒溶液。(2)柳氮磺胺吡啶(salazosulfapyridine,SASP)由上海三維制藥有限公司生產(chǎn)(規(guī)格為250 mg/片,批號:20070312),粉碎過篩,用濃縮甲基纖維素鈉配制成67.5 mg/mL的混懸液。以上藥液配好后裝瓶,4℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 主要試劑 MyD88抗體購自美國Abcam公司(批號:ab131071),辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自Santa Cruz公司購自美國Abcam公司(批號:ab7090),二喹啉甲酸蛋白濃度檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司(批號:P0012S),PageRulerTMPrestained Protein Ladder 購自Fermentas公司(批號:SM0671),BeyoECL Plus超敏電化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天公司(批號:P0018)。
1.4 主要儀器 冷凍高速離心機(型號:TGL-18R)、高速組織勻漿儀(型號:FSH-2A)、可見紫外分光光度計(型號:Aipha1900)、包埋機(型號:TB-718D)、攤片機(型號:HS-1125)、烘箱(型號:BJYSL-DHG-9023A)均購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。TS-1脫色搖床購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司,LG2000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司,AX-Ⅱ X射線攝影暗匣(127 mm×178 mm)購自廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司,AF100制冰機購自Scotsman公司,TGL-18R冷凍高速離心機購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司,DK-8D電熱恒溫水槽購自上海一恒科技有限公司,QL-901旋渦振蕩器購自海門市麒麟醫(yī)用儀器廠,550型酶標(biāo)儀購自日本Advance公司,CK1000組織研磨儀購自Thmorgan公司,磁力攪拌器購自常州澳華儀器有限公司,DK-8D電熱恒溫水槽購自上海一恒科技有限公司。
1.5 建立UC模型 采用隨機數(shù)字表將60只大鼠分為正常組、模型組、SASP組以及中藥大、中、小劑量組,每組10只。除正常組外,其余各組均建立UC模型。參照《藥理實驗方法學(xué)》[6]的方法,采用免疫法制備大鼠UC模型:(1)取新西蘭大白兔結(jié)腸(距肛門10 cm至橫結(jié)腸處)黏膜,與完全福氏佐劑制成抗原乳化液;(2)造模前大鼠禁食24 h,可飲水,于第1、10、17、24、31 天分別在大鼠足跖趾內(nèi)、后腿內(nèi)側(cè)皮下、背部皮下、腹股溝、腹腔內(nèi)各注射抗原1 mL。造模期間,每日觀察大鼠大便、活動等狀況,每3 d測1次糞便潛血,造模時間共40 d。造模結(jié)束后,每組按隨機數(shù)字表法抽取2只大鼠,腹腔注射25%烏拉坦6 mL/kg進行麻醉后剖取結(jié)腸做病理檢查,確認(rèn)存在結(jié)腸充血出血、水腫、小潰瘍形成、炎細(xì)胞浸潤、腺體破壞等病理變化,則造模成功。
1.6 給藥方法 造模成功后,立即給予正常組及模型組3 mL生理鹽水灌胃;SASP組給予SASP混懸液0.3 g/kg灌胃;中藥大、中、小劑量組分別給予濃度為1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL的加味柴芍六君顆粒溶液3 mL灌胃。各組均給藥1次/d,連續(xù)治療4周。
1.7 標(biāo)本采集及處理 各組大鼠給藥4周后,立即給予腹腔注射25%烏拉坦6 mL/kg進行麻醉,斷頭處死。打開腹腔,從肛門以上分離結(jié)腸,截取自肛門向上10 cm的結(jié)腸,沿腸系膜縱軸剪開,用冰生理鹽水反復(fù)沖洗結(jié)腸組織,去除結(jié)腸黏膜表面黏附的糞便、分泌物及血液。在濾紙上將腸黏膜面向上展開,肉眼觀察結(jié)腸黏膜形態(tài)并評分。然后以病灶為中心(除正常組外)縱軸切開,分為兩部分:一部分組織以40 g/L甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色后,進行病理組織切片觀察;另一部分組織經(jīng)濾紙吸干后稱重,置于-70℃冰箱凍存待測。
1.8 觀察指標(biāo)
1.8.1 大鼠一般情況和結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)評估:自造模后每天觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)狀態(tài)、進食量、飲水量等一般情況。處死大鼠后,肉眼觀察各組大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài),評價結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(colon mucosa damage index,CMDI)[7],評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。將結(jié)腸組織進行HE染色后,光鏡下觀察大鼠結(jié)腸黏膜組織。
表1 CSMDI評價標(biāo)準(zhǔn)
1.8.2 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腸黏膜組織MyD88蛋白表達(dá):取大鼠結(jié)腸組織約1 cm,共3小塊,用4%多聚甲醛固定30~60 min,磷酸緩沖鹽溶液洗2次(2 min/次),5℃下進行組織脫水,常規(guī)石蠟包埋,組織切片,厚度4 μm,然后將切片置于載玻片上,并做黏附處理。常規(guī)脫蠟至水,3% 過氧化氫滅活內(nèi)源性酶,切片侵入0.01 mol/L枸櫞酸鹽熱修復(fù)抗原,滴加5%牛血清白蛋白封閉液封閉20 min。滴加一抗(MyD88抗體,稀釋比1 ∶10)37℃標(biāo)記1 h,磷酸緩沖鹽溶液洗滌2~3次。滴加山羊抗小鼠IgG-HRP,20℃~37℃反應(yīng)20 min,磷酸緩沖鹽溶液洗滌4次(5 min/次),二氨基聯(lián)苯胺顯色。蒸餾水洗,脫水、透明、樹脂膠封片,顯微鏡觀測結(jié)果。細(xì)胞中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞表達(dá)。以上步驟均由專業(yè)人員嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,應(yīng)用Image-Pro圖像分析系統(tǒng)測定光學(xué)顯微鏡下所拍圖像中MyD88蛋白陽性區(qū)的灰度,進行半定量分析。
1.8.3 蛋白免疫印記法檢測大鼠腸黏膜組織MyD88蛋白表達(dá):取大鼠結(jié)腸組織剪碎,加入約300 U全細(xì)胞蛋白裂解液(50 mmol/L Tris-HCL+50 mmol/L氯化鈉+1% NP-40裂解液+1 μmmol/L苯甲基磺酰氟+50 HM亮抑蛋白酶肽+100 μmmol/L胰蛋白酶抑制劑溶液),充分裂解結(jié)腸組織后,12 000 g離心3~5 min,取上清液,采用二喹啉甲酸法進行蛋白定量的測定,按照試劑盒說明書進行操作。每孔上樣20 μg總蛋白,行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳;轉(zhuǎn)膜,即聚偏二氟己烯膜4℃過夜,加入一抗MyD88抗體(1 ∶1 000 Tris-HCL緩沖鹽溶液稀釋)室溫孵育2 h,加入二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,濃度為1 ∶4 000)室溫孵育2 h,電化學(xué)發(fā)光顯色。顯影和定影,掃描蛋白印跡條帶。用小型全套蛋白電泳系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)分析各條帶的灰度值,并計算各組MyD88的平均灰度比值。
1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用PEMS 3.2及SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示,多個樣本間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,若方差不齊,采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 各組大鼠一般狀況 模型造模過程中,正常組大鼠食量正常,精神狀態(tài)可,毛發(fā)有光澤無脫落,活動正常,大便正常,無黏液膿血便;模型組及各藥物干預(yù)組大鼠食量逐漸減少,體重逐漸減輕,精神狀態(tài)逐漸變差,毛發(fā)逐漸晦暗少光澤和疏松粗糙,活動逐漸變少,大便開始出現(xiàn)溏爛,逐漸出現(xiàn)黏液膿血便;但經(jīng)藥物干預(yù)后,各藥物干預(yù)組大鼠體重逐漸增加,食量逐漸增加,精神變好,黏液膿血便逐漸消失,大便基本成形。
2.2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學(xué)改變
2.2.1 肉眼觀察:正常組大鼠結(jié)腸黏膜組織腸道無縮短,腸壁黏膜光滑,紋理清晰,腸壁厚度均勻,未見水腫、糜爛及潰瘍;模型組大鼠病變結(jié)腸黏膜表面可見潰瘍,個別深達(dá)肌層,炎癥反應(yīng)較重,有充血、糜爛;與模型組比較,各藥物干預(yù)組大鼠的結(jié)腸黏膜組織病變均有不同程度減輕;而與SASP組比較,各劑量中藥組大鼠結(jié)腸黏膜的出血點、充血、水腫、糜爛、潰瘍數(shù)目均有所減少。正常組CMDI評分均低于其余5組(均P<0.05);各藥物干預(yù)組CMDI評分均低于模型組(均P<0.05);中藥中劑量組CMDI評分均低于其他藥物干預(yù)組(均P<0.05),而其他藥物干預(yù)組之間的CMDI差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。
2.2.2 光鏡下觀察:正常組大鼠結(jié)腸黏膜組織基本完整無缺損,上皮細(xì)胞排列整齊連續(xù),基本無炎癥細(xì)胞浸潤,腺體結(jié)構(gòu)清楚、分泌活躍、分布規(guī)則,黏膜層、黏膜下次、肌層、漿膜層無異常;模型組大鼠結(jié)腸黏膜表面潰瘍形成,少數(shù)深達(dá)肌層,可見大量炎癥細(xì)胞浸潤,黏膜上皮細(xì)胞及腺體部分缺失,黏膜及黏膜下層明顯水腫,杯狀細(xì)胞減少,間質(zhì)隱窩、腸腺及間質(zhì)可見大量急慢性炎癥細(xì)胞浸潤;各藥物干預(yù)組大鼠結(jié)腸黏膜周圍上皮增生修復(fù),杯狀細(xì)胞豐富,基本恢復(fù)正常結(jié)構(gòu),腺體分泌可,黏膜固有層可見少量細(xì)胞浸潤,其中中藥中劑量組黏膜缺損較表淺,修復(fù)好。見圖1。
表2 6組大鼠結(jié)腸黏膜CMDI比較(x±s,分)
注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與中藥中劑量組比較,▲P<0.05。
圖1 6組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)改變(HE染色,400×)
2.3 6組大鼠結(jié)腸黏膜組織MyD88蛋白表達(dá)水平免疫組化檢測結(jié)果比較 免疫組化檢測結(jié)果顯示,MyD88陽性表達(dá)染色呈棕黃色,見于結(jié)腸黏膜表面、下層及固有層細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)中。正常組MyD88蛋白表達(dá)水平均低于其余5組(均P<0.05);各藥物干預(yù)組MyD88蛋白相對表達(dá)水平均低于模型組(均P<0.05);中藥小劑量組、中藥大劑量組、SASP組、中藥中劑量組MyD88蛋白對表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見表3及圖2。
表3 6組MyD88蛋白表達(dá)免疫組化檢測結(jié)果比較(x±s)
注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05; 與中藥小劑量組比較,▲P<0.05;與中藥中劑量組比較,★P<0.05;與中藥大劑量組比較,●P<0.05。
圖2 6組大鼠結(jié)腸黏膜組織MyD88的表達(dá)(ECL染色,400×)
2.4 6組大鼠結(jié)腸黏膜組織MyD88蛋白表達(dá)水平蛋白免疫印記法檢測結(jié)果比較 正常組MyD88蛋白相對表達(dá)水平均低于其余5組(均P<0.05);各藥物干預(yù)組MyD88蛋白相對表達(dá)水平均低于模型組(均P<0.05);中藥小劑量組、中藥大劑量組、SASP組、中藥中劑量組MyD88蛋白對表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見表4及圖3。
表4 6組MyD88蛋白表達(dá)水平蛋白免疫印記法檢測結(jié)果比較(x±s)
注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與中藥小劑量組比較,▲P<0.05;與中藥中劑量組比較,P<0.05;與中藥大劑量組比較,●P<0.05。
圖3 6組凝膠電泳圖
相對于化學(xué)藥物的單一靶點治療作用,中藥復(fù)方成分復(fù)雜,針對病癥具有多組分、多靶點、多通路的整體治療作用[8-10]。在多病因的復(fù)雜慢性疾病治療中,中藥具有西藥無法比擬的巨大優(yōu)勢和良好前景。中醫(yī)藥分期、分型辨證治療UC,多以自擬方、經(jīng)驗方為主,臨床療效顯著,優(yōu)點突出。加味柴芍六君顆粒是全國名老中醫(yī)李桂賢教授多年臨床經(jīng)驗的總結(jié),對UC的治療具有較好的臨床療效。柴芍六君湯出自《醫(yī)宗金鑒》,該方具有較好的疏肝健脾功效。該方實為四逆散和六君子湯化裁而成,取兩者合用以疏肝健脾,并加入白花蛇舌草、鳳尾草清熱利濕止瀉,三七活血祛瘀,陳皮行氣止痛,寓“行血則便膿自愈,調(diào)氣則后重自除”之意,同為佐使藥,甘草調(diào)和諸藥為使藥,諸藥合用,共奏疏肝解郁、理氣健脾、清熱利濕止瀉、活血祛瘀之功。本研究結(jié)果顯示,模型組及各藥物組大鼠的結(jié)腸黏膜均出現(xiàn)不同程度的炎癥性腸病病理變化,且CMDI評分均高于正常組(P<0.05);而經(jīng)干預(yù)后,中藥各劑量組大鼠胃腸道癥狀減輕,其腸黏膜的病理變化亦輕于模型組,且CMDI評分均低于模型組(均P<0.05) 。這提示加味柴芍六君顆粒對UC有較好的療效。此外,中藥中劑量組的CMDI評分低于其他藥物組(P<0.05),提示對于UC大鼠,濃度為0.5 mg/mL的加味柴芍六君顆?;蚓哂懈玫寞熜?,增加用藥劑量可能并不能提高療效。
研究表明,免疫調(diào)節(jié)異常參與了UC的發(fā)病[11]。目前較被認(rèn)可的觀點是,UC是一種非典型的Th2型免疫反應(yīng)異常的疾病[12]。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)主要分布在具有先天性免疫功能的細(xì)胞上,如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞,是重要的介導(dǎo)腸黏膜先天防御反應(yīng)的介質(zhì),在維持腸黏膜和腸道微生態(tài)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。在病理狀態(tài)下,異常的TLR信號通路可能刺激不同的免疫反應(yīng),并導(dǎo)致各種急慢性炎癥[13]。已有研究表明,MyD88是TLR信號通路中的一個關(guān)鍵接頭分子,是信號向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵靶分子,在傳遞上游信息和炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[14-16]。MyD88介導(dǎo)的TLR4/MyD88/核因子κB信號通路在UC致病過程中具有關(guān)鍵作用,阻斷其中任一環(huán)節(jié)的作用,將減弱炎癥反應(yīng),從而起到臨床治療作用[17]。本研究免疫組化及蛋白免疫印跡檢測結(jié)果均顯示,模型組腸黏膜組織MyD88蛋白表達(dá)水平均高于正常組(均P<0.05),這提示MyD88蛋白高表達(dá)與UC的發(fā)病密切相關(guān);中藥大、中、小劑量組的MyD88蛋白表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05),且中藥小劑量組、中藥大劑量組、SASP組、中藥中劑量組MyD88蛋白對表達(dá)水平依次降低(均P<0.05),這提示加味柴芍六君顆?;蛲ㄟ^下調(diào)MyD88蛋白表達(dá)而減輕免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng),從而達(dá)到治療UC的作用,其中中劑量的加味柴芍六君顆粒作用效果更好。
綜上所述, 加味柴芍六君顆??筛纳芔C大鼠的癥狀及結(jié)腸黏膜病理變化,以中劑量效果最佳;其或通過降低MyD88蛋白水平,進而阻斷脂多糖TLR4/MyD88/核因子κB信號通路的異常傳導(dǎo),抑制TLR4/MyD88/核因子κB通路之間的串流,從而減輕腸道炎癥反應(yīng),提高其免疫耐受,促進結(jié)腸黏膜的修復(fù)及潰瘍的愈合,從而達(dá)到治療效果。