陳文龍, 張陽(yáng)陽(yáng), 張生英, 邢小勇, 胡永浩

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 蘭州 730070)

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉/黏膜病毒(Bovineviraldiarrheavirus/mucosalvirus, BVDV/MDV)導(dǎo)致的一種以急性黏膜病、持續(xù)性感染及免疫抑制為主要特征的病毒性傳染病, 臨床癥狀以高熱、出血性腹瀉及血小板減少癥為主[1].BVDV病毒嚴(yán)重影響母牛生殖、產(chǎn)奶及與牛源相關(guān)的生物制品, 如血清、抗體、凍精和疫苗等[2], 使畜牧地區(qū)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[3].文獻(xiàn)[4]發(fā)現(xiàn)首例BVDV病毒(Changchun 184株), 任敏[5]首次發(fā)現(xiàn)BVDV-2型毒株.2017年我國(guó)BVDV陽(yáng)性率為46.7%, 持續(xù)性感染率為2.2%[6].目前以疫苗免疫為主防控該病[7], E2可誘導(dǎo)機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫[8], 是制備BVDV DNA疫苗和亞單位疫苗的首選抗原.

當(dāng)病毒感染或接種滅活苗時(shí), 動(dòng)物機(jī)體主要產(chǎn)生抗E2抗體[9], 在免疫應(yīng)答過(guò)程中具有重要作用[10]； 針對(duì)E2蛋白制備的多克隆抗體可結(jié)合多個(gè)病毒抗原決定簇, 與更多的BVDV毒株發(fā)生反應(yīng), 用于檢測(cè)生物制品[11].E2蛋白又稱為gP53, 位于閱讀框2077-3198 nt, 編碼374個(gè)氨基酸, 分子量為53 000, 屬于囊膜蛋白[12]； E2是BVDV 4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C,E0,E1,E2)中免疫原性最好的結(jié)構(gòu)蛋白, 具有中和表位, 可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體以保護(hù)機(jī)體免受病毒感染[13]； E2有5個(gè)糖基化位點(diǎn)和一個(gè)疏水性序列, 是BVDV的疏水結(jié)合位點(diǎn)及跨膜結(jié)構(gòu)域, E2靠近N端部分含有多種構(gòu)象依賴性抗原結(jié)構(gòu)域, 其N端伸出囊膜表面, 是決定BVDV抗原性的主要部位[14].但E2基因突變概率極高, 其可變區(qū)占BVDV基因組可變區(qū)的1/3, 導(dǎo)致不同毒株間的免疫原差異較大, 使疫苗免疫失敗[15].E2蛋白是維持病毒周期的重要因子, 主要參與病毒的免疫逃逸, 并參與病毒與宿主細(xì)胞的識(shí)別、吸附及結(jié)合過(guò)程[16]； 重組E2蛋白可阻止BVDV感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞[17].高欲燃等[18]利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)E2蛋白; 吳立君[19]利用昆蟲(chóng)系表達(dá)E2蛋白; 范晴等[20]利用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)E2蛋白； Grigera等[21]利用黑腹果蠅表達(dá)E2蛋白; Bolin等[22]利用昆蟲(chóng)系統(tǒng)表達(dá)E2重組蛋白并對(duì)牛進(jìn)行免疫, 證明了E2重組蛋白可保護(hù)機(jī)體免受同源毒株的感染.

在懷孕母牛妊娠期120 d內(nèi), 胎兒感染BVDV形成免疫耐受狀態(tài), 可進(jìn)一步發(fā)展為持續(xù)感染牛(persistent infection, PI), 這種PI牛不易死亡, 可終生持續(xù)性向畜群排毒, 是牛群最主要的傳染源[23], 目前檢測(cè)PI牛難度較大.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法是診斷BVDV最簡(jiǎn)便、快捷的方法, 本文通過(guò)原核表達(dá)方法得到活性良好的E2蛋白抗原, 制備高效價(jià)的鼠源多克隆抗體, 其反應(yīng)性和特異性良好, 為ELISA檢測(cè)方法提供抗原和抗體, 為檢測(cè)BVDV PI動(dòng)物及研究E2功能得出一種新思路.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c小鼠(雌性, 42 d)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所.

1.1.2 載體和菌株 BVDV C24V標(biāo)準(zhǔn)毒株購(gòu)于蘭州民海生物公司； MDBK(madin-darby bovine kidney)細(xì)胞由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存； PEASY-Blunt Cloning Vector和pET-30a(+)表達(dá)載體均購(gòu)于南京諾唯贊公司； 大腸桿菌E.coliDH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)于北京全式金公司.

1.1.3 主要試劑 高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶均購(gòu)于北京元亨圣馬公司； TRIzol@Reagent購(gòu)于上海生工生物工程公司； AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase Inhibitor、EcoRⅠ、XhoⅠ和T4DNA Ligase均購(gòu)于山東寶生物工程公司； BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和BeyoECL Star化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)于南京碧云天公司； 氟氏完全佐劑和不完全佐劑均購(gòu)于美國(guó)Sigma試劑公司； Goat Anti-mouse IgG(HRP標(biāo)記)和FITC標(biāo)記山羊抗小鼠(H+L)均購(gòu)于北京博奧森公司.

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 8000WJ型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司), nexus GSX1型PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司), HH·B11-BS-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱和THZ-82N型恒溫震蕩培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司), Biorad Powerpac Bacsic164-5050型電泳儀、電泳槽和Trans-Blot SD型半干式轉(zhuǎn)印儀(美國(guó)Bio-rad公司), DFM-60C型倒置熒光顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司).

1.2 方 法

1.2.1 病毒RNA提取和鑒定 取病毒感染狀態(tài)良好的MDBK細(xì)胞, 待細(xì)胞病變穩(wěn)定, 收集病毒, 濃縮, 用0.22 μm濾器過(guò)濾備用.按TRIzol試劑說(shuō)明提取RNA, 并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA, -20 ℃保存?zhèn)溆?參考NCBI BVDV 5’UTR(GenBank: MF347401.1)序列設(shè)計(jì)保守序列引物； 參考文獻(xiàn)[11]獲得BVDV-Ⅰ鑒別引物B3B4； 使用兩種引物通過(guò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)鑒定病毒.

1.2.2E2全長(zhǎng)基因擴(kuò)增 參考NCBI BVDV-Ⅰ V074株(GenBank: KX170165.1)設(shè)計(jì)E2基因全長(zhǎng)引物, 由南京金唯智公司合成.通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,E2反應(yīng)條件： 98 ℃, 5 min； 98 ℃, 45 s； 48 ℃, 1 min； 72 ℃, 80 s； 72 ℃, 10 min, 循環(huán)數(shù)為35； 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%凝膠驗(yàn)證后回收, 基因片段連接PEASY-Blunt Cloning Vector, 轉(zhuǎn)化DH5α, 陽(yáng)性克隆菌由南京金唯智公司測(cè)序.

1.2.3E2原核表達(dá)載體構(gòu)建 將測(cè)序正確的E2全長(zhǎng)基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 選取抗原位點(diǎn)集中的區(qū)域.設(shè)計(jì)截短引物, 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增截短片段, 反應(yīng)條件為： 95 ℃, 6 min； 95 ℃, 50 s； 62.1 ℃, 50 s； 72 ℃, 80 s； 72 ℃, 10 min, 循環(huán)數(shù)為35； 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%凝膠驗(yàn)證后回收；EcoRⅠ，XhoⅠ雙酶切后連接pET-30a(+)載體, 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α并進(jìn)行菌液PCR及雙酶切驗(yàn)證； 陽(yáng)性克隆菌測(cè)序后, 提取質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化BL21.

表1 引物信息

1.2.4 原核表達(dá) 挑取重組E2菌落和pET-30a(+)載體菌落分別接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng), 用分光光度計(jì)測(cè)定A600=0.6時(shí), 加入1 mol/mL異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組菌表達(dá)蛋白； 超聲波破碎, 分離上清液和沉淀, 制備蛋白樣品, 經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS-PAGE電泳驗(yàn)證蛋白表達(dá)結(jié)果； 優(yōu)化表達(dá)條件, 提升蛋白表達(dá)量； 先用2-YT培養(yǎng)基按相同條件大量培養(yǎng)菌體, 再純化和復(fù)性蛋白, 并測(cè)定含量.

1.2.5 多克隆抗體制備 以重組E2蛋白為免疫原, 選取健康Balb/c小鼠3只, 首次免疫用100 μg/只的重組蛋白和等體積弗式完全佐劑, 背部多點(diǎn)注射免疫小鼠； 首次免疫14 d后, 每隔7 d, 按50 μg/只的重組蛋白和等體積弗式不完全佐劑免疫小鼠, 共免疫4次.重組蛋白為抗原, 間接ELISA測(cè)定小鼠血清多克隆抗體效價(jià)； 若抗體效價(jià)高于1∶20 000, 則處死小鼠, 大量收集抗體.

1.2.6 多克隆抗體鑒定 效價(jià)測(cè)定： 蛋白定量, 以每孔5 μg重組蛋白混合碳酸鹽緩沖液包被酶標(biāo)板, 經(jīng)包被、封閉、洗滌后酶標(biāo)板于-20 ℃保存?zhèn)溆?小鼠尾靜脈采血并分離血清； 實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白和陰性對(duì)照, 將多抗血清以1∶200稀釋, 依次加入蛋白酶標(biāo)板中, 37 ℃孵育2 h, 磷酸鹽吐溫緩沖溶液(PBST)洗滌； 加入1∶3 000的稀釋辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗, 37 ℃孵育2 h, PBST洗滌； 加入3,3′，5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)酶-底物顯色液于37 ℃作用15 min； H2SO4終止反應(yīng), 酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定結(jié)果.多克隆抗體效價(jià)測(cè)定設(shè)置3個(gè)平行組, 以未免疫小鼠血清為陰性血清, 判定標(biāo)準(zhǔn)：S/N=實(shí)組A值/陰性組A值,S/N>2.1為陽(yáng)性.

免疫印跡(Western blot, WB)實(shí)驗(yàn): 將純化后的蛋白、病毒制樣經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% SDS-PAGE電泳分離, 通過(guò)半干式電轉(zhuǎn)膜法將蛋白及病毒抗原轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜上, 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉于4 ℃封閉12 h后, 用PBST洗滌； 用1∶1 000稀釋的多抗血清于37 ℃孵育2 h, PBST洗滌； 用1∶500稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育2 h, PBST洗滌； 進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色反應(yīng).

免疫熒光(IFA)實(shí)驗(yàn)： 設(shè)置無(wú)病變細(xì)胞組、細(xì)胞病變組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組； 用六孔板(內(nèi)置無(wú)菌載玻片)培養(yǎng)MDBK細(xì)胞, 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度適中時(shí)接種病毒, 當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生大量病變且尚未脫落時(shí), 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌； 用多聚甲醛于37 ℃固定10 min, PBS洗滌, 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉于37 ℃封閉1 h, PBST洗滌； 腹水抗體1∶800稀釋, 37 ℃孵育2 h， PBST洗滌； 用1∶500 稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗于37 ℃避光孵育2 h, PBST避光充分洗滌； 爬片置于滴有抗熒光淬滅劑的載物片上, 用熒光顯微鏡觀察和拍照.

2 結(jié)果與討論

2.1 BVDV增殖

對(duì)照組細(xì)胞與感染病毒MDBK細(xì)胞的熒光顯微照片如圖1所示.由圖1(B)可見(jiàn), 感染病毒的MDBK細(xì)胞出現(xiàn)脫落和圓縮等病變, 符合預(yù)期結(jié)果, 可用于提取病毒RNA.

圖1 對(duì)照組細(xì)胞(A)和感染病毒細(xì)胞(B)的熒光顯微照片F(xiàn)ig.1 Fluorescence micrographs of control cells (A) and infected virus cells (B)

2.2 病毒RNA驗(yàn)證結(jié)果

用RT-PCR驗(yàn)證BVDV的結(jié)果如圖2所示.由圖2可見(jiàn): 第一泳道BVDV鑒別引物PCR擴(kuò)增大小為221 bp, 與預(yù)期結(jié)果相符； 第二泳道5′UTR保守序列引物PCR擴(kuò)增大小為381 bp, 與預(yù)期結(jié)果相符, 即病毒鑒定為BVDV-Ⅰ型, 提取的RNA可用于克隆E2基因.

2.3 E2全長(zhǎng)基因PCR擴(kuò)增及鑒定

以cDNA為模板, 用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到大小為1 122 bp基因片段， 如圖3所示.由圖3可見(jiàn), 所得結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致.連接克隆載體, 菌液經(jīng)PCR驗(yàn)證正確后測(cè)序.E2全長(zhǎng)基因測(cè)序結(jié)果如圖4所示.由圖4可見(jiàn), 擴(kuò)增片段為BVDV-Ⅰ型E2序列, 同源性99%, 表明已擴(kuò)增出E2全長(zhǎng)基因.

M： DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000； 1： 鑒別引物擴(kuò)增產(chǎn)物；2： 保守序列引物擴(kuò)增產(chǎn)物.圖2 BVDV的RT-PCR鑒定結(jié)果Fig.2 RT-PCR identification results of BVDV

M： DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000； 1： 全長(zhǎng)基因擴(kuò)增產(chǎn)物.圖3 PCR反應(yīng)擴(kuò)增E2全長(zhǎng)基因結(jié)果Fig.3 Results of amplification of E2 full-length gene by PCR reaction

2.4 pET-30a-E2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以E2全長(zhǎng)基因?yàn)槟０? 用截短引物通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到大小為1 026 bp基因片段, 如圖5所示.由圖5可見(jiàn), 所得結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致.將其與pET-30連接后, 雙酶切鑒定結(jié)果如圖6所示.由圖6可見(jiàn), 2條帶的大小分別為5 423 bp和1 026 bp, 符合預(yù)期結(jié)果, 即成功構(gòu)建了pET-30a-E2原核表達(dá)載體.

圖4 E2全長(zhǎng)基因測(cè)序結(jié)果Fig.4 Sequencing results of E2 full-length gene

M： DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000； 1： E2截短基因擴(kuò)增產(chǎn)物.圖5 PCR反應(yīng)擴(kuò)增截短基因Fig.5 Amplification of truncated genes by PCR reaction

M： DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000； 1： 重組質(zhì)粒； 2： 雙酶切產(chǎn)物.圖6 pET-30a-E2重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.6 Identification results of pET-30a-E2 recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.5 原核表達(dá)產(chǎn)物

重組蛋白經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖7所示.由圖7可見(jiàn): 第一孔的空質(zhì)粒組在特定大小處沒(méi)有條帶； 第二孔全菌表達(dá)的蛋白大小為32 000； 第三孔超聲波破碎后菌體沉淀蛋白大小為32 000； 第四孔純化后蛋白大小為32 000, 符合預(yù)期結(jié)果, 但包涵體純化法得到的蛋白純度較差, 雜帶較多.表明實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組大腸桿菌成功表達(dá)了大小為32 000、表達(dá)形式為不可溶性的E2蛋白.

2.6 多克隆抗體鑒定

2.6.1 間接ELISA結(jié)果 小鼠在5次免疫后, 以未免疫前小鼠血清為陰性對(duì)照, 測(cè)定多克隆抗體效價(jià), 其陰性均值為0.208 4, 制備的多克隆抗體稀釋29倍后, 其OD450=0.804 1, 大于2.1倍的陰性值, 計(jì)算的抗體效價(jià)大于2×104, 表明實(shí)驗(yàn)所用制備抗體的抗原活性較好, 免疫原性較強(qiáng), 可刺激小鼠產(chǎn)生強(qiáng)免疫反應(yīng).

M: 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1: 空質(zhì)粒組； 2: pET-E2全菌誘導(dǎo)；3: pET-E2誘導(dǎo)沉淀； 4: pET-E2蛋白純化.圖7 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

M: 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1: E2蛋白； 2: BVDV.圖8 多克隆抗體的Western blot鑒定結(jié)果Fig.8 Western blot identification results of polyclonal antibody

2.6.2 Western blot結(jié)果 多克隆抗體的Western blot鑒定結(jié)果如圖8所示.由圖8可見(jiàn), 多克隆抗體與第一孔的重組蛋白抗原在32 000結(jié)合, 與第二孔的病毒抗原在35 000特異性結(jié)合, 表明制備的鼠源多克隆抗體反應(yīng)性和特異性良好.

2.6.3 IFA結(jié)果 多克隆抗體的IFA鑒定結(jié)果如圖9所示.由圖9可見(jiàn): MDBK細(xì)胞在感染病毒后產(chǎn)生病變； 無(wú)病變對(duì)照(圖9(B))與陰性血清組(圖9(C))均未出現(xiàn)熒光現(xiàn)象； 陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)較大范圍熒光(圖9(D))； E2多克隆抗體組出現(xiàn)較多熒光(圖9(E)).表明抗體可與細(xì)胞中的BVDV結(jié)合, 抗體反應(yīng)性和特異性良好, 但低于陽(yáng)性血清的純度.

圖9 多克隆抗體的IFA鑒定結(jié)果Fig.9 IFA identification results of polyclonal antibody

綜上, 本文以Balb/c小鼠及原核表達(dá)載體pET-30a為材料制備多克隆抗體, 其背景信息清晰, 可降低對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響； 截短后的E2基因, 親水性和抗原表位點(diǎn)更集中, 可更有效加強(qiáng)重組E2蛋白對(duì)動(dòng)物機(jī)體的刺激作用, 有利于制備抗體.蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果表明, 構(gòu)建的重組E2大腸桿菌表達(dá)效率達(dá)50%, 蛋白表達(dá)量為0.4 mg/mL, 處于較高水平； ELISA測(cè)定結(jié)果表明, 制備的多克隆抗體效價(jià)大于200 000, 即實(shí)驗(yàn)得到的重組蛋白活性良好, 可刺激小鼠免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗體, 從而為ELISA準(zhǔn)備良好抗原, 進(jìn)一步檢測(cè)患病及PI動(dòng)物； WB和IFA結(jié)果表明, 多克隆抗體的反應(yīng)性和特異性良好, 可作為檢測(cè)BVDV病原的抗體.