楊斌旺，劉平古，劉龍飛，劉晉文，崔漢釗，汪河濱

（1.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300；2.新疆生產(chǎn)建設兵團南疆化工資源有效利用工程實驗室，新疆阿拉爾843300）

藥桑（Morus nigra L.）屬半栽培半野生資源，在植物分類學上屬桑科（Moraceae）桑屬（Morus L）黑桑種[1]，分布于新疆南疆地區(qū)的一種古老樹種，具有獨特藥用價值。藥桑葉中含有豐富的黃酮、生物堿、多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)[2-4]，其中多糖是藥桑葉中的主要活性成分之一，研究報道證實藥桑葉多糖具有明顯的降血糖、抗腫瘤、降血脂、抗氧化等功效[5-10]。

藥桑葉多糖是極性極大的大分子物質(zhì)，用水或稀堿提取的多糖常含有蛋白質(zhì)，采用乙醇沉淀多糖時蛋白也同時沉淀出來，因此純化多糖時首先要去除蛋白質(zhì)。Sevage法是目前脫蛋白常采用的方法之一，但該法脫蛋白效率低，次數(shù)多，多糖的損失率大[11-13]，因此有必要對其脫蛋白工藝進行優(yōu)化。本研究在單因素試驗基礎上采用正交試驗方法確定藥桑葉多糖Sevage法除蛋白的最佳工藝條件，并進行多糖DPPH自由基抗氧化活性試驗，以期為藥桑葉多糖在藥品和功能食品方面的高效開發(fā)與綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑葉：于2018年6月采自新疆阿克蘇地區(qū)庫車縣；D-無水葡萄糖標準品：上海源葉生物科技有限公司；牛血清白蛋白標準品：北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍G-250標準品：上海康德生物科技有限公司。正丁醇、石油醚、苯酚、磷酸：天津永晟精細化工有限公司；硫酸：天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；無水乙醇、氯仿：天津市致遠化學試劑有限公司，均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

CP224C電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；GZX-9240MBE電熱恒溫鼓風干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；德國Heidolph Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋：北京市光明醫(yī)療儀器有限公司；S54型紫外分光光度計：上海棱光技術有限公司；TDZ4-WS臺式低速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；LGJ-10C冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藥桑葉粗多糖的提取

藥桑葉→粉碎過篩→乙醇脫色、脫脂→熱水浸提→離心、抽濾→濾液→醇沉→冷凍干燥→藥桑葉粗多糖[14-15]

1.3.2 藥桑葉粗多糖脫蛋白

稱取藥桑葉粗多糖500 mg置于200 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度搖勻，得2.5 mg/mL的儲備溶液，備用。量取定量藥桑葉粗多糖溶液，分別與不同體積的Sevage試劑（預先配置好的體積比為4∶1的氯仿-正丁醇溶液）混合、振搖，將混合液置于離心機中，調(diào)節(jié)至4 000 r/min，離心10 min。離心后，除去下方的有機溶劑和交界處的變形蛋白質(zhì)，重復上述操作幾次，即得到脫蛋白后的藥桑葉多糖，冷凍干燥，備用。

1.3.3 多糖含量測定

多糖含量的測定采用苯酚硫酸法[16-17]。稱取105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖10 mg置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度搖勻，得0.1 mg/mL葡萄糖標準液，作為對照溶液，備用。量取6.3 mL 80%的苯酚溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度配置成5%苯酚溶液，搖勻后放置于棕色試劑瓶中（現(xiàn)配現(xiàn)用）。分別吸取葡萄糖標準液 0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，用水補至2 mL，依次加入5%苯酚溶液1.0 mL，然后加入3.0 mL的濃硫酸溶液，搖勻，沸水浴30 min后，冷卻至室溫（25℃左右）。不加標準葡萄糖溶液為空白，測定波長為490 nm處的吸光度值。以縱坐標為吸光度值（A），以橫坐標為葡萄糖濃度（C）繪制葡萄糖標準曲線。得到的回歸方程A=26.355C-0.017 7，R2=0.997 6。在0～0.03 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系。藥桑葉多糖含量測定：吸取2 mL多糖水溶液測定其吸光度，根據(jù)回歸方程計算其濃度。多糖的損失率計算公式如下：

1.3.4 蛋白質(zhì)含量測定-考馬斯亮藍法（Bradford法）

蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法（Bradford法）[18]。稱取牛血清蛋白5 mg，加入蒸餾水溶解，定容至5 mL的容量瓶中，吸取定容好的溶液1 mL，用蒸餾水稀釋定容到10 mL容量瓶中，即制成0.1 mg/mL的標準溶液，備用。稱取0.01 g的考馬斯亮藍G-250，溶于90%乙醇中，加入10 mL的85%（m/v）的磷酸，最后用蒸餾水定容至100 mL，搖勻即得到考馬斯亮藍儲備液。精確吸取牛血清蛋白標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL加入試管中，分別加水定容至1.0 mL，以不加蛋白標準溶液作為空白組，然后加入5.0 mL考馬斯亮藍染液，將各個試管中的溶液縱向倒轉(zhuǎn)混勻，室溫（25℃左右）5 min后，測定波長595 nm處的吸光光度值。以橫坐標為標準蛋白質(zhì)濃度（C），以縱坐標為吸光度（A），繪制蛋白質(zhì)標準曲線。得到的回歸方程為A=42.349C+0.013 5，R2=0.983 9。在 0～0.015 mg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關系。計算蛋白質(zhì)除去率公式如下：

1.4 單因素試驗對藥桑葉多糖除蛋白效率的影響

1.4.1 Sevage試劑用量對藥桑葉多糖除蛋白效果的影響

固定脫蛋白時間為20 min，脫蛋白次數(shù)為3次，考察多糖溶液與Sevage試劑的體積比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4時，對藥桑葉多糖除蛋白效果的影響，然后測定多糖損失率和蛋白除去率。

1.4.2 脫蛋白時間對藥桑葉多糖除蛋白效果的影響

固定多糖溶液與Sevage試劑的體積比為1∶2，脫蛋白次數(shù)為3次，考察振搖時間分別為10、20、30、40 min時，對藥桑葉多糖除蛋白效果的影響，然后測定多糖損失率和蛋白除去率。

1.4.3 脫蛋白次數(shù)對藥桑葉多糖除蛋白效果的影響

固定多糖溶液與Sevage試劑的體積比為1∶2，脫蛋白時間為20 min，考察脫蛋白次數(shù)分別為2、3、4、5次時，對藥桑葉多糖除蛋白效果的影響，然后測定多糖損失率和蛋白質(zhì)除去率。

1.5 藥桑葉粗多糖脫蛋白正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對多糖溶液與Sevage試劑的體積比（A）、脫蛋白時間（B）、脫蛋白次數(shù)（C）3個因素進行正交試驗，設計正交表，考察3個因素對藥桑葉多糖除蛋白效果的影響，從而確定最佳除蛋白工藝條件。正交試驗因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors level table of orthogonal test

1.6 藥桑葉多糖體外抗氧化活性測定

陽性對照組：取抗壞血酸（VC）適量，用95%的乙醇定容置5 mL的容量瓶中，再配置成濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL 的溶液。

試驗組：取等量相同濃度脫蛋白前、后的藥桑葉多糖溶液，用95%的乙醇定容到5 mL的容量瓶中，配置成濃度分別為 0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL的樣品溶液。

以不同濃度VC溶液做陽性對照組，取0.2 mmol/L的DPPH溶液和溶液樣品各2.0mL加入到試管內(nèi)，混勻后，在恒溫（28℃）條件下，放置到避光處，反應30 min，空白對照為蒸餾水，在517 nm處測定吸光度[19-20]。每個樣品做3次平行試驗。DPPH自由基清除率計算公式如下：

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A0為95%乙醇與DPPH溶液反應后的吸光度值；A1為含不同濃度樣品與DPPH溶液反應后的吸光度值；A2為不同濃度下樣品溶液與95%乙醇溶液取2 mL的吸光度。

2 結果與分析

2.1 多糖溶液與Sevage試劑的體積比對藥桑葉多糖除蛋白效果的影響

Sevage試劑用量對脫蛋白效果的影響見圖1。

圖1 Sevage試劑用量對脫蛋白效果的影響Fig.1 Effect of Sevage reagent dosage on deproteinization

從圖1可知，隨著多糖溶液與Sevage試劑的體積比減小（即Sevage試劑用量的增加），多糖損失率增加。多糖溶液與Sevage試劑的體積比為1∶2時，蛋白除去率較好，蛋白除去率達到75.47%，多糖損失率達到20.96%。綜合蛋白除去率和多糖損失率考慮，選取最佳多糖溶液與Sevage試劑的體積比為1∶2。

2.2 脫蛋白時間對藥桑葉多糖除蛋白效果的影響

脫蛋白時間對脫蛋白效果的影響見圖2。

圖2 脫蛋白時間對脫蛋白效果的影響Fig.2 Effect of deproteinization time on deproteinization

從圖2可知，隨著脫蛋白時間的增加，多糖損失率越增加。脫蛋白時間為20 min時，蛋白的除去率最高，蛋白除去率可達76.54%，在10 min時多糖損失率最少，達到21.81%。綜合蛋白除去率和多糖損失率考慮，選取脫蛋白時間為20 min。

2.3 脫蛋白次數(shù)對藥桑葉多糖除蛋白效果的影響

脫蛋白次數(shù)對脫蛋白效果的影響見圖3。

從圖3可知，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，多糖損失率增加。在脫蛋白次數(shù)為3次時，蛋白質(zhì)除去率最高，可達74.92%。綜合蛋白除去率和多糖損失率考慮，選取最佳脫蛋白次數(shù)為3次。

圖3 脫蛋白次數(shù)對脫蛋白效果的影響Fig.3 Effect of the number of deproteinization on the deproteinization effect

2.4 正交試驗優(yōu)化結果

將藥桑葉粗多糖的除去率的權重系數(shù)設為0.5，藥桑葉粗多糖脫蛋白后多糖含量的權重系數(shù)也設為0.5，進行統(tǒng)計分析。綜合評分H=0.5X×100/74.55+0.5Y×100/88.98[21]。

式中：X為藥桑葉粗多糖的除去率，%；Y為藥桑葉粗多糖脫蛋白后多糖含量，%。

正交試驗見表2，方差分析見表3。

由正交試驗結果的最優(yōu)脫除條件為A2B1C1，即多糖溶液與Sevage試劑體積比為1∶2、脫蛋白時間為20 min、脫蛋白次數(shù)為3次。在所選試驗范圍，各因素對藥桑葉多糖除蛋白效率的影響大小是C（脫蛋白次數(shù)）＞B（脫蛋白時間）＞A（多糖溶液與Sevage試劑的體積比）。根據(jù)方差分析，脫蛋白次數(shù)對藥桑葉粗多糖除蛋白效率極為顯著，脫蛋白時間較為顯著。在此工藝優(yōu)化條件下，重復試驗3次，結果測定出平均蛋白質(zhì)除去率為76.54%，多糖損失率為20.80%，綜合評分為95.55%。

表2 正交試驗Table 2 Orthogonal test

2.5 抗氧化活性結果

脫蛋白前、后的藥桑葉多糖溶液和VC溶液對DPPH自由基的清除率見圖4。

經(jīng)Origin8.5進行線性擬合得到圖4，根據(jù)圖4知，藥桑葉多糖溶液濃度在一定范圍內(nèi)，其對DPPH自由基的清除能力清除能力隨著樣品濃度的增加而顯著增加。同濃度VC溶液和脫蛋白前后的藥桑葉多糖溶液清除DPPH自由基的能力對比可得出：VC＞脫蛋白后＞脫蛋白前。當溶液濃度達到1.2 mg/mL時，脫蛋白前、后的藥桑葉多糖對DPPH·清除率分別達到72.56%、84.78%，脫蛋白后的清除效果明顯增加，說明脫蛋白后的藥桑葉多糖具有良好的體外抗氧化能力。

3 結論

本次試驗利用單因素方法研究了不同影響因素對Sevage法脫除蛋白質(zhì)效果的影響，Sevage試劑用量采用正交試驗方法確定了Sevage法最佳除蛋白工藝為：多糖溶液與Sevage試劑的體積比為1∶2、脫蛋白時間20 min、脫蛋白次數(shù)3次，蛋白質(zhì)除去率為76.54%，多糖損失率為20.80%。在一定濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基試驗中發(fā)現(xiàn)藥桑葉多糖表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，為高效開發(fā)藥桑葉多糖藥品及功能食品奠定了基礎。