劉璐，鄧百萬，蘭阿峰，*，郭素芬，彭浩

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中723001；2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西漢中723001）

羊肚菌（Morchella spp.），隸屬真菌界，子囊菌門（Ascomycotina），子囊菌綱（Ascomycotina），盤菌目（Pezizales），羊肚菌科 （Morchellaceae），羊肚菌屬（Morchella），又名編笠菌，草笠竹，羊肚菜，外形如傘狀，因其菌蓋上有許多網棱狀的褶皺，與羊肚極其相似，故名羊肚菌[1-3]?，F(xiàn)已知全球共有羊肚菌屬物種61個，其中在我國境內有30種，物種資源十分豐富[4-7]。羊肚菌在國外分布于美、德、法、印等國[8]，國內主要產地分布在川、渝、陜、滇、鄂等地[9]。羊肚菌作為食用菌，含有氨基酸、多糖和礦質元素等多種營養(yǎng)成分[10]。羊肚菌作為藥用菌，能夠抗腫瘤、抗菌、保護心血管系統(tǒng)、保護肝腎、保護胃黏膜、增強人體免疫力等功能[11-12]。目前，羊肚菌在歐盟的上等干貨售價約為5 000元/kg，國內市場的上等干貨售價在2 000元/kg以上[13]，使得近些年來羊肚菌產業(yè)的發(fā)展普遍被外界看好，在農民致富和“精準扶貧”中發(fā)揮了關鍵作用[14]。羊肚菌產業(yè)已經走向了規(guī)?；l(fā)展，但在菌種繼代培養(yǎng)過程中，退化現(xiàn)象的發(fā)生為菌種保藏工作帶來了極大的挑戰(zhàn)。就目前而言，國內外關于羊肚菌菌種退化現(xiàn)象、退化機制鮮有報道，羊肚菌菌種退化至今沒有明確定義。本試驗采用在栽培種中表現(xiàn)穩(wěn)定的優(yōu)勢羊肚菌菌種作為試驗材料，以期望為羊肚菌菌種退化的深入研究奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

六妹羊肚菌（Morchella sextelata）、隱形羊肚菌（Morchella cryptica）：陜西省食藥用菌工程技術研究中心提供，詳見蘭阿峰等[15]六妹羊肚菌（Morchella sextelata，Mor 10）和隱形羊肚菌（Morchella cryptica，Mor 7）。

1.1.2 試劑

線粒體綠色熒光探針（Mito-Tracker Green）：生工生物工程（上海）股份有限公司；線粒體紅色熒光探針（Mito-Tracker Red CMXRos）、氯化硝基四氮唑藍（nitro blue tetrazolium，NBT）：上海藍季科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 儀器設備

BBS-DDC無菌潔凈工作臺：濟南鑫貝西生物技術有限公司；BSP-400生化培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；ZHWY-B2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海志城分析儀器制造有限公司；OLYMPUS BX53-DP27光學顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Nikon Ti-S倒置熒光顯微鏡：日本尼康公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基：土豆200g，葡萄糖20g，KH2PO45g，MgSO4·7H2O 2.5 g，瓊脂 20 g，水 1 000 mL，pH 值自然。

PDA液體培養(yǎng)基配方：馬鈴薯100 g，蔗糖30 g，蛋白胨 1 g，酵母浸粉 5 g，MgSO40.5 g，KH2PO40.5 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 退化菌種的制備

將保藏的羊肚菌菌種Mor 10和Mor 7作為一代菌種，分別轉接至PDA平板上，在24℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2 d，得到長有羊肚菌菌絲體的平板，之后再從平板上挑取大小相同的菌塊，放入新鮮的PDA平板中培養(yǎng)，重復該操作，在PDA平板上連續(xù)傳代，培養(yǎng)得到羊肚菌十五代菌種，每代轉接做10個平行試驗。

在裝有PDA液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，分別接入羊肚菌Mor 10和Mor 7的第一代菌種及第十五代菌種若干，放入搖床中，設置溫度為24℃，轉速為140 r/min，振蕩培養(yǎng)5 d。

1.2.2 NBT染色試驗

收集菌絲球并用真空泵抽去多余水分，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）緩沖液沖洗兩次，取適量菌絲浸沒于0.3 mmol/L NBT工作液中，在室溫25℃左右中孵育20 min，加入30%的甘油終止反應，制成載玻片，置于光學顯微鏡下觀察菌絲細胞內活性氧的含量[16]。對照試驗采用羊肚菌Mor 10和Mor 7的第十五代菌種進行培養(yǎng)，重復上述方法，用光學顯微鏡觀察菌絲顏色變化。

1.2.3 線粒體膜電位染色試驗

收集抽去水分的菌絲球，取部分菌絲用PBS緩沖液清洗兩次，將濃度為20 nmol/L的Mito-Tracker Red CMXRos染液滴在菌絲上，室溫25℃左右下孵育20 min，再用pH 7.5的PBS緩沖液清洗3次去除多余染液，之后加入3.7%多聚甲醛固定液，室溫25℃左右固定20 min，固定完成后用PBS緩沖液洗滌3次，將制好的載玻片放在熒光顯微鏡下觀察顏色變化。對照試驗采用羊肚菌Mor 10和Mor 7的第十五代菌種進行培養(yǎng)，重復上述方法，在熒光顯微鏡下觀察菌絲變化。

1.2.4 線粒體染色試驗

將菌絲球洗凈并抽干水分，向菌絲滴加3.7%的多聚甲醛，20 min后用PBS緩沖液清洗兩次，取配置好的熒光染液Mito-Tracker Green滴在菌絲上，室溫25℃左右下孵育20 min后，用pH 7.5的PBS緩沖液清洗3次，將制好的載玻片用熒光顯微鏡對其進行觀察。對照試驗采用羊肚菌Mor 10和Mor 7的第十五代菌種，重復上述方法，在熒光顯微鏡下觀察菌絲變化。

2 結果與分析

2.1 退化菌種的獲得

羊肚菌第一代到第十五代部分菌絲生長狀態(tài)見圖1。

經過對羊肚菌Mor 10和Mor 7的連續(xù)傳代培養(yǎng)及觀察之后發(fā)現(xiàn)，其存在明顯的退化現(xiàn)象，從菌絲退化圖片可以看出，傳代次數越多，羊肚菌菌絲生長速度變慢，菌落邊緣參差不齊，且伴有菌絲稀疏細弱，菌絲顏色逐漸加深；首先，在生長階段，菌絲生命力旺盛、生長迅速較快，菌落邊緣整齊，菌絲粗壯，菌絲徑直向前生長，菌絲與相鄰菌絲之間相互交織成網狀。其次，在老化階段，菌絲生長速度與前一階段相比明顯下降，并出現(xiàn)菌落邊緣不整齊，菌絲細弱、彎曲和稀疏，菌落中央產生黃褐色或黃色色素，絨毛狀菌絲增多。這與其它食用菌在老化過程中出現(xiàn)的現(xiàn)象基本相似，都呈現(xiàn)出生長速度，菌落及菌絲等指標的改變。

圖1 羊肚菌第一代到第十五代部分菌絲生長狀態(tài)Fig.1 Mycelial growth status of the first to the fifteenth generation of morel

2.2 NBT染色試驗結果

羊肚菌NBT染色結果見圖2。

圖2 羊肚菌NBT染色結果Fig.2 Morel results from NBT staining

為了檢驗菌絲清除活性氧的能力，參考Lara-Ortiz等[16]所描述的NBT法對羊肚菌Mor 10和Mor 7正常菌種及退化菌種菌絲內活性氧（reactive oxygen species，ROS）進行定性測定，在顯微鏡下，用40倍鏡觀察染色后的玻片；結果顯示，正常菌絲經NBT還原后僅僅出現(xiàn)顏色較淡的藍紫色，而退化菌絲經NBT還原后呈現(xiàn)出明顯的藍紫色物質，說明了退化菌種清除活性氧的能力降低，正常菌種清除活性氧的能力大于退化菌種。

2.3 線粒體膜電位染色結果

羊肚菌線粒體膜電位染色結果見圖3。

為了比較Mor 10和Mor 7正常菌種及退化菌種細胞內線粒體膜電位的差異，根據Mito-Tracker Red CMXRos顯現(xiàn)紅色熒光的激發(fā)波長為579 nm，發(fā)射波長為599 nm，選擇熒光濾光塊轉盤上的綠色熒光濾光塊，比例尺代表100 μm。經過線粒體膜電位依賴性熒光染料Mito-Tracker Red CMXRos對菌種Mor 10和Mor 7的菌絲染色后，將制作好的玻片放置在熒光倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)這兩種菌種的正常菌絲均能顯示出熒光，而退化菌絲內則觀察不到明顯的熒光，該試驗結果表明，正常菌種線粒體膜電位高于退化菌種。

圖3 羊肚菌線粒體膜電位染色結果Fig.3 Results of mitochondrial membrane potential staining of morel

2.4 線粒體染色結果

羊肚菌線粒體染色結果見圖4。

圖4 羊肚菌線粒體染色結果Fig.4 Results of mitochondrial staining of morel

為了比較Mor 10和Mor 7正常菌種及退化菌種線粒體形態(tài)的差異，根據Mito-Tracker Green呈現(xiàn)綠色熒光的激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為520 nm，選擇熒光濾光塊轉盤上的藍色熒光濾光塊，比例尺代表100 μm，試驗采用的熒光染料Mito-Tracker Green能清晰的反映出正常菌絲和退化菌絲內部線粒體的形態(tài)。將用熒光染料染色后的Mor 10和Mor 7菌絲在熒光倒置顯微鏡下仔細觀察，發(fā)現(xiàn)正常菌種內有線粒體亮斑，與之不同的是，退化菌種內無線粒體亮斑分布。

3 討論

我國是當今世界上食用菌生產大國，在食用菌的栽培品種數量及產量上均大幅領先于其他國家[17]。隨著羊肚菌的營養(yǎng)和保健功能得到消費者的普遍認可，其需求量增加常出現(xiàn)供不應求的現(xiàn)象，但菌種退化給羊肚菌產業(yè)發(fā)展帶來了一定的損失，因此，針對羊肚菌菌種退化機理的研究迫在眉睫。

目前，國內外對羊肚菌菌絲退化機理鮮有研究性的報道，本研究通過菌絲退化試驗，氧化脅迫試驗、線粒體膜電位變化試驗和線粒體形態(tài)試驗這4個方面闡述了羊肚菌出現(xiàn)退化現(xiàn)象的機理。將菌絲退化試驗的結果與劉偉等[18]多年來對大量高羊肚菌菌株連續(xù)培養(yǎng)和觀察發(fā)現(xiàn)的試驗結果比較得出，羊肚菌菌絲退化表現(xiàn)基本一致，都呈現(xiàn)出菌絲，菌落等方面的差別。氧化脅迫試驗的結果與此前馬元偉等[19]在檢驗綠僵菌角變菌絲與正常菌絲細胞內含有活性氧的結果一致，說明了退化菌種清除活性氧的能力大大降低，老化與活性氧及活性氧清除能力密切相關[20-21]。從線粒體膜電位試驗得出退化菌種線粒體膜電位低于正常菌種，綠僵菌在用熒光染料Mito-Tracker Red CMXRos染色后發(fā)現(xiàn)，野生型菌株線粒體膜電位高于角變型菌株[22]，說明了線粒體膜電位是線粒體的核心特征之一，細胞凋亡的重要前兆之一，它包括線粒體膜電位降低[23]，同本試驗結果一致。但與此結果不同的是，Li等[24]用熒光染料Mito-Tracker Red CMXRos觀察構巢曲霉線粒體膜電位變化時發(fā)現(xiàn)，角變型構巢曲霉菌株的線粒體膜電位高于正常菌株，出現(xiàn)這一差異的原因可能是試驗所用菌種不同，本試驗使用的羊肚菌與綠僵菌同屬子囊菌，試驗結果也基本與其觀察到的現(xiàn)象相同。從線粒體染色試驗能夠反映出，正常菌種和退化菌種的線粒體發(fā)生了變化，李琳[22]用熒光染料Mito-Tracker Green觀察綠僵菌中線粒體時發(fā)現(xiàn)，野生型綠僵菌的線粒體呈現(xiàn)面積較大的圓球形，角變型菌株的線粒體呈現(xiàn)較小的顆粒狀，在本次試驗中正常菌種出現(xiàn)亮斑，而退化菌種未出現(xiàn)亮斑，結果中存在的部分差別可能與試驗所用不同品牌的試劑濃度不同等原因有關，試驗結果可以說明衰老和線粒體動態(tài)變化是相關的[25]。本試驗所用菌種為陜西漢中地區(qū)的栽培種，試驗初步闡明了羊肚菌菌絲退化的機理，本研究室將持續(xù)研究這一問題，期望該研究能為羊肚菌生產提供理論指導。

4 結論

本試驗通過在PDA培養(yǎng)基上多次傳代，最終獲得羊肚菌退化材料，觀察發(fā)現(xiàn)，與正常菌絲相比，退化菌絲顏色變成黃褐色或黃色、生長速度下降，菌絲稀疏且細弱，菌落邊緣不整齊；用NBT染液來觀察菌絲的氧化脅迫程度發(fā)現(xiàn)，正常羊肚菌菌絲在NBT染色的一段時間后會逐漸褪色，而退化的菌絲在一段時間后顏色加深；觀察線粒體膜電位變化時，使用熒光染料Mito-Tracker Red CMXRos對菌絲染色，發(fā)現(xiàn)正常菌絲染色后呈現(xiàn)較明顯的紅色熒光，而退化菌絲只能觀察到微弱的紅色熒光；使用熒光染料Mito-Tracker Green對菌絲線粒體形態(tài)變化進行觀察，發(fā)現(xiàn)正常菌絲有明顯的線粒體亮斑，退化菌絲則沒有。