朱森林，梅 忠，邢承華

(金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，浙江 金華 321004)

鎘(Cd)是一種毒性大的有害重金屬。隨著我國工業(yè)化、城鎮(zhèn)化進程快速推進、污灌和含鎘肥料的使用，土壤鎘污染日趨嚴重。2014年發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，我國耕地鎘污染物點位超標(biāo)率已達7%。因此，土壤鎘污染已成為當(dāng)前亟需解決的一項重大環(huán)境問題。目前，常用化學(xué)、物理等傳統(tǒng)方法來修復(fù)和治理鎘污染土壤，但這些技術(shù)不容易管理，費用高，并且易帶來二次污染[1]。基于重金屬超積累植物的土壤污染修復(fù)技術(shù)因其經(jīng)濟、綠色、環(huán)保而備受關(guān)注。然而，由于超積累植物生長緩慢、生物量小，嚴重制約著其在鎘污染土壤修復(fù)中的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。近年來，利用合理的養(yǎng)分管理措施阻控土壤中的鎘進入農(nóng)作物被認為是減控作物鎘積累、達成保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要策略之一[2]。闡明鎘與礦質(zhì)營養(yǎng)元素之間的互作關(guān)系，是上述策略的重要基礎(chǔ)。

磷是植物必需的大量營養(yǎng)元素之一，對植物生長發(fā)育極其重要，施用磷肥是作物獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵保障。大量研究表明，磷對鎘的影響十分復(fù)雜。在土壤溶液中，磷酸根離子能直接形成磷-鎘沉淀物使鎘鈍化，同時鎘離子也可以被難溶性磷酸鹽直接吸附而降低有效性[3-4]。在植物體內(nèi)，磷對鎘的影響卻表現(xiàn)出相反的效應(yīng)，缺磷可以減少植物對鎘的吸收，進而緩解鎘對植物的毒害[5-6]。但迄今為止，缺磷如何減少植物根系對鎘的吸收尚不清楚。除了鎘的吸收積累和耐性受到磷的影響外，許多研究發(fā)現(xiàn)，鐵(Fe)的吸收和利用也受到磷的影響。缺磷不僅可以提高植物體內(nèi)鐵的生物有效性[7-8]，還會抑制植物根系中鐵吸收相關(guān)基因的表達，如鐵轉(zhuǎn)運蛋白基因IRT1[9]。IRT1是一種專一性相對較低的轉(zhuǎn)運蛋白，除了轉(zhuǎn)運二價鐵離子外，還能轉(zhuǎn)運鎘離子。

磷養(yǎng)分管理是最為頻繁的一項農(nóng)藝措施，闡明植物體內(nèi)磷與鎘吸收的關(guān)系，可為合理進行磷養(yǎng)分管理、降低作物鎘積累提供理論依據(jù)。基于此，本研究中以野生型擬南芥Col-0和鐵吸收功能缺陷的突變體irt1為材料，研究缺磷處理和IRT1基因表達對擬南芥鎘吸收的影響，為通過磷元素管理技術(shù)阻控植物鎘吸收積累提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以野生型擬南芥Col-0和IRT1功能缺失突變體irt1為材料。全營養(yǎng)液：NaH2PO4750 μmol·L-1，KNO31 500 μmol·L-1，MgSO4600 μmol·L-1，CaCl21 000 μmol·L-1，F(xiàn)e-EDTA 50 μmol·L-1，H3BO310 μmol·L-1，ZnSO40.5 μmol·L-1，MnSO40.5 μmol·L-1，CuSO40.1 μmol·L-1，(NH4)6Mo7O240.1 μmol·L-1，用1 mol·L-1NaOH將營養(yǎng)液pH調(diào)至6.5。

將種子置于含有1/4全營養(yǎng)液的網(wǎng)膜上萌發(fā)，培養(yǎng)7 d后，將長勢一致的幼苗移栽到全營養(yǎng)液中，置于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，隔天換1次營養(yǎng)液。人工氣候室內(nèi)相對濕度65%，晝夜循環(huán)與溫度分別為光照12 h/25 ℃、黑暗12 h/22 ℃，光照強度140 μmol·m-2·s-1。

1.2 方法

擬南芥在全營養(yǎng)液中培養(yǎng)5周后，將幼苗分成4組，進行如下處理：(1)缺磷無鎘處理(-P-Cd)，(2)缺磷加鎘處理(-P+Cd)，(3)正常供磷無鎘處理(+P-Cd)，(4)正常供磷加鎘處理(+P+Cd)。缺磷處理為全營養(yǎng)液中不含磷，鎘處理為40 μmol·L-1CdCl2。

1.2.1IRT1基因表達分析

野生型擬南芥Col-0處理4、8 d后，取根系樣品。采用RNA isoPlus試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]，根據(jù)說明書提取根RNA。提取的RNA樣品用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[Prime Script RT Reagent Kit，寶生物工程(大連)有限公司]合成第一條鏈cDNA。采用染料法實時熒光定量PCR試劑盒[SYBR? Premix Ex TaqTMII，寶生物工程(大連)有限公司]分析IRT1基因(AT4G19690)的表達，內(nèi)參基因為UBQ10(AT4g05320)。每份RNA樣品3次技術(shù)重復(fù)，每個處理4個生物學(xué)重復(fù)。定量PCR所用特異性引物如下：

IRT1-F：AAGCTTTGATCACGGTTGG；

IRT1-R：TTAGGTCCCATGAACTCCG。

UBQ10-F：ACCCTAACGGGAAAGACGA；

UBQ10-R：GGAGCCTGAGAACAAGATGAA。

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。所用儀器為MJ OptionTM2實時定量PCR儀(MJ ResearchTM)。采用2-ΔΔCt法計算IRT1基因的相對表達量。

1.2.2 葉綠素相對含量的測定

野生型擬南芥Col-0處理8 d后，采用SPAD-502P葉綠素計(柯尼卡美能達，日本)測定葉片葉綠素相對含量，每個處理12個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 干質(zhì)量測定

野生型擬南芥Col-0處理8 d后，分別收獲根系和地上部，用吸水紙吸干根系水分，然后在75 ℃烘箱內(nèi)烘干，測定地上部和根系的干質(zhì)量。

1.2.4 過氧化氫(H2O2)含量測定

野生型擬南芥Col-0處理8 d后，參考Bai等[10]的方法測定H2O2含量：分別取0.2 g擬南芥根系和地上部樣品，加1.5 mL 4 ℃預(yù)冷的丙酮研磨，轉(zhuǎn)入離心管，補充丙酮至2.0 mL，10 000×g離心10 min，取0.8 mL上清液，加0.1 mL 5% TiSO4、0.2 mL 17 μmol·L-1NH3·H2O，10 000×g離心15 min，棄上清液，向沉淀中加5 mL 2 mol·L-1H2SO4溶解沉淀，測定415 nm波長的吸光度。每個處理4個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 元素含量測定

植物收獲后，分為根部和地上部。將根放入0.5 mmol·L-1氯化鈣中清洗，再用去離子水沖洗3次后，用吸水紙吸干。根系與地上部分別稱量后，置于80 ℃烘箱烘干。植物干樣用優(yōu)級純濃硝酸(純度68%)消解后，用超純水稀釋至40 mL過濾。濾液中的鎘濃度用火焰原子吸收分光光度計(Thermo Scientific AAS，iCE3000)分析，每個處理4個生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS進行統(tǒng)計，采用(ANOVA)兩因素分析(two-way ANOVA)，并在0.05水平上進行Duncon檢驗。用KyPlot軟件對數(shù)據(jù)進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫下缺磷處理對葉綠素含量和干質(zhì)量的影響

在無鎘處理下，正常供磷和缺磷處理之間的葉綠素含量無顯著差異，但40 μmol·L-1鎘處理8 d后，與正常供磷處理相比，缺磷處理顯著提高了Col-0擬南芥葉片的葉綠素相對含量(SPAD值)(圖1)，表明缺磷緩解了鎘誘導(dǎo)的葉片失綠黃化癥狀。

為進一步闡明不同供磷對擬南芥鎘耐性的影響，分析了擬南芥根系和地上部組織的干質(zhì)量，結(jié)果如圖2所示。在無鎘處理下，缺磷處理中Col-0植株根系和地上部的干質(zhì)量顯著低于正常供磷處理；但在40 μmol·L-1鎘處理8 d后，與正常供磷處理相比，缺磷處理植株地上部和根系的干質(zhì)量均顯著提高，分別是正常供磷處理的2.1和1.9倍，表明缺磷可以緩解鎘對擬南芥生長的抑制作用。

柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.圖1 鎘脅迫下不同供磷處理的野生型擬南芥葉綠素相對含量Fig.1 SPAD value of wild-type Arabidopsis thaliana leaves of different phosphorus treatments under cadmium stress

圖2 鎘脅迫下不同供磷處理的野生型擬南芥干質(zhì)量的影響Fig.2 Dry weight of wild-type Arabidopsis thaliana of different phosphorus treatments under cadmium stress

2.2 鎘脅迫下缺磷對擬南芥H2O2含量的影響

由圖3可見，無鎘脅迫時，缺磷處理的植株根系和地上部的H2O2含量分別比正常供磷處理的植株增加了約45%和50%；但在40 μmol·L-1鎘處理8 d后，與正常供磷處理的植株相比，缺磷植株的地上部和根系H2O2含量反而分別降低了40%和25%。表明缺磷可緩解鎘脅迫導(dǎo)致的植物氧化損傷。

2.3 鎘脅迫下缺磷對鐵轉(zhuǎn)運蛋白基因IRT1表達的影響

如圖4所示，無鎘和有鎘條件下，缺磷處理的野生型擬南芥根系中IRT1表達量均顯著低于正常供磷處理。

2.4 鎘脅迫下缺磷對擬南芥鎘含量的影響

為進一步闡明IRT1基因在缺磷減少植物鎘吸收中的作用，比較了缺磷對Col-0和irt1突變體系，其鎘含量超過了2 000 mg·kg-1。與正常供磷處理相比，缺磷處理使Col-0擬南芥地上部和根系中鎘的含量減少了約40%和55%。說明缺磷可以減少擬南芥體內(nèi)的鎘含量，從而緩解鎘脅迫。40 μmol·L-1鎘處理8 d后，缺磷處理降低了irt1突變體根系和地上部的鎘含量，但其降低幅度低于Col-0野生型植株。綜上，缺磷可以減少鎘脅迫下擬南芥體內(nèi)的鎘含量，IRT1基因可能參與這一過程。

數(shù)據(jù)以鮮質(zhì)量計。Data was detected based on fresh weight.圖3 鎘脅迫下不同供磷處理的野生型擬南芥H2O2含量Fig.3 H2O2 content of wild-type Arabidopsis thaliana of different phosphorus treatments under cadmium stress

圖4 鎘脅迫下不同供磷處理的野生型擬南芥根系IRT1基因相對表達量Fig.4 Relative expression of IRT1 gene in root of wild-type Arabidopsis thaliana of different phosphorus treatments under cadmium stress

鎘含量的影響。由圖5可見，40 μmol·L-1鎘處理8 d后，Col-0植株體內(nèi)積累了大量的鎘，尤其是根

數(shù)據(jù)以干質(zhì)量計。Data was detected based on dry weight.圖5 鎘脅迫下不同供磷處理的野生型擬南芥和irt1突變體擬南芥鎘含量Fig.5 Cd content of wild-type Arabidopsis thaliana and irt1 mutants of different phosphorus treatments under cadmium stress

3 討論

植物體內(nèi)的鎘含量是決定其毒害程度的重要因素之一。本研究中，缺磷處理可顯著降低鎘脅迫下擬南芥體內(nèi)的鎘含量，緩解了Col-0野生型擬南芥因鎘脅迫導(dǎo)致的H2O2積累、葉片失綠黃化。說明在鎘污染環(huán)境中，缺磷處理可以減少植物對鎘的吸收，從而緩解鎘毒害。

鎘脅迫下，缺磷處理也顯著抑制了擬南芥鐵轉(zhuǎn)運蛋白基因IRT1的表達。由于磷酸根離子可與鐵離子形成沉淀物，植物體內(nèi)磷與鐵元素存在拮抗作用，這意味著提高植物體內(nèi)的磷水平可能會降低胞內(nèi)鐵的有效性，相反，降低植物體內(nèi)的磷水平則可提高胞內(nèi)鐵的有效性。這在Abel[7]和Hirsch等[8]的研究中得到了證實。因此，缺磷處理造成IRT1基因表達受抑制可能與缺磷條件下植物體內(nèi)鐵有效性的提高有關(guān)。由于Cd2+與Fe2+水合離子半徑高度相似[11]，雙子葉植物中Fe2+吸收轉(zhuǎn)運體IRT1已被證明是根系吸收Cd2+的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白之一[12]。在此基礎(chǔ)上，一些研究發(fā)現(xiàn)，脫落酸、銨和增加外源供鐵處理均可通過抑制IRT1表達來減少植物根系對鎘的吸收[9，13-14]。鑒于缺磷顯著抑制擬南芥根系中IRT1的表達，認為缺磷也是通過抑制根系中IRT1的表達來減少植物對鎘的吸收。這一結(jié)論在IRT1功能缺失的突變體irt1中得到證實，因為缺磷處理對該突變體鎘含量的降低效果明顯低于Col-0野生型植株。

需要指出的是，在irt1突變體中，缺磷處理仍略微提高了擬南芥體內(nèi)的鎘含量，說明其他非IRT1途徑也在缺磷減少植物鎘吸收中發(fā)揮作用。除了IRT1蛋白，OPT3和Nramp家族鐵轉(zhuǎn)運蛋白等也能同時轉(zhuǎn)運鐵、鎘[15-16]，缺磷也可能通過降低其他基因的表達量來減少植物的鎘含量。這一推測有待于在今后的研究中利用相關(guān)突變體進行驗證。