郭富城，金 麗，蘇 強(qiáng)，粟雨芯，李方琳，陳士恩，馬曉霞，*

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

豬流行性腹瀉病(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的疾病，其癥狀與豬的傳染性胃腸炎(TGE)相似，主要呈現(xiàn)出動(dòng)物腹瀉、脫水、腸絨毛萎縮以及仔豬體質(zhì)量減輕等[1-2]。通常情況下，PEDV以糞口途徑進(jìn)行傳播，但是最近有研究表明也可通過(guò)空氣傳播[3-4]。盡管各個(gè)年齡段的豬均能夠被感染并出現(xiàn)不同程度的癥狀，但仔豬病情尤為嚴(yán)重，其致死率高達(dá)100%[5]。1978年該病首次從患病豬的病料中分離，并命名為CV777株[6]。由于該病發(fā)病突然、傳播快，并且流行范圍廣泛，目前世界上養(yǎng)豬的國(guó)家都報(bào)道過(guò)該病，發(fā)生最嚴(yán)重的是歐洲和亞洲[7-10]，給養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。PEDV共編碼6個(gè)開(kāi)放閱讀框，分別編碼2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白包括ORF3蛋白、編碼復(fù)制酶多聚蛋白lab(pplab)，結(jié)構(gòu)蛋白包括核衣殼蛋白(N)、纖突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)，其中核衣殼蛋白(N)、纖突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)、ORF3蛋白是致病因子[11]。核衣殼蛋白(N)是一種磷酸化的蛋白，能夠與病毒的RNA相互纏繞形成核衣殼，同時(shí)能夠與細(xì)胞膜和磷脂結(jié)合促進(jìn)病毒的組裝[12]。由于PEDV臨床上引起的疾病與豬傳染性胃腸炎難以辨別區(qū)分，需要借助實(shí)驗(yàn)室手段對(duì)PED進(jìn)行鑒別診斷，PEDV N 蛋白高度保守[1]，在豬感染PEDV早期體內(nèi)就能夠產(chǎn)生高水平的抗N蛋白的抗體，但是考慮到PEDV感染細(xì)胞后的感染滴度較低，大量制備抗體比較困難，因此，可以將N蛋白作為PED感染早期診斷治療的靶蛋白[13]，雖然近些年報(bào)道了不少N蛋白表達(dá)與單克隆抗體的制備，但尚未得以應(yīng)用[14-16]。本研究構(gòu)建并制備了較高純度的N蛋白，并應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)出PEDV-N蛋白的B細(xì)胞抗原表位，能夠更好地了解其抗原特性，旨在為PEDV-N蛋白體外表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用及研制相關(guān)診斷試劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、病毒

E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)菌株，購(gòu)買于北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET-28a(+)表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；豬流行性腹瀉病毒N基因的DNA序列(GenBank登錄號(hào)為KC210145)。

1.2 試劑

TRIzol購(gòu)于Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)于蘭州美伯生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)非預(yù)染與預(yù)染Marker購(gòu)于美國(guó)Thermo scientific公司；鼠源His標(biāo)簽的單抗、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.3 PEDV-N基因擴(kuò)增

以豬流行性腹瀉病毒RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，擴(kuò)增PEDV-N基因，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)合成PEDV-N基因特異性的引物，且在上下游引物5′端分別引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增后的目的條帶大小為1 326 bp左右，引物由中國(guó)西安擎科合成，具體引物信息如下：PEDV-N-F：5′-CGGGATCCATGGCTTCTGTCAGCTTTCAGGATC-3′；PEDV-N-R：5′-CCGCTCGAGTTAATTTCCTGTATCGAAGATCTCG-3′。

1.4 重組質(zhì)粒pET-28a-N的構(gòu)建

將膠回收的目的基因與原核表達(dá)載體pET-28a分別用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切后，直接用T4 DNA連接酶16 ℃過(guò)夜連接，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，涂板于含有K+的LB固體培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單個(gè)菌落于含有K+的液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)8 h，然后抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，將陽(yáng)性質(zhì)粒送上海金唯智生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET-28a-N。

1.5 重組質(zhì)粒pET-28a-N表達(dá)及Western blot鑒定

將重組質(zhì)粒pET-28a-N轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600值達(dá)到0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，培養(yǎng)6 h。收集菌體，加入PBS超聲裂解，離心分別收集上清和沉淀，加入5×SDS loading buffer變性10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色1 h，用脫色液脫色后觀察蛋白表達(dá)情況。設(shè)空載體組和未誘導(dǎo)表達(dá)組，進(jìn)行Western blot鑒定。具體操作如下：變性處理后的菌液進(jìn)行10% SDS-PAGE；通過(guò)濕轉(zhuǎn)在200 mA的恒流下轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂乳室溫封閉2 h；加入鼠源單抗Anti-His標(biāo)簽抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過(guò)夜孵育；用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h；用TBST 洗滌3次，顯色液顯色，凝膠成像儀留圖。

1.6 PEDV-N蛋白的原核表達(dá)條件優(yōu)化

將構(gòu)建好的原核表達(dá)陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-28a-N菌液按1∶100的比例加入新的LB液體培養(yǎng)基中搖晃培養(yǎng)至菌液D600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG(終濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1)22 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜12 h，超聲裂解收集上清后進(jìn)行SDS-PAGE。同樣的，在確定好IPTG最佳濃度時(shí)，加入IPTG在22 ℃分別誘導(dǎo)6、8、10和12 h收取菌液，超聲裂解收集上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.7 PEDV-N蛋白的純化

將挑取的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液D600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG(終濃度為0.6 mmol·L-1)，在最佳培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間下誘導(dǎo)菌體表達(dá)，收集菌體，用PBS清洗2次。將收集的菌體用裂解液(20 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O，500 mmol·L-1NaCl，6 mol·L-1尿素，1 mmol·L-1PMSF)重懸，超聲破碎，250 W，破碎2 s，停4 s，30 min。4 ℃，13 050×g，離心15 min，收上清，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，將過(guò)濾收集的上清加入到Ni-NTA親和樹(shù)脂，4 ℃孵育過(guò)夜。用低濃度的咪唑20倍體積洗脫雜蛋白，用高濃度的咪唑洗脫下目的蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度。

1.8 PEDV-N蛋白的3D模擬結(jié)構(gòu)

通過(guò)在線軟件Swiss-Pdb Viewer蛋白分析模擬PEDV典型毒株CV777的N蛋白三維結(jié)構(gòu)。

1.9 PEDV-N蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

利用DNA Star軟件中的Protean模塊，采用Kyle Doolittle的氨基酸親水性標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測(cè)親水性參數(shù)(hydrophilicity)[17]，用Emini方法預(yù)測(cè)可及性參數(shù)(surface probability)[18]，用Jameson-Wolf 方法預(yù)測(cè)抗原指數(shù)(antigenic index)[19]，將各個(gè)參數(shù)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，然后確定N結(jié)構(gòu)蛋白的B細(xì)胞抗原優(yōu)勢(shì)表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET-28a-N的構(gòu)建與鑒定

將擴(kuò)增的PEDV-N基因產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果大小與預(yù)期目的條帶大小一致(圖1-A)。該基因擴(kuò)增產(chǎn)物回收后與原核表達(dá)載體pET-28a(+)質(zhì)粒連接，并經(jīng)過(guò)核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切驗(yàn)證，能夠獲得與預(yù)期大小一致的目的條帶(圖1-B)。將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，序列完全一致，保存菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

A:PEDV N基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。M，DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量(DL2000)；1，PEDV N基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。B：重組質(zhì)粒pET-28a-N的雙酶切結(jié)果。M，DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量(DL5000)；1、2分別為pET-28a-N雙酶切。A: PCR amplification results of PEDV N gene. M， DNA marker DL2000; 1， PCR amplification results of PEDV N gene. B: Results of double enzymatic cleavage of recombinant plasmid pET-28a-N. M， DNA marker DL5000; 1， 2 were double enzymatic cleavage of pET-28a-N.圖1 PEDV-N基因擴(kuò)增結(jié)果及重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 PCR products of N gene of PEDV and identification of recombinant expression plasmids (pET28a-PEDV-N)

2.2 重組質(zhì)粒pET-28a-N的誘導(dǎo)表達(dá)與Western blot鑒定

含有重組質(zhì)粒的pET-28a-N和空載體pET-28a質(zhì)粒的E.coliBL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，利用SDS-PAGE電泳鑒定，可以看出，與空載體pET-28a相比，含pET-28a-N載體的E.coliBL21誘導(dǎo)后出現(xiàn)了相對(duì)分子質(zhì)量約為52 ku的目的條帶，與N蛋白大小相符(圖2-A)。進(jìn)一步將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的含pET-28a-N和pET-28a的E.coliBL21菌液進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示，pET-28a-N轉(zhuǎn)化表達(dá)菌誘導(dǎo)后出現(xiàn)約為52 ku的目的條帶，而pET-28a對(duì)照組中并沒(méi)有出現(xiàn)此條帶(圖2-B)。

2.3 PEDV-N蛋白的原核表達(dá)條件優(yōu)化

在轉(zhuǎn)化陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-28a-N的E.coliBL21菌液中加入IPTG(終濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1)，于22 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜12 h，超聲裂解收集上清后進(jìn)行SDS-PAGE(圖3-A)，可以確定最佳IPTG濃度為0.6 mmol·L-1。同樣的，在IPTG最佳濃度0.6 mmol·L-1時(shí)，在22 ℃分別誘導(dǎo)5、6、7和8 h收取菌液，超聲裂解收集上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間，結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)7 h蛋白表達(dá)量較高(圖3-B)。

A：N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。M，預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，未誘導(dǎo)的pET-28a-N轉(zhuǎn)化菌；2，IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-N轉(zhuǎn)化菌(全液)；3，IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-N轉(zhuǎn)化菌(上清)；4，IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-N轉(zhuǎn)化菌(沉淀)。B：N蛋白的Western blot結(jié)果。1，IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-N轉(zhuǎn)化菌(全液)；2，IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-N轉(zhuǎn)化菌 (上清)；3，IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-N轉(zhuǎn)化菌 (沉淀)；4，未誘導(dǎo)的pET-28a-N轉(zhuǎn)化菌。A: Induced expression of N protein. M， Protein marker;1， pET-28a-N uninduced;2， pET-28a-N induced by IPTG(all the fluid);3， pET-28a-N induced by IPTG(supenrnatant); 4， pET-28a-N induced by IPTG(precipitate). B: Western blot of N protein. 1， pET-28a-N induced by IPTG(all the fluid); 2， pET-28a-N induced by IPTG(supenrnatant); 3， pET-28a-N induced by IPTG(precipitate); 4， pET-28a-N uninduced.圖2 重組PEDV-N蛋白在大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析與Western blot鑒定Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant N protein expressed in E. coli BL21 induced by IPTG and Western blot analysis of recombinant PEDV-N protein

A：優(yōu)化PEDV-N蛋白的IPTG濃度。M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～7，IPTG終濃度分別為0， 0.1， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0 mmol·L-1。B：優(yōu)化PEDV-N蛋白的誘導(dǎo)時(shí)間。M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～7，誘導(dǎo)時(shí)間分別為0， 5， 6， 7， 8 h。A: Optimization of IPTG concentration of PEDV-N protein. M， Protein marker; 1-7， IPTG induced final concentration was 0， 0.1， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8 and 1.0 mmol·L-1， respectively. B: Optimization of IPTG induction time of PEDV-N protein. M， Protein marker; 1-5， Induction time was 0， 5， 6， 7， and 8 h， respectively.圖3 PEDV-N蛋白原核表達(dá)IPTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化Fig.3 Prokaryotic expression of PEDV-N protein and optimization of IPTG concentration and induction time

2.4 重組質(zhì)粒pET-28a-N蛋白的純化

pET-28a-N轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)經(jīng)最佳IPTG濃度0.6 mmol·L-1誘導(dǎo)至最佳誘導(dǎo)時(shí)間7 h后，收集菌體，超聲裂解，離心收集上清，4 ℃掛柱過(guò)夜，除雜蛋白后，洗脫N蛋白，獲得了純度較高的N蛋白(圖4)。

2.5 PEDV-N蛋白的3D結(jié)構(gòu)的建立

M，預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-N轉(zhuǎn)化菌；2，流穿液；3，低濃度咪唑洗脫雜蛋白液；4～8，洗脫的N蛋白。M, Protein marker; 1, pET-28a-N induced by IPTG; 2, Passing through liquid; 3, Wash buffer; 4-8, Purified N protein by His Bind Kit.圖4 重組N蛋白的純化結(jié)果Fig.4 Purification result of recombinant N protein

同源建模也可稱比較建模，是利用已知的同源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)建立目的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型。通過(guò)蛋白分析軟件Swiss-Pdb Viewer得到模擬的N結(jié)構(gòu)蛋白的3D模型，可以看出，其構(gòu)象中存在α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)則卷曲(圖5)。

2.6 PEDV-N蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

利用DNA-Star軟件中的Protean對(duì)PEDV CV777毒株N蛋白的氨基酸序列進(jìn)行B淋巴細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)。通過(guò)Gamier-Robson方法與Chou-Fasman方法結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)N蛋白中存在豐富的β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)較多，β-折疊結(jié)構(gòu)較少。利用DNA Star軟件中的Protean對(duì)N蛋白的親水性、柔韌性、抗原性指數(shù)和表面可及性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6所示。在抗原指數(shù)較高(指數(shù)≥0)的區(qū)段中，選取其內(nèi)部既具有親水性區(qū)域(指數(shù)≥0)又具有柔韌性好及抗原性強(qiáng)(指數(shù)≥0)的區(qū)域，B細(xì)胞表位很可能位于或者在鄰近此區(qū)段。另外根據(jù)N蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果，選取含有無(wú)規(guī)則卷曲與β -轉(zhuǎn)角的區(qū)域，最終B細(xì)胞表位(氨基酸肽段)的區(qū)段可能位于N端，一共13個(gè)，分別為：6-15、23-32、40-49、60-66、85-93、100-106、146-152、156-166、176-182、193-213、237-278、280-288及378-397，具體信息見(jiàn)表1。

圖5 PEDV-N蛋白的3D結(jié)構(gòu)Fig.5 3D structure of PEDV-N protein

圖6 N蛋白的抗原性、親水性和表面可及性分析Fig.6 Analysis of the hydrophilicity， antigenic index and surface probability of N protein

表1 PEDV N蛋白可能的B細(xì)胞抗原表位

Table 1 Prediction for cell epitopes of PEDV-N

順序Order氨基酸位置The position of amino acids B細(xì)胞抗原表位的潛在序列The potential B epitopes sequences of antigens16-15FQDRGRKRVP223-32RVTNDKPLSK340-49PTNKGNKDQQ460-66RMRRGER585-93DLRYRTRTE6100-106KEGAKTE7146-152NSRSRSR8156-166NNRSRSPSNNR9176-182QNRGNNQ10193-213NNNNNNKSRNQSKNRNQSNDR11237-278ENPDKLKQQQKPKQERSDSSGKNTPKKNKSRATSKERDLKDI12280-288EWRRIPKGE13378-396NAKPQRKKEKKNKRETTQQ

3 討論與結(jié)論

豬流行性腹瀉病于1971年首次發(fā)現(xiàn)于英國(guó)[20]，我國(guó)內(nèi)地自20世紀(jì)80年代初以來(lái)陸續(xù)有關(guān)于 PEDV分離和鑒定的報(bào)道[21]。從2010年末開(kāi)始，我國(guó)東南沿海地區(qū)率先暴發(fā)以新生仔豬嚴(yán)重腹瀉、高發(fā)病率及高死亡率為主要特征的腹瀉疫情，哺乳仔豬的死亡率可達(dá) 100%，疫情隨后擴(kuò)散至其他各地，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[22]。2013年美國(guó)也開(kāi)始暴發(fā)仔豬腹瀉疫情，隨后墨西哥、加拿大、韓國(guó)以及日本等國(guó)家和我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)也相繼暴發(fā)具有新流行特點(diǎn)的仔豬腹瀉疫情[23]。研究表明，此次全球范圍內(nèi)PED暴發(fā)與PEDV的新變異毒株有關(guān)[2，24]。目前，豬流行性腹瀉病的發(fā)生在我國(guó)呈現(xiàn)常態(tài)化，是威脅養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要疫病之一，需要給予高度關(guān)注[25]。

PEDV的N蛋白在病毒RNA合成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，它能與細(xì)胞膜和磷脂結(jié)合，促進(jìn)病毒的組裝和RNA復(fù)制體的形成。并且N蛋白在PEDV的結(jié)構(gòu)蛋白中所占的比例最大，在感染的細(xì)胞中能得到大量表達(dá)。豬在感染PEDV的早期體內(nèi)就能產(chǎn)生抗N蛋白的高水平抗體[26-27]。有相關(guān)報(bào)道稱，PEDV-N蛋白能夠抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生并激活NF-κB途徑以逃避宿主的抗病毒免疫[28]。N蛋白在PEDV毒株中保守性極高，又在冠狀病毒的不同屬性之間變化。因此，PEDV-N蛋白可用作體內(nèi)和體外早期檢測(cè)PEDV感染的候選靶蛋白。近期，有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)在N端存在的兩個(gè)表位在PEDV與TGEV之間有交叉反應(yīng)現(xiàn)象[29]。本研究利用豬流行性腹瀉病毒進(jìn)行N基因的克隆，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列比對(duì)一致，未發(fā)生突變。然后構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-N，并獲得純度較高的N蛋白，通過(guò)對(duì)該基因進(jìn)行原核表達(dá)及蛋白免疫印跡分析表明，其與全病毒多抗血清有很好的免疫反應(yīng)活性，且該段基因的上清和沉淀中均有一條分子質(zhì)量約為52 ku的條帶，能夠建立檢測(cè)PEDV-N蛋白抗體的血清學(xué)檢測(cè)。

本研究通過(guò)DNA Star軟件中的Protean對(duì)PEDV CV777毒株的N蛋白的氨基酸序列進(jìn)行B淋巴細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)，雖然單參數(shù)能夠預(yù)測(cè)某一具體蛋白質(zhì)的抗原表位但仍具有局限性，親水性與可及性是形成表位的首要條件，并不能說(shuō)明其一定具有抗原性，表位的形成還與序列中特定氨基酸的出現(xiàn)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象有關(guān)。本研究采用多種單參數(shù)預(yù)測(cè)模型及相關(guān)分析軟件結(jié)合的方法，這樣避免了單參數(shù)的局限性，經(jīng)過(guò)多參數(shù)綜合考慮可提高其準(zhǔn)確性。通過(guò)Gamier-Robson方法與Chou-Fasman方法結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)N蛋白中存在豐富的β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)較多，β-折疊結(jié)構(gòu)較少。采用Kyle Doolittle的氨基酸預(yù)測(cè)親水性參數(shù)、Emini方法預(yù)測(cè)可及性參數(shù)以及用Jameson-Wolf方法預(yù)測(cè)抗原指數(shù)，將各個(gè)參數(shù)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，然后確定N結(jié)構(gòu)蛋白的B細(xì)胞抗原優(yōu)勢(shì)表位(氨基酸肽段)的區(qū)段可能位于N端，一共13個(gè)，分別為：6-15、23-32、40-49、60-66、85-93、100-106、146-152、156-166、176-182、193-213、237-278、280-288及378-397。本研究結(jié)果可作為N蛋白潛在的表位參考數(shù)據(jù)，可為今后診斷試劑的制備及單克隆抗體的篩選提供科學(xué)的依據(jù)。