周冠進(jìn)，孫玉婷，周李煜，陳韋凱，掌琳惠，胡文祺，劉福明，袁冬平

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

動脈粥樣硬化(AS)病理過程涉及大中動脈內(nèi)膜脂質(zhì)累積，并以血管壁慢性炎癥為特征[1]。血管炎癥發(fā)展過程中存在大量免疫炎性細(xì)胞[2]，包括巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和其他參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞[3]，巨噬細(xì)胞占據(jù)了這些細(xì)胞中的大部分[4]，其作為先天性免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞，在AS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。巨噬細(xì)胞具有不同亞型，M1型巨噬細(xì)胞是一種炎性細(xì)胞，促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展，而M2型巨噬細(xì)胞則具有炎癥抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，人類晚期動脈內(nèi)膜病變中存在大量M1型巨噬細(xì)胞[6]，巨噬細(xì)胞向M1型極化是AS的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。

冠心平是江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，在臨床使用已有十余載，療效確切。其主治功能為冠心病中的穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死的輔助治療，并且對AS治療效果顯著，但其作用機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)在體外RAW264.7巨噬細(xì)胞中探討了冠心平含藥血清對其極化的影響，并提出這可能是冠心平發(fā)揮抗AS作用的一個(gè)潛在機(jī)制，為臨床上冠心平的應(yīng)用提供了更多的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

5417R型低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；Infinite M200PRO酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；Revco ULT超低溫冰箱(美國Thermo Fisher公司)；NanoDrop One微量紫外可見分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher公司)；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.2 藥物與試劑

冠心平片(江蘇省中醫(yī)院制備，批號：1812008；藥片研磨成粉末后溶于蒸餾水并進(jìn)行梯度稀釋)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(MultiSciences；70-EK282/3-48)；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(MultiSciences；70-EK981-48)；FITC Anti-Mouse CD206(Invitrogen；批號：UB2722231A)；PE Anti-Mouse F4/80(Invitrogen；批號：1950719)；APC Anti-Mouse CD86(Invitrogen，批號：4332810)；TRIzol試劑(Ambion)；Nuclease-free水(abm；G491)；DEPC水(biosharp；BL510A)；1× TE水(biosharp；BL531A)；5× All-In-One RT MasterMix(abm；G490)；EvaGreen 2× qPCR MasterMix(abm；MasterMix-PL)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

SD大鼠分為空白組、冠心平低劑量組(0.405 g/kg)、冠心平中劑量組(0.810 g/kg)、冠心平高劑量組(1.620 g/kg)，灌胃給藥4 d，末次給藥后1 h腹主動脈取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min提取血清，56 ℃熱滅活30 min，細(xì)胞給藥前0.22 μm濾器過濾。

巨噬細(xì)胞極化造模：取RAW264.7細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為3×105mL-1，接種于6孔板，貼壁培養(yǎng)12 h后藥物處理24 h，除空白組以外的其余各組細(xì)胞在藥物處理結(jié)束后加入100 ng/mL LPS刺激12 h。

2.2 ELISA法測定培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子含量

ELISA法測定細(xì)胞上清TNF-α、TGF-β1水平，具體參考試劑盒說明書進(jìn)行，通過酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞極化特征性分子

細(xì)胞密度調(diào)整為3×105mL-1，接種于6孔板，培養(yǎng)12 h。藥物作用結(jié)束后，收集細(xì)胞，4 ℃離心(2 000 r/min；5 min)，于100 μL染色緩沖液(1% BSA-PBS)中重懸，加入相應(yīng)流式抗體(F4/80：1.25 μL；CD86：0.3 μL；CD206：5 μL)進(jìn)行表面染色，4 ℃避光孵育30 min，1 mL染色緩沖液洗滌1次，離心，500 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

2.4 qPCR法檢測巨噬細(xì)胞極化特征性分子mRNA表達(dá)水平

使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄成模板DNA前，RNA定量為100 ng/μL。qPCR操作及反應(yīng)條件按試劑盒說明書進(jìn)行，其中引物委托上海生工生物工程有限公司合成，引物信息見表1。數(shù)據(jù)按2-ΔΔCt法(內(nèi)參GAPDH)分析。

表1 引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 冠心平對M1/M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響

ELISA法檢測巨噬細(xì)胞上清細(xì)胞因子分泌情況。結(jié)果顯示，與模型組相比，冠心平高劑量組細(xì)胞TNF-α分泌水平顯著下降(P<0.01)；冠心平各劑量組細(xì)胞TGF-β1分泌水平均顯著下降(P<0.01)。結(jié)果見圖1。

3.2 冠心平對巨噬細(xì)胞M1/M2型表面分子表達(dá)水平的影響

流式檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組細(xì)胞CD86表達(dá)顯著升高(P<0.01)，CD206表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，冠心平低、高劑量組CD86表達(dá)顯著性下降(P<0.05～0.01)，而CD206表達(dá)顯著增加(P<0.05～0.01)。結(jié)果見圖2。

3.3 冠心平對巨噬細(xì)胞M1/M2型特征分子mRNA表達(dá)水平的影響

qPCR檢測各組巨噬細(xì)胞CD86、CD206 mRNA水平。結(jié)果顯示，與模型組比較，CD86mRNA水平均未出現(xiàn)顯著性變化，而CD206 mRNA水平在給藥各劑量組中均出現(xiàn)顯著上升(P<0.05～0.01)。結(jié)果見圖3。

4 討論

由AS引起的各類心血管疾病是全世界人口死亡的重要原因。不平衡的脂質(zhì)代謝和慢性炎癥反應(yīng)是AS的潛在發(fā)病機(jī)制[7]。巨噬細(xì)胞對AS的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生了重要作用，體內(nèi)缺乏巨噬細(xì)胞的小鼠，其AS進(jìn)程減緩[8-9]，而巨噬細(xì)胞亞群M1/M2比例失衡能夠反映AS疾病進(jìn)程并能夠影響其發(fā)生發(fā)展。經(jīng)典激活的M1型巨噬細(xì)胞具有促炎效應(yīng)，而選擇性激活的M2型巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)出炎性抑制作用[10]。

冠心平治療AS臨床效果明確，但其是否可以通過影響巨噬細(xì)胞極化尚未見報(bào)道。本研究采用小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系作為研究對象，選用LPS進(jìn)行處理，在體外模擬巨噬細(xì)胞在AS環(huán)境中受到的炎性刺激，造成巨噬細(xì)胞M1型極化模型，100 ng/mL LPS處理的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出M1型極化特征，而冠心平含藥血清的干預(yù)則抑制了M1型極化，促進(jìn)向M2極化。

TNF-α主要由M1型巨噬細(xì)胞分泌，增強(qiáng)和維持炎性應(yīng)答[11-12]，TGF-β1則主要由M2型巨噬細(xì)胞分泌。研究結(jié)果表明，高劑量的冠心平含藥血清抑制巨噬細(xì)胞TNF-α分泌。然而，冠心平含藥血清降低了巨噬細(xì)胞TGF-β1的分泌，這與我們預(yù)期的結(jié)果不一致。為此，我們進(jìn)一步觀察了巨噬細(xì)胞的表型變化。

CD86和CD206分別是M1和M2巨噬細(xì)胞的特征性表面分子[13]，CD86表達(dá)的增加意味著M1型巨噬細(xì)胞的增加，而CD206的增加則代表著更多M2巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生。流式結(jié)果表明，冠心平含藥血清處理抑制了巨噬細(xì)胞M1型極化而有利于M2型極化。對于CD206 mRNA的檢測結(jié)果與流式結(jié)果一致，表明了M2型巨噬細(xì)胞的增加。這說明冠心平含藥血清巨噬細(xì)胞極化的作用在M1/M2表型中較為明顯，而對其功能的調(diào)控可能稍弱。我們推測冠心平含藥血清可能首先改變了巨噬細(xì)胞表型，但對于其功能的發(fā)揮在本實(shí)驗(yàn)條件下尚未顯示出效果。另外，TGF-β1功能具有多樣性，冠心平在體外導(dǎo)致了巨噬細(xì)胞TGF-β1分泌減少，但這可能在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中對某些下游炎性因素具有調(diào)控作用,這將在我們今后的實(shí)驗(yàn)中加以證實(shí)。

綜上，冠心平含藥血清一定程度上抑制了小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系向M1型極化，促進(jìn)其向M2型極化，并且這可能是其治療AS的一個(gè)潛在機(jī)制，關(guān)于其產(chǎn)生這些效應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制還值得進(jìn)一步探究。