馬麗 郭學(xué)良 周勝楠 王穎 田維爽 閆世月

(商丘師范學(xué)院，商丘 , 476000)

雙色茉莉(BrunfelsialatifoliaBenth.)，又名番茉莉、鴛鴦茉莉，是茄科鴛鴦茉莉?qū)俪＞G矮灌木，株高30～100 cm。葉片呈長卵形，暗綠色，單葉互生?；▎紊驇锥嗝苌?，聚傘花序，花被具五淺裂，好似五瓣梅花。雙色茉莉花初開為淡紫色，后逐漸轉(zhuǎn)變成白色，單花開放3～5 d，花期4—10月份。因花開有先后，同一株雙色茉莉常能觀賞到兩種顏色的花朵，故名雙色茉莉[1]?；ㄩ_期間芳香撲鼻，為觀賞者展示了一個更迭變換的空間，使觀賞變得饒有趣味，深得人們的喜愛。

雙色茉莉結(jié)實少或不結(jié)實，限制了雙色茉莉有性繁殖的發(fā)展；而采用扦插、高空壓條等無性繁殖的方法，成苗慢，生根較難，且植株生長不良，不利于工廠化生產(chǎn)[2]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)為植物的大量快速繁殖提供了新的途徑。植物組織培養(yǎng)研究至今已有100多年歷史，已成為生物學(xué)科研究的重要技術(shù)手段[3]。目前，許多觀賞植物、園藝作物、經(jīng)濟林木、無性繁殖作物等均已采用組織培養(yǎng)技術(shù)進行離體快速繁殖并獲得了成功，試管苗生產(chǎn)在國內(nèi)外市場上已經(jīng)形成產(chǎn)業(yè)化[4]。近幾年，隨著經(jīng)濟水平的提高，觀賞花卉需求量劇增，各類觀賞花卉的離體快速繁殖體系的建立成為近年來研究的熱點。目前，有關(guān)雙色茉莉的組織培養(yǎng)也有報道，但多見于用莖段或莖尖為外植體進行腋芽或頂芽的誘導(dǎo)和增殖[5-6]。而對雙色茉莉經(jīng)過愈傷組織途徑進行離體再生的研究鮮見報道。通過愈傷組織進行不定芽誘導(dǎo)，由于不定芽形成的數(shù)量與腋芽數(shù)目無關(guān)，其增殖率高，易形成芽叢且繁殖速度快[7]。20世紀(jì)80年代，付凱等[8]最早簡述了利用雙色茉莉嫩葉進行組織培養(yǎng)的方法，但沒有經(jīng)過愈傷組織途徑，而是直接從葉枕處分化出不定芽，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，且生根率高達90%以上。袁媛等[9]以雙色茉莉的花瓣、葉片、莖段為外植體進行了研究，指出嫩葉的污染率最低，且愈傷誘導(dǎo)率最高，平均出愈時間最短。

本研究以雙色茉莉葉片為外植體，探討取材時期、消毒時間、不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以期篩選適宜于雙色茉莉愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，為雙色茉莉離體快繁提供理論依據(jù)，也為雙色茉莉高效、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，以滿足市場的需求。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為商丘市金世紀(jì)花卉市場購買的3年生雙色茉莉，開花時顏色由深藍色轉(zhuǎn)為淺紫色，最后轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨?，在溫室養(yǎng)護1個月左右進行試驗。

1.2 材料處理及培養(yǎng)條件

選擇天氣晴朗的下午，摘取雙色茉莉幼嫩且完全展開的葉片(頂端第3～5片葉)。放入清洗干凈的燒杯中，加入肥皂水漂洗5～10 min，洗凈葉片上的灰塵以及其他附著物，再用紗布蓋好燒杯口，在流動的自來水下沖洗30 min。接種之前，在超凈工作臺上，將葉片用75%酒精處理10 s，在無菌水中浸泡3～5 min，然后用0.1%氯化汞溶液浸泡6 min，最后用無菌水沖洗4～5次。在超凈工作臺上進行無菌操作，用解剖刀垂直葉脈劃出傷口，將葉片切成約0.5 cm×0.5 cm大小，正面朝上接種在培養(yǎng)基上。

培養(yǎng)基在121 ℃條件下滅菌20 min，高溫滅菌前pH值調(diào)至5.8左右；接種后在培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照時間為12 h·d-1，光照強度2 000 lx的無菌室中培養(yǎng)。

1.3 試驗設(shè)計

取樣時期試驗：分別在4、5、6、10月份進行初代培養(yǎng)，每瓶接種3個外植體，每個時期接種20瓶，觀察愈傷組織生長狀況。

消毒時間試驗：以MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA為培養(yǎng)基，4月份取幼嫩葉片，升汞消毒時間分別設(shè)定為3、4、5、6、7、8 min，接種30 d后觀察愈傷組織生長狀況。

不同激素配比試驗：在MS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA、KT，培養(yǎng)基中加入瓊脂6 g·L-1、蔗糖30 g·L-1。4月份取幼嫩葉片接種，30 d后觀察愈傷組織生長情況。不同激素配比組成見表1。

1.4 測定指標(biāo)與方法

污染率=(污染數(shù)/接種數(shù))×100%。

愈傷組織誘導(dǎo)率=(未污染外植體產(chǎn)生愈傷組織數(shù)/未污染外植體總數(shù))×100%。

愈傷化程度的測定指標(biāo)：“+”表示小于50%葉片劃傷處；“++”表示大于50%葉片劃傷處；“+++”表示大于50%葉片劃傷處和主脈部位；“++++”表示大于50%葉片劃傷處、主脈部位和葉片表面或背面被愈傷組織覆蓋。

表1 不同激素配比組成

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時間對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表2顯示，4月份和10月份誘導(dǎo)愈傷組織生長狀況最好，呈翠綠色顆粒狀，且污染率較其他時期明顯降低，僅分別為5.5%、6.7%，而5月份和6月份污染率分別為34.5%和48.7%。且4月份和10月份誘導(dǎo)率均達100%，而5月份和6月份愈傷組織誘導(dǎo)率僅為51.8%和42.8%。同時，4月份和10月份采集的葉片出愈時間較早，其愈傷組織形成高峰期比5月份和6月份的材料平均提前5 d，且4月份和10月份的愈傷化程度較高，有利于雙色茉莉的離體快速繁殖。

表2 取材時間對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 消毒時間對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3可以看出，增加升汞對外植體的浸泡時間可以有效降低污染率，但是過長的時間也會使葉片的生理功能受到不同程度的損傷。將葉片在升汞中浸泡7～8 min，葉片明顯失去原有的綠色，且產(chǎn)生的愈傷組織呈現(xiàn)黃綠色；而浸泡時間為3～4 min時，葉片雖然保持了原有的生理活性，但是愈傷化程度較低，且誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織生長狀況不佳；浸泡5～6 min時，葉片的愈傷化程度最高，且愈傷組織生長狀況最優(yōu)。綜上所述，以雙色茉莉葉片為外植體，在0.1%氯化汞溶液中浸泡5～6 min最有利于雙色茉莉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)。

表3 消毒時間對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表4和圖1中M1～M8處理相比可以看出，細胞分裂素質(zhì)量濃度/生長素質(zhì)量濃度對誘導(dǎo)愈傷組織有一定影響，比值相同的愈傷化程度和愈傷組織生長狀況基本一致，其中M4、M5、M6、M8處理細胞分裂素質(zhì)量濃度/生長素質(zhì)量濃度為1/4～1，誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織生長狀況較優(yōu)，且愈傷化程度較高。由此可見，NAA有利于誘導(dǎo)雙色茉莉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，而高質(zhì)量濃度6-BA則相反，不利于愈傷組織的形成。有利于雙色茉莉葉片愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA、MS+1.0 mg·L-16-BA+2.0mg·L-1NAA、MS+1.0 mg·L-16-BA+4.0 mg·L-1NAA和MS+2.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA。

與M4相比，M9～M11中加入了KT，由表4和圖1可見，添加不同質(zhì)量濃度的KT溶液對誘導(dǎo)愈傷組織沒有產(chǎn)生正向作用，其愈傷化程度和愈傷組織生長狀況均不及未添加KT的處理，且劃傷處愈傷組織顏色明顯變?yōu)槟G色水浸褐化狀。因此，KT不利于雙色茉莉葉片誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)。

表4 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)論與討論

本研究表明，取材的時間和部位直接影響了雙色茉莉葉片誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)，4月份和10月份為取材的最佳時期，誘導(dǎo)率最高，這與前人研究結(jié)果一致，王玲平等[10]在研究雙色茉莉莖段離體培養(yǎng)時也指出，4月份和10月份取材最好，誘導(dǎo)率達84%～93%；袁媛等[9]也指出，3、4月份取材葉片效果較好。這可能是因為，3—4月份和10月份分別為雙色茉莉春梢和秋稍生長期，生長代謝比較活躍，有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，且新生嫩葉與外界接觸時間較短，因此污染率較低。

升汞消毒時間為5～6 min時效果最佳，污染率低，且保持了葉片最佳的生理狀態(tài)。升汞消毒時間短，不能有效殺死微生物，而消毒時間過長又會對材料造成傷害，而最佳消毒時間為5～6 min。而呂孟雨等[6]用0.2%升汞對莖尖消毒的最佳時間為5 min；本研究中選用的升汞質(zhì)量分數(shù)為0.1%，外植體選擇葉片，最佳消毒時間為5、6 min時，污染率控制在5%；而劉敏杰等[5]指出，莖段消毒的最佳時間為3 min，時間長容易發(fā)生褐化。這說明與莖段相比，葉片和莖尖更耐升汞消毒。

生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的質(zhì)量濃度及配比影響產(chǎn)生愈傷組織的質(zhì)量，6-BA質(zhì)量濃度/NAA質(zhì)量濃度分別為1/4、1/2、1的培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織生長狀況較優(yōu)，且愈傷化程度較高，6-BA質(zhì)量濃度/NAA質(zhì)量濃度過高則不利于葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，因此，適宜于愈傷組織誘導(dǎo)的6-BA質(zhì)量濃度/NAA質(zhì)量濃度為4/1～1。本研究指出，KT的添加不利于雙色茉莉葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，KT在雙色茉莉組織培養(yǎng)中的應(yīng)用，前人也鮮有報道。前人通過對其他植物組織培養(yǎng)的研究指出，隨著KT質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率呈下降趨勢[11-12]，與本研究結(jié)果一致。關(guān)于雙色茉莉葉片組織培養(yǎng)的報道較少，本研究探索出雙色茉莉葉片愈傷組織誘導(dǎo)適宜的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA、MS+1.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA、MS+1.0 mg·L-16-BA+4.0 mg·L-1NAA和MS+2.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA，這為雙色茉莉葉片進一步分化成完整植株奠定了基礎(chǔ)。