裴蘊(yùn)鋒

（江蘇省徐州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 徐州 221009）

雌三醇（estriol, E3）是重要的內(nèi)源性雌激素之一，為雌酮和雌二醇的代謝產(chǎn)物，主要由肝臟合成，男性和未孕婦女體內(nèi)含量很低；孕婦體內(nèi)E3的主要來(lái)源是嬰兒和胎盤，且含量較高。經(jīng)胎盤合成的E3可與葡萄糖醛酸等形成結(jié)合型E3，從尿液中排出。隨著孕期增長(zhǎng)，血液中E3濃度逐漸升高，尿中排出量也漸增加，至分娩后迅速下降[1]。妊娠期檢查時(shí)，通過(guò)檢測(cè)孕婦血清或尿液中E3含量，可指示胎盤功能、判斷胎兒發(fā)育狀況[2]。

常用的E3檢測(cè)方法有：高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）、免疫標(biāo)記分析法（ELISA、RIA、TRFIA）和化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）等，由于儀器購(gòu)置、檢測(cè)技術(shù)等存在局限性，上述這些方法在臨床實(shí)驗(yàn)室難以推廣應(yīng)用[3]。

本文對(duì)蘇州博源生產(chǎn)的E3均相酶法檢測(cè)試劑進(jìn)行評(píng)價(jià)，以驗(yàn)證其在正確度、精密度、線性試驗(yàn)、可報(bào)告范圍及中晚孕期孕婦參考區(qū)間等的性能?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本來(lái)源于本院產(chǎn)科孕檢中心，共觀察32～33 孕周、36～37 孕周及39～40 孕周的健康孕婦各20 例，采集24 h尿液標(biāo)本，2 ℃～8 ℃冷藏保存待檢。

1.2 儀器與試劑 儀器為Beckman DX 1800。試劑由蘇州博源醫(yī)療科技有限公司提供，E3試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品批號(hào)分別為200630、200526、200526。

1.3 方法

1.3.1 儀器校準(zhǔn)與質(zhì)控：根據(jù)試劑使用說(shuō)明書推薦的E3方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)；每日檢測(cè)高、低兩個(gè)不同濃度的質(zhì)控品，確保在控后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。性能驗(yàn)證過(guò)程中，如出現(xiàn)隨批室內(nèi)質(zhì)控失控或其它操作問(wèn)題，則整批數(shù)據(jù)棄去，須增加一批次測(cè)量。

1.3.2 正確度評(píng)價(jià)：以與E3項(xiàng)目定標(biāo)所用校準(zhǔn)品批號(hào)不同的校準(zhǔn)品為已知參考物，重復(fù)檢測(cè)2 次，取均值與定值比較，求偏倚，評(píng)價(jià)E3的正確度。

1.3.3 精密度評(píng)價(jià)：參照CLSI EP15-A文件[4]，驗(yàn)證批內(nèi)及批間精密度。批內(nèi)精密度：同一天內(nèi)分別同時(shí)分析低、高兩水平E3樣本，每個(gè)水平重復(fù)檢測(cè)20 次。收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以變異系數(shù)（CV）不超過(guò)1/4 TEa，即6.25%為合格標(biāo)準(zhǔn)。批間精密度：高、低兩個(gè)不同濃度的尿液樣本，每天一個(gè)批次分別重復(fù)檢測(cè)4 次，連續(xù)檢測(cè)5 d。收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行批間精密度分析。

1.3.4 線性試驗(yàn)評(píng)價(jià)：參照CLSI EP6-A文件[5]并稍作調(diào)整，選擇一份E3低濃度混合尿液（L）和一份E3高濃度混合尿液（H），按照體積比：L、4L＋1H、3L＋2H、2L＋3H、1L＋4H、H，配制成6個(gè)系列濃度的混合尿液。預(yù)期濃度計(jì)算公式為：C＝(CH×VH＋CL×VL)/(VL＋VH)，其中C為濃度，V為體積。每個(gè)濃度檢測(cè)2 次，所有實(shí)驗(yàn)在1 d內(nèi)完成，收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.5 可報(bào)告范圍驗(yàn)證：選擇患者高值新鮮尿液，根據(jù)檢測(cè)系統(tǒng)說(shuō)明書使用適用的稀釋液按比例稀釋，稀釋比例按照檢測(cè)系統(tǒng)性能確定。將高值樣品用生理鹽水作1:2、1:5稀釋，每個(gè)稀釋樣品至少重復(fù)檢測(cè)2 次，以均值表示各個(gè)稀釋的樣品檢測(cè)值。比較各個(gè)稀釋度樣品的檢測(cè)值和預(yù)期值，并分別計(jì)算回收率。

1.3.6 參考范圍驗(yàn)證：選取不同中晚期孕周的表觀健康孕婦24 h尿液作為評(píng)價(jià)樣本，每組20 例。每個(gè)分組數(shù)據(jù)中，數(shù)據(jù)中至少有18/20個(gè)分布于引用的參考區(qū)間之內(nèi)，可認(rèn)為引用參考區(qū)間適合本實(shí)驗(yàn)室。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本文所用統(tǒng)計(jì)量及統(tǒng)計(jì)圖表均由MedCalc分析軟件計(jì)算繪制。

2 結(jié)果

2.1 正確度試驗(yàn) 所測(cè)各不同濃度的校準(zhǔn)品，其偏倚百分比均小于允許偏倚12.5%（1/2 TEa），正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)通過(guò)。結(jié)果詳見表1。

表1 E3正確度試驗(yàn)

2.2 精密度試驗(yàn) E3低（水平1）、高（水平2）濃度混合尿液的精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2 。各濃度水平E3的批內(nèi)精密度均＜6.25%（1/4 TEa），實(shí)驗(yàn)通過(guò)；批間精密度均符合廠商聲明標(biāo)準(zhǔn)。

表2 E3精密度試驗(yàn)

2.3 線性試驗(yàn) E3各濃度的測(cè)得值與預(yù)期值無(wú)顯著差異，繪制散點(diǎn)圖無(wú)離群值點(diǎn)。6 例梯度濃度標(biāo)本的平均偏倚百分比－0.055%（－5.67%, 2.58%），小于允許偏倚（±12.5%）。線性回歸方程：Y＝1.0034X－1.7311，R2＝0.9955。E3在18.0～300.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈線性。見圖1。

圖1 測(cè)定值與理論值線性回歸

2.4 可報(bào)告范圍驗(yàn)證 在稀釋100～1 000倍后，其結(jié)果回收率在80%～120%，故可接受的最大稀釋度1:1 000，分析測(cè)量范圍上限300 ng/mL，臨床可報(bào)告范圍為300 000 ng/mL，可滿足所有標(biāo)本的檢測(cè)需求。

2.5 參考范圍驗(yàn)證 在32～33 孕周，引用尿液E3參考區(qū)間9.32～20.53 mg/24 h，該組20 例健康孕婦的尿液E3結(jié)果全部在引用范圍內(nèi)；在引用的36～37 孕周E3參考區(qū)間16.28～27.53 mg/24 h，19例符合（19/20）；在39～40 孕周，引用參考區(qū)間22.13～32.32 mg/24 h，19 例符合（19/20）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該分組參考區(qū)間可應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)室。

3 討論

孕婦尿液E3檢測(cè)是反映胎兒、胎盤和母體機(jī)能的重要指標(biāo)?？闪私馓ケP功能及胎兒的發(fā)育情況，及早發(fā)現(xiàn)異常妊娠，監(jiān)測(cè)妊娠糖尿病、妊娠高血壓綜合征患者的妊娠狀況[2]。

均相酶法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、性價(jià)比高，可自動(dòng)化定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。本研究評(píng)估的均相酶法檢測(cè)E3方法學(xué)原理，是基于液相均相體系的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。液體樣本中的游離E3與葡萄糖六磷酸脫氫酶-雌三醇偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗雌三醇抗體位點(diǎn)。樣本中的游離E3越多，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體位點(diǎn)越多，抗體釋放出的酶標(biāo)偶聯(lián)物就越多。游離出的雌三醇酶標(biāo)偶聯(lián)物催化β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型（NAD+）轉(zhuǎn)化為β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型（NADH），樣本中E3濃度與NADH生成量成正比，通過(guò)340 nm吸光值變化即可計(jì)算出E3含量。本研究對(duì)均相酶法檢測(cè)E3進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在正確度、精密度、線性范圍等主要性能指標(biāo)上，均符合廠商聲明或“臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量指標(biāo)”（WS/T 403－2012）[8]，可滿足臨床實(shí)驗(yàn)室要求。

在中晚期不同孕周孕婦尿液的參考區(qū)間驗(yàn)證中，結(jié)果顯示，該參考區(qū)間可在本實(shí)驗(yàn)室采用。但考慮到24 h尿液留取，孕婦依從性差，我們已進(jìn)行孕婦隨機(jī)尿液E3參考值區(qū)間的建立，其臨床實(shí)用性還需大樣本進(jìn)一步證實(shí)。