張小平

(云南農(nóng)業(yè)大學 園林園藝學院，云南 昆明 650201)

1 引言

百合是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)植物的總稱，是世界第五大鮮切花卉，也是我國重要的大宗中藥材和特色蔬菜，具有極高的觀賞、藥用和食用價值。同時，中國作為世界百合(Lilium spp.)種質(zhì)資源的分布中心，擁有世界上50%以上百合屬植物[1]。但目前百合屬中一些分布區(qū)域狹窄或生態(tài)適應性較弱的種的生存受到了嚴重威脅，例如綠花百合(Lilium fargesii)，亟需對其進行搶救和保護[2]。植物組織培養(yǎng)技術作為珍惜植物資源保護最有效的手段在許多植物上得到了成功應用，但由于百合組培主要以生長在土壤中并且沒有外膜包被的鱗莖為外植體，組培過程中污染率極高，極不利于一些珍稀百合資源的搶救和保護。而在許多主要農(nóng)作物中得到成功應用的植物轉基因技術在百合上的應用將極大加速百合花色、抗性及品質(zhì)育種的進程，并且國內(nèi)外研究工作者已經(jīng)進行了一些有益的嘗試。但作為遺傳轉化重要基礎工作的抗生素對百合再生的影響卻缺乏系統(tǒng)研究，限制了轉基因技術在百合品種改良中的應用。

本研究通過研究蘭州百合、OT型百合“木門”及東方百合“索邦”試管鱗莖的鱗片在附加不同濃度的頭孢噻肟鈉、卡那霉素及潮霉素的再生培養(yǎng)基上的存活及再生情況，明確不同抗生素及其濃度對百合的影響，確定適合百合組培的脫菌劑及遺傳轉化過程中進行轉化子篩選的抗生素種類和適宜的濃度，從而為百合遺傳轉化及組培過程中細菌污染中抗生素的使用提供依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 試驗材料

2.1.1 植物材料

本研究以蘭州百合、OT型百合“木門”及東方百合“索邦”脫毒試管鱗莖為材料。

2.1.2 所用藥品

主要藥品為MS培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂、6-BA、NAA、卡那霉素(Kan)、頭孢噻肟鈉(Cef)及潮霉素(Hyg)。

2.2 試驗方法

以附加1.5 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的頭孢噻肟鈉(Cef)(200 mg/L，250 mg/L，300 mg/L)、卡那霉素(Kan)(20 mg/L，40 mg/L，60 mg/L，80 mg/L，100 mg/L，120 mg/L，150 mg/L)及潮霉素(Hyg)(10 mg/L，15 mg/L，20 mg/L，25 mg/L，30 mg/L，35 mg/L)，以不添加抗生素為對照，每個處理接種40鱗片切塊，重復3次，60d后調(diào)查統(tǒng)計Cef、Kan和 Hyg對百合鱗片再生的影響。培養(yǎng)溫度23±2 ℃，光照強度1500～2000 Lx，光照時間14 h/d，

3 結果與分析

3.1 不同濃度的頭孢噻肟鈉對百合鱗片再生的影響

由表1，圖1、2可知，在添加了3種濃度的頭孢噻肟鈉(Cef)的培養(yǎng)基上，蘭州百合、“木門”和“索邦”鱗片切塊均能存活，并且產(chǎn)生不定芽的數(shù)量在同種百合之間差異較小，尤其是“木門”和“索邦”之間差異更小。當Cef濃度為300 mg/L時，蘭州百合鱗片再生率最高，250 mg/L時鱗片再生率則最低；“木門”在200 mg/L和300 mg/L的Cef濃度下鱗片再生率均最高，250 mg/L時鱗片再生率也最低；相反，“索邦”百合在250 mg/L的Cef濃度下，鱗片再生率最高，而在200 mg/L和300 mg/L的濃度下鱗片再生率最低。在200 mg/LCef濃度下，蘭州百合、“木門”和“索邦”鱗片的分化率分別為87.5%、100%和97.0%；當Cef濃度為250 mg/L時，蘭州百合、“木門”和“索邦”百合分化率達到85%、97.5%和100%；當Cef濃度升高至300 mg/L時，蘭州百合、“木門”和“索邦”百合分化率達到97.5%、100%和97.5%，不會導致鱗片褐變或白化死亡，百合鱗片再生也并未受到影響。換言之，隨著Cef濃度的升高，百合鱗片的分化率呈先下降后上升的趨勢，而且3種百合對Cef的耐受能力依次為：“木門”>“索邦”>蘭州百合。由此可見，在遺傳轉化中，為了減少Cef對百合鱗片再生的傷害，同時又能夠有效地抑菌，Cef濃度選擇300 mg/L是可行的。

表1 不同濃度的頭孢噻肟鈉對百合鱗片再生的影響

注：a蘭州百合,Cef 0 mg/L;b.蘭州百合,Cef 200 mg/L;c.蘭州百合,Cef 250 mg/L;d.蘭州百合,Cef 300 mg/L;e.“木門”百合,Cef 0 mg/L;f.“木門”百合,Cef 200 mg/L;g.“木門”百合,Cef 250 mg/L;h.“木門”百合,Cef 300 mg/L;i.“索邦”百合,Cef 200 mg/L;j.“索邦”百合,Cef 250 mg/L;k.“索邦”百合,Cef 200 mg/L;l.“索邦”百合,Cef 250 mg/L

圖1 不同濃度的頭孢噻肟鈉對百合鱗片的影響

3.2 不同濃度的卡那霉素對百合鱗片再生的影響

由表2、圖3～5可知，不同濃度的Kan會對百合鱗片存活和再生產(chǎn)生不同程度的影響。隨著Kan濃度升高，百合鱗片切塊存活率和再生率逐漸降低，且再生芽出現(xiàn)白化。3種百合中，蘭州百合對Kan濃度增加響應最為明顯，當Kan濃度為20 mg/L時，蘭州百合鱗片再生頻率為97.5%；當濃度升高至40 mg/L時，蘭州百合鱗片可以形成大量不定芽，但大部分不定芽呈淺黃色，隨著培養(yǎng)時間點延長逐漸變成白化，只有少量最終發(fā)育成苗，再生率為12.5%；當Kan濃度為60 mg/L時，再生芽形成嚴重受到抑制，只有5%的鱗片能形成再生；而當Kan為100 mg/L或更高時，徹底抑制了蘭州百合鱗片的分化，沒有不定芽及突起產(chǎn)生。相比蘭州百合，“木門”及“索邦”對Kan具有較強的耐受能力，當Kan濃度為80 mg/L時，“木門”及“索邦”鱗片再生頻率分別為52.5%和57.5%，且只有少量鱗片出現(xiàn)白化現(xiàn)象；當Kan濃度為100 mg/L時，“木門”及“索邦”也能形成較多不定芽或突起，但是其中大部分逐漸白化，只有少量可以最終分化成苗，鱗片再生頻率顯著降低，分別為17.5%和20%；當濃度高于120 mg/L時，鱗片再生受到顯著抑制，大部分突起白化且停止繼續(xù)分化。

圖2 鱗片再生頻率隨頭孢噻肟鈉濃度的變化

表2 不同濃度的卡那霉素對百合鱗片再生的影響

注：a蘭州百合,Kan 0 mg/L;b. 蘭州百合,Kan 20 mg/L;c. 蘭州百合,Kan 40 mg/L;d. 蘭州百合,Kan 60 mg/L;e. 蘭州百合,Kan 80 mg/L;f. 蘭州百合,Kan 100 mg/L;g. 蘭州百合,Kan 120 mg/L;h. 蘭州百合,Kan 150 mg/L;i. “木門”百合;Kan 0 mg/L;j.“木門”百合,Kan 20 mg/L;k.“木門”百合,Kan 40 mg/L;l.“木門”百合,Kan 60 mg/L;m.“木門”百合,Kan 80 mg/L;n.“木門”百合,Kan 100 mg/L;o.“木門”百合,Kan 120 mg/L;p.“木門”百合,Kan 150 mg/L;q.“索邦”百合,Kan 0 mg/L;r.“索邦”百合,Kan 20 mg/L;s.“索邦”百合,Kan 40 mg/L;t.“索邦”百合,Kan 60 mg/L;u.“索邦”百合,Kan 80 mg/L;v.“索邦”百合,Kan 100 mg/L;w.“索邦”百合,Kan 120 mg/L;x.“索邦”百合,Kan 150 mg/L

圖3 不同濃度的卡那霉素對百合鱗片再生的影響

圖4 鱗片再生頻率隨卡那霉素濃度的變化

圖5 褐變死亡鱗片數(shù)隨卡那霉素濃度的變化

3.3 不同濃度的潮霉素對百合鱗片再生的影響

由表3、圖6-8可知，隨著Hyg濃度的升高，3種百合的鱗片再生頻率逐漸降低，褐變死亡鱗片數(shù)逐漸增加，對鱗片致死率逐漸增大。在這三種百合中，蘭州百合對Hyg的耐受能力最低，OT型“木門”百合和東方百合“索邦”對Hyg的耐受性相近。當Hyg濃度為25 mg/L時，蘭州百合鱗片再生頻率降至20%，較多鱗片開始褐變死亡，明顯抑制了鱗片再生；低于該濃度時，隨著Hyg濃度的增加，鱗片再生頻率呈升高的趨勢，但是再生苗數(shù)量過多，無法達到篩選轉化植株的作用；而高于該濃度時，蘭州百合鱗片基本被完全抑制，再生頻率為0，且鱗片幾乎全部相繼白化腐軟。當Hyg濃度為25 mg/L時，“木門”和“索邦”鱗片再生率均顯著降低，分別為27.5%和30%，少量鱗片開始白化腐軟，隨之褐化死亡；當Hyg濃度升高至30時，大量鱗片開始褐變死亡，鱗片再生受到顯著抑制，再生頻率分別為10%和12.5%；當Hyg濃度達到35 mg/L時，鱗片再生頻率驟降且植株生長狀況不佳，Hyg對鱗片的毒害作用增強，再生芽苗很快也會褐化死亡；而低于30 mg/L時，再生苗數(shù)量過多，不利于篩選。

同時，可觀察到，隨著時間培養(yǎng)時間的增加，鱗片褐化率不斷增加，再生芽也會逐漸褐化死亡，而且Hyg濃度越高后期鱗片或再生苗死亡速度越快。前人研究表明，在篩選質(zhì)量濃度時一般應略低于全致死濃度[3]；因此，在遺傳轉化中，蘭州百合選擇25 mg/LHyg是可行的，而“木門”和“索邦”以30 mg/LHyg為宜。

表3 不同濃度的潮霉素對百合鱗片再生的影響

4 討論與結論

有關植物抗生素敏感性研究已有很多報道，但是不同植物對不同抗生素的敏感性存在很大差異。本研究發(fā)現(xiàn)，百合對三種抗生素敏感性存在較大差異，對Hyg的敏感性最高，其次是Kan，對Cef的敏感性最差，Cef濃度為300 mgL時仍然對鱗片再生沒有明顯影響。同時，Kan和Hyg對百合再生的影響也不一樣，Kan主要是引起組織及再生芽白化，而Hyg則引起鱗片褐化死亡，這與兩種抗生素對植物細胞的作用機制有關。這三種百合對同種抗生素的耐受力也存在差異，與OT型百合“木門”和東方百合“索邦”相比，蘭州百合鱗片再生對Kan和Hyg耐受性要弱得多，而“木門”和 “索邦”對兩種抗生素的敏感程度相當。

抗生素作為農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化及植物組織培養(yǎng)中細菌污染的脫菌劑，要求其既能有效抑制或殺死細菌，但又對植物生長、分化不產(chǎn)生明顯影響。本研究所用的三種抗生素中Cef對百合鱗片再生的影響最小，當Cef濃度為 300 mg/L時，蘭州百合、“木門”和“索邦”的鱗片再生頻率分別為97.5%、100%和97.5%，而300 mg/L的Cef也足以抑制或殺死農(nóng)桿菌及所有的敏感細菌，是適合百合的脫菌抗生素，適宜的濃度為300 mg/L。

作為遺傳轉化中高效的篩選抗生素，不僅要有效地抑制非轉化細胞生長，使之緩慢死亡，還要不影響轉化細胞的正常生長。當選擇壓低時，部分未轉化的植物細胞由于耐受性而分化再生成植株；當選擇壓高時，真轉化子由于不能承受高選擇壓而同樣被抑制，使轉化率降低[4]?？敲顾?Kan)是一種植物遺傳轉化中常用的篩選標記，本研究結果表明，當Kan濃度為40 mg/L 時，蘭州百合鱗片能形成大量不定芽，但只有少量最終發(fā)育成苗，再生率為12.5%；當Kan濃度低于該濃度，再生苗數(shù)量太多，達不到篩選的目的，而高于該濃度，篩選壓過大，可能導致轉化細胞被殺死，轉化效率低下。所以，適合蘭州百合轉化子篩選的Kan濃度是40 mg/L。當Kan濃度為100 mg/L 時，“木門”和“索邦”鱗片能形成大量不定芽或突起，但是其中大部分停止在白化狀態(tài)，只有少量繼續(xù)分化成苗，再生率分別為17.%和20%，故而，該濃度是“木門”和“索邦”的遺傳轉化最適宜的篩選濃度。這與陳莉等[5]和焦子源[6]的研究結果不一致，可能是由于受體材料的不同所導致的。

注：a.蘭州百合,Hyg 0 mg/L;b.蘭州百合,Hyg 10 mg/Lc.蘭州百合,Hyg 15 mg/L;d.蘭州百合,Hyg 20 mg/L;e.蘭州百合,Hyg 25 mg/L;f.蘭州百合,30 mg/L;g.蘭州百合,Hyg 35 mg/L;h“木門”百合,Hyg 0 mg/L;i.“木門”百合,Hyg 10 mg/L;j.“木門”百合,Hyg 15 mg/L;k.“木門”百合,Hyg 20 mg/L;l.“木門”百合,Hyg 25 mg/L;m.“木門”百合,Hyg 30 mg/L;n.“木門”百合,Hyg 35 mg/L;o.“索邦”百合,Hyg 0 mg/L;p.“索邦”百合,Hyg 10mg/L;q.“索邦”百合,Hyg 15mg/L;r.“索邦”百合,Hyg 20 mg/L;s.“索邦”百合,Hyg 25 mg/L;t.“索邦”百合,Hyg 30 mg/L;u.“索邦”百合,Hyg 35 mg/L

圖6 不同濃度的潮霉素對百合鱗片再生的影響

潮霉素(Hyg)是常用于單子葉植物的選擇標記[7]，本研究結果表明，當Hyg濃度為25 mg/L 時，蘭州百合可產(chǎn)生少量不定芽并分化成苗，鱗片再生率為20%，低于這一濃度，形成的再生苗數(shù)量過多，達不到篩選目的；而高于這一濃度，鱗片再生率驟降為0。當Hyg濃度為30 mg/L 時，“木門”和“索邦”可形成較多突起，但只有少量分化成苗，再生率分別為10.5%和12.5%；低于該濃度再生苗數(shù)量過高，部分未轉化細胞易分化形成植株，無法達到篩選的目的；而高于該濃度，褐變死亡鱗片數(shù)顯著增加且轉化植株易受Hyg毒害致死，抑制了轉化細胞的正常生長。所以，25 mg/L Hyg對蘭州百合抗性植株的的篩選最為適宜，“木門”和“索邦”則以35 mg/L Hyg為最適宜篩選濃度。此結果與儲俊等[4]、王愛菊等[8]及梁慧敏等[9]的研究結果不同。王愛菊等[8]認為篩選最適宜的Hyg濃度為40 mg/L ，儲俊等[4]則認為篩選最適宜的Hyg濃度為50 mg/L ，梁慧敏等[9]則認為10 mg/L為最適宜篩選濃度。這種試驗結果的差異可能是由于不同百合屬植物對Hyg的耐受能力的強弱不同所致。

圖7 鱗片再生頻率隨潮霉素濃度的變化

圖8 褐變死亡鱗片數(shù)隨潮霉素濃度的變化