尹曉蛟，何銀生，王智，吳德智，周武先，楊旭*

(1.湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430200； 2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中藥材研究所，湖北 恩施 445000;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

重樓屬是百合科植物中藥用價值和經(jīng)濟價值最為重要的一個屬，在我國具有悠久的藥用歷史，其主要藥用部位是根狀莖，有清熱解毒、消腫止痛等功效，為云南白藥、宮血寧、奪命丹等經(jīng)典中成藥的主要原料。重樓作為珍貴藥材表現(xiàn)出的可觀的經(jīng)濟價值驅(qū)使人們掠奪式采挖，導(dǎo)致野生重樓種群數(shù)量越來越少，唯有通過人工栽植才能保證資源可持續(xù)利用。重樓種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展的同時也對良種選育提出了更高的要求。一直以來，國內(nèi)外研究者更偏重重樓的藥理活性、化學(xué)成分分析、快繁和人工栽培技術(shù)分析，重樓種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究成果則相對較少。近年來，重樓遺傳多樣性分析主要采用分子標記手段進行基因水平研究[1-5]，作為遺傳多樣性表現(xiàn)形式之一的表型性狀多樣性分析在重樓中卻鮮見報道。

鑒于此，本研究以13種重樓屬植物為材料，通過對其18個表型性狀指標的數(shù)量分析，了解供試重樓種質(zhì)的表型變異程度，基于表型性狀數(shù)據(jù)對各種質(zhì)進行聚類分析以揭示它們的親緣關(guān)系，并采用主成分分析方法和相關(guān)性分析方法分析與重樓產(chǎn)量關(guān)系密切的主要表型特征，以期為重樓種質(zhì)的遺傳改良和新品種選育提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的重樓種質(zhì)材料共13份，編號如下：1，毛重樓；2，多葉重樓；3，球藥隔重樓；4，短瓣球藥隔重樓；5，黑籽重樓；6，矮重樓；7，金線重樓；8，亮葉重樓；9，啟良重樓；10，狹葉重樓；11，華重樓；12，長藥隔重樓；13，凌云重樓。2019年5月采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所的重樓種質(zhì)資源圃。

1.2 性狀測定

選擇具有代表性、遺傳相對穩(wěn)定、易于獲得和測定的18個表型性狀，包括株高、根莖長、根莖粗、根莖干質(zhì)量、基莖粗、葉片數(shù)、花梗長、花瓣長、雄蕊長、雄蕊數(shù)、花柱裂、葉片長、葉片寬、葉柄長、萼片數(shù)、萼片長、萼片寬、總?cè)~面積。用卷尺測量株高、根莖長、花梗長、花瓣長、雄蕊長、葉片長、葉片寬、葉柄長、萼片長、萼片寬，精確到0.1 cm。用游標卡尺測量根莖直徑、基莖直徑，精確到0.01 cm。其中，根莖直徑為根狀莖最粗處的直徑，基莖直徑為直立莖基部的直徑。根莖干質(zhì)量用電子天平稱量，精確到0.01 g?？?cè)~面積用葉片形態(tài)測量儀測量。

利用Shannon-weaver多樣性指數(shù)(H′)評價表型遺傳多樣性，計算公式：

H′=-∑PilnPi。

式中，Pi為某性狀第i級別材料份數(shù)占材料總數(shù)的百分比，其中數(shù)值性狀的分級按照第1級[Xi<(X-2δ)]到第10級[Xi>(X+2δ)]，每0.5δ為1級。

供試重樓表型性狀遺傳多樣性的聚類分析借助NTsys-pc 2.1軟件完成，在聚類分析前對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，通過軟件計算各材料間的卡方距離，并按非加權(quán)配對算數(shù)平均法(unweighted pair group method using arithmetic average, UPGMA)對不同重樓種質(zhì)資源材料進行聚類，生成樹狀聚類譜系圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003軟件統(tǒng)計數(shù)值性狀的平均值、最大值、最小值、標準差、變異系數(shù)。用SPSS 22.0軟件對表型性狀做相關(guān)性分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多樣性

重樓各數(shù)量性狀的變異情況見表1，各表型性狀的變異系數(shù)差異較大。葉柄長度的變異系數(shù)最高，達到87.10%，說明種質(zhì)間葉柄長度差異大，離散程度高。變異系數(shù)最低的是根莖直徑，為12.01%，表明各種質(zhì)的根莖直徑穩(wěn)定性較好。

表1 重樓屬種質(zhì)表型性狀遺傳變異分析

注：**表示差異達到1%顯著水平，*表示差異達到5%顯著水平。

供試種質(zhì)性狀的Shannon-Weaver多樣性指數(shù)為1.88～2.66，變幅較大，平均2.30；除花瓣長、根莖直徑和根莖干質(zhì)量3個性狀外，其余15個測量性狀多樣性指數(shù)都在2.0以上。表明13份重樓屬種質(zhì)資源材料表型性狀的遺傳多樣性指數(shù)較高，供試各種質(zhì)在葉、花、根莖與株高的多個性狀均表現(xiàn)出豐富的多樣性，這種豐富的變異不僅為優(yōu)異種質(zhì)選擇提供源泉，而且為保護生物多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

F值檢驗可以看出，株高、根莖長、基莖直徑、葉片數(shù)、葉片長、葉片寬等15個性狀在群體間的差異達到極顯著(P<0.01)水平，萼片寬在群體間存在顯著(P<0.05)差異，根莖直徑和根莖干質(zhì)量在各種質(zhì)之間差異不顯著。表明野生種源在試驗地經(jīng)過多代馴化栽培后，仍保留各自典型的性狀特征，各種質(zhì)材料間的大部分性狀差異明顯，僅根莖的質(zhì)量和粗壯程度與種質(zhì)來源無顯著關(guān)系。

2.2 主成分

本研究對供試樣本的18個表型性狀進行了主成分分析，從而計算出這些表型性狀的特征值、方差貢獻率、累計貢獻率和因子載荷值等參數(shù)。在累計貢獻百分比高于85%時，共發(fā)現(xiàn)5個主成分(表2)。主成分1～5的特征值分別是5.947、5.217、2.383、1.414、1.044；主成分貢獻率分別是33.037%、28.984%、13.242%、7.855%、5.800%，前5個主成分的累計貢獻率達到88.918%(表3)。第一主成分的總?cè)~面積、花梗長、萼片長、葉片長、根莖直徑、基莖直徑、株高的特征向量值最大，且均為正值，可以理解為第一主成分是跟體型大小相關(guān)的綜合指標；第二主成分的雄蕊數(shù)、萼片數(shù)、花柱裂的特征向量值最大，均為正值，是與花的特性相關(guān)的綜合指標；第三主成分的根莖長、根莖重的特征向量值最大，且均為負值，是與根莖有關(guān)的因子；第四主成分的花瓣長的特征向量值最大；第五主成分的葉片數(shù)特征向量值最大。貢獻率較大的性狀是造成重樓表型差異的主要因素。以上主成分分析結(jié)果表明，株型大小的多樣性最高，其次是花部元件的數(shù)量。這些性狀因子可視為今后重樓種質(zhì)評價與雜交育種中親本選擇的主要表型指標。

2.3 聚類

13種重樓屬植物的聚類分析結(jié)果如圖1所示，在卡方距離0.10處，將重樓樣本分為5個類群。

第Ⅰ類群包括毛重樓、球藥隔重樓、短瓣球藥隔重樓、啟良重樓、華重樓和長藥隔重樓，該類群個體高大，花梗長于其他個體；其中華重樓和長藥隔重樓性狀指標最接近。

表2 重樓屬種質(zhì)材料18個表型性狀的主成分分析

表3 前5個主成分分析結(jié)果

第Ⅱ類群包括亮葉重樓、黑籽重樓和金線重樓；此類群株型中等、根莖干質(zhì)量高于其他種質(zhì)。黑籽重樓與金線重樓在株高、葉片數(shù)量、長度寬度等性狀上表現(xiàn)極相似。

第Ⅲ類群僅包含凌云重樓。凌云重樓直立莖、葉片、根莖、萼片等營養(yǎng)器官的大小顯然不占優(yōu)勢，但其花柱裂、雄蕊數(shù)、萼片數(shù)在所有種質(zhì)材料中表現(xiàn)出較高值。

第Ⅳ類群包括矮重樓和狹葉重樓，二者葉片數(shù)較多，葉面積小，幾乎無葉柄。

第Ⅴ類群以多葉重樓獨立為一類。表現(xiàn)為株型矮小，葉面積大，葉片數(shù)多。

2.4 主要數(shù)量性狀相關(guān)性

供試重樓種質(zhì)18個數(shù)量性狀的相關(guān)性分析結(jié)果見表4。結(jié)果表明，各性狀間普遍存在或顯著或極顯著相關(guān)性，表現(xiàn)為正相關(guān)或負相關(guān)。與基莖直徑顯著相關(guān)的性狀最多，達到12個，株高、根莖干質(zhì)量、葉片數(shù)、葉片長、萼片數(shù)、萼片長、花梗長、花瓣長、雄蕊數(shù)、雄蕊長、花柱裂、總?cè)~面積與基莖直徑都呈極顯著正相關(guān)；與葉片數(shù)、花梗長、總?cè)~面積相關(guān)的性狀均為9個；與根莖長度相關(guān)的性狀最少，只有株高與根莖長度呈極顯著的正相關(guān)。本實驗中，反映重樓產(chǎn)量的指標根莖干質(zhì)量僅與雄蕊數(shù)呈極顯著負相關(guān)，與萼片數(shù)呈顯著負相關(guān)，與地上部分的其他性狀沒有顯著相關(guān)關(guān)系。

圖1 基于18個性狀的重樓屬種質(zhì)資源聚類

表4 重樓屬種質(zhì)資源表型性狀相關(guān)分析

注：*表示在P<0.05水平上顯著相關(guān)，**表示在P<0.01 水平上顯著相關(guān)。1，株高；2，根莖長；3，根莖直徑；4，根莖干質(zhì)量；5，基莖直徑；6，葉片數(shù)；7，葉片長；8，葉片寬；9，葉柄長；10，萼片數(shù)；11，萼片長；12，萼片寬；13，花梗長；14，花瓣長；15，雄蕊數(shù)；16，雄蕊長；17，花柱裂；18，總?cè)~面積。

3 討論

本研究對恩施當?shù)?3種重樓屬種質(zhì)進行表型性狀多樣性分析、主成分分析、聚類分析和性狀間的相關(guān)性分析。性狀多樣性分析結(jié)果顯示，參試種質(zhì)的葉、花、根莖與株高等多個性狀均表現(xiàn)豐富的多樣性，其中對重樓產(chǎn)量起決定性作用的根莖長度、根莖最大直徑和根莖干質(zhì)量多樣性指數(shù)較高，說明在育種工作中可利用現(xiàn)有種質(zhì)資源提高重樓的產(chǎn)量潛力。

從聚類分析結(jié)果來看，毛重樓、球藥隔重樓、短瓣球藥隔重樓、啟良重樓、華重樓和長藥隔重樓聚為一類，與它們在重樓植物分類地位中均屬于南重樓組這一結(jié)論一致[6]。前人的研究還表明，啟良重樓、華重樓和長藥隔重樓均為多葉重樓的變種，短瓣球藥隔重樓是球藥隔重樓的變種[6]，因為親緣關(guān)系近而具有相似的表型。多葉重樓在長期的栽培過程中受到環(huán)境的影響，表型漸漸發(fā)生變化，與其變種的共性減少，可能是造成其單成一類的原因。聚類結(jié)果還顯示，黑籽重樓和金線重樓更容易較早地聚在一起，然而以上被試材料的ISSR分析結(jié)果顯示兩者遺傳相似度低，不能聚為一類，這與李壯等[2]對重樓的遺傳多樣性研究中發(fā)現(xiàn)黑籽重樓和金線重樓親緣關(guān)系較遠的觀點有差異。

從主成分分析結(jié)果來看，葉片長、葉片寬、植株高、根莖干質(zhì)量、萼片寬等5個性狀是引起種間表型差異的最主要因素，但這類性狀參數(shù)僅僅在量上表現(xiàn)差異，且觀測值容易受環(huán)境影響，因此，本研究中將第2主成分貢獻較大的花萼數(shù)、雄蕊數(shù)和花柱裂3個表型性狀作為重樓種質(zhì)間差異的主要來源。這與翁周等[7]對多葉重樓的研究結(jié)果相一致。

表型性狀相關(guān)性分析顯示，植株的各繁殖器官性狀之間、各營養(yǎng)器官性狀之間普遍具有極顯著相關(guān)性。而植株地下部分性狀與地上部分的某些性狀間存在一定相關(guān)性，這一結(jié)果與地黃種質(zhì)主要數(shù)量性狀的相關(guān)性分析結(jié)果相似[8-9]。也提示重樓地上部分的某些性狀可作為高產(chǎn)重樓種質(zhì)選育指標。這一推論在重樓的相關(guān)研究中尚未見報道，但在甘草[10]、白芷[11]、黃芩[12]等中草藥植物表型性狀相關(guān)性分析中已得到證實。