孫立方，柯甫志，聶振朋，王平，孫建華，徐建國(guó)

(浙江省柑橘研究所，國(guó)家柑橘品種改良中心浙江分中心，浙江 臺(tái)州 318026)

柑橘病害嚴(yán)重影響其外觀、品質(zhì)和產(chǎn)量，對(duì)柑橘生產(chǎn)極為不利。目前，針對(duì)柑橘病害采取的措施以利用化學(xué)農(nóng)藥為主。篩選抗病品種的柑橘育種有助于品種改良，但存在周期較長(zhǎng)、效率低等缺點(diǎn)，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)等基因工程育種方法能克服傳統(tǒng)育種的缺點(diǎn)[1]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)聚合多個(gè)抗病基因可顯著提高植物的抗病性。在多基因共表達(dá)植物載體構(gòu)建中，以鳳仙花種子的一段多肽LP4和有自我剪切功能的口蹄疫病毒片段2A作為連接肽進(jìn)行多基因融合是一種可以替代傳統(tǒng)多基因轉(zhuǎn)化方法的新手段，可以同時(shí)連接多個(gè)基因并且協(xié)同表達(dá)[2-5]。而將LP4和2A多肽連接形成新的多肽LP4/2A具兩者優(yōu)勢(shì)，是一種更為有效的多基因轉(zhuǎn)化連接肽[4, 6-8]。擬南芥中的廣譜抗病基因AtNPR1和抗菌肽CecropinB基因已分別在多種作物中被證實(shí)具有較好的抗病效果[9-10]。因此，本研究將利用基因聚合育種技術(shù)來(lái)探索提高柑橘對(duì)細(xì)菌性和病毒性等病害的抗性，利用LP4/2 A作為連接肽，構(gòu)建AtNPR1和CecropinB基因的共表達(dá)植物載體，為后期轉(zhuǎn)化柑橘獲得抗病材料做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

本實(shí)驗(yàn)所用載體pBI121購(gòu)買于北京華越洋生物科技有限公司。大腸埃希菌DH5a和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

本研究使用的試劑有高保真聚合酶KOD-FX (Toyobo)，PCR產(chǎn)物回收試劑盒D6492 (Omega)，In-Fusion HD Cloning Kit (TaKaRa)，連接酶EL0011 (Thermo Fermentas)和內(nèi)切酶FastDigest (Thermo Fermentas)。

1.3 載體構(gòu)建

啟動(dòng)子GRP1.8的編碼序列和連接肽(抗菌肽)LP4/2A-Cecropin B的全長(zhǎng)編碼序列由華大基因科技有限公司合成。以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的質(zhì)粒為模板重新擴(kuò)增AtNPR1。利用重疊PCR將AtNPR1和LP4/2A-Cecropin B連接重組為AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B基因，兩端引入XbaⅠ/BamHⅠ酶切位點(diǎn)，并直接連接到載體pBI121，即獲得35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B載體。利用重疊PCR將GRP1.8和AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B連接重組為GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B基因，兩端引入HindⅢ/BamHⅠ酶切位點(diǎn)，用無(wú)縫連接方式連接到載體pBI121，即獲得GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B載體。反應(yīng)體系共50 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。實(shí)驗(yàn)所用引物由生工生物工程有限公司合成，具體引物列表如下(表1)。

表1 構(gòu)建所需的引物名稱和引物序列

1.4 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

取-80 ℃保存的農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)于冰中融化。每100 μL感受態(tài)分別加入1 μg左右上述獲得的35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B載體質(zhì)粒DNA，用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5 min、液氮5 min、37 ℃水浴5 min、冰浴5 min。加入700 μL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于28 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 h。6 000 r·min-1離心1 min收菌，留取100 μL左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含Kan和Rif抗生素的LB平板上，倒置放于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d。最后隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的載體示意圖如下(圖1)。載體啟動(dòng)子分別為CaMV 35S和韌皮部特異性啟動(dòng)子GRP1.8。目的基因AtNPR1和CecropinB基因通過(guò)連接肽LP4/2 A連接，CecropinB前同時(shí)引入信號(hào)肽PR1a。實(shí)驗(yàn)預(yù)期最終分別獲得35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B植物共表達(dá)載體。

圖1 載體的構(gòu)建情況

2.1 目的基因擴(kuò)增和重組

以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增AtNPR1，以人工合成的質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增GRP1.8和LP4/2A-Cecropin B片段，分別引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)重疊PCR引物，將AtNPR1和LP4/2A-Cecropin B連接重組為AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B基因(圖2)。同樣，利用重疊PCR將GRP1.8和重組基因AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B連接，重組為GRP1.8-AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B基因(圖2)。然后采用酶切連接和無(wú)縫連接的方式將這2個(gè)重組后的基因分別連接到載體pBI121，下一步進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

M—Marker DL2000; 1—AtNPR1-LP4/2A-CecropinB (2 082 bp); 2—pGRP1.8: AtNPR1-LP4/2 A-Cecropin B (2 684 bp); 3—pGRP1.8 (626 bp)。圖2 擴(kuò)增和重組基因凝膠的回收電泳

2.2 載體轉(zhuǎn)化和PCR檢測(cè)

將AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8-AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B連接pBI121后的構(gòu)建載體分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。用菌液PCR驗(yàn)證(圖3)，并挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示2個(gè)構(gòu)建序列均正確。表明35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。

35S為AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α后PCR檢測(cè)結(jié)果(3、5、6為陽(yáng)性，5號(hào)測(cè)序正確)；GRP1.8為AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α后PCR檢測(cè)結(jié)果(2、5為陽(yáng)性，2號(hào)測(cè)序正確)。圖3 構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α后PCR檢測(cè)結(jié)果

挑選上述測(cè)序正確的單克隆質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，最后挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，所選菌落均為陽(yáng)性克隆，說(shuō)明轉(zhuǎn)化成功(圖4)。以上結(jié)果表明，所構(gòu)建的植物表達(dá)載體35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。

35S為AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后PCR檢測(cè)結(jié)果(1、2為陽(yáng)性)；GRP1.8為AtNPR1-LP4/2 A-Cecropin B質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后PCR檢測(cè)結(jié)果(1、2為陽(yáng)性)。圖4 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

以雜交育種為主的作物傳統(tǒng)育種來(lái)篩選抗病品種，周期長(zhǎng)并且具有很多局限性，柑橘育種也面臨同樣的問題。近些年基因工程技術(shù)在柑橘抗病育種廣泛應(yīng)用，并取得一系列進(jìn)展。廣譜抗病基因AtNPR1和抗菌肽CecropinB基因在作物抗病育種中取得較好的效果，而且分別在柑橘抗黃龍病和潰瘍病也有應(yīng)用[11-13]。LP4/2A在作物多基因轉(zhuǎn)化中被證明可以有效地協(xié)調(diào)多個(gè)基因的共同表達(dá)[4,8]。本研究以LP4/2A連接肽為連接肽，成功構(gòu)建了AtNPR1和CecropinB基因的共表達(dá)載體，為以后篩選轉(zhuǎn)基因抗病柑橘準(zhǔn)備材料。通過(guò)2個(gè)抗病基因共同轉(zhuǎn)化柑橘，以期進(jìn)一步提高柑橘的廣譜抗病性。