上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學院牙周病科，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室，上海市口腔醫(yī)學研究所，上海 200011

牙周炎是一種微生物相關的、宿主介導的、多因素參與并導致牙周附著喪失的炎癥性疾病[1-2]。牙周炎通過齦下菌斑中的微生物及其產(chǎn)物引起全身免疫炎癥反應，從而成為系統(tǒng)性疾病的危險因素。牙周炎與糖尿病、心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等全身疾病有關，近年研究[3]發(fā)現(xiàn)牙周炎與慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）也有密切聯(lián)系。

CKD在人群中的患病率為10%～12%，已成為主要的公共健康問題之一，超過50%的老年人有腎功能障礙[4]。橫斷面調(diào)查[5-7]顯示，與普通人群相比，CKD患者[包括CKDⅡ～Ⅴ期患者、正在接受腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）和血液透析（hemodialysis，HD）患者]的牙周炎患病率明顯增加，探診深度、探診出血量、附著喪失程度、牙槽骨吸收程度等均高于年齡與之匹配的無系統(tǒng)性疾病健康個體，并且牙周炎患病率與CKD進展程度密切相關。目前關于牙周炎與CKD的相關性，大多來自流行病學調(diào)查，二者相關性機制尚不明確。

CKD患者體內(nèi)存在一類能與蛋白質(zhì)相結合且不能通過透析清除的毒素，其中最具代表性的為硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate，IS）。CKD患者隨著腎功能的惡化，血清IS濃度持續(xù)升高，可達正常人群的30倍以上。IS與CKD的進展以及CKD患者心血管疾病的不良結局密切相關[8]，具有加劇纖維化、促進炎癥基因表達、增加細胞內(nèi)氧化損傷、誘導免疫紊亂及抑制細胞增殖等作用[9-11]。而氧化應激及炎癥反應是牙周炎與全身疾病聯(lián)系的重要橋梁，但目前尚未有IS對人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）生物學作用的報道。

因此，本研究試圖通過觀察IS對hPDLCs的增殖活性、炎癥因子表達和活性氧（reactive oxygen species，ROS）表達的影響，為CKD與牙周炎的相關性提供實驗依據(jù)，也為伴CKD牙周炎患者的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

硫酸吲哚酚鉀鹽、2′, 7′-二氯熒光素二乙酸鹽（2′,7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFDA）（Sigma，美 國），DMEM培養(yǎng)基 （Hyclone，美國），胎牛血清（Gibco，美國），四甲基偶氮唑鹽比色（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（碧云天，中國），總RNA提取試劑盒、RNA反轉錄試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（寶生物，中國），ELISA試劑盒（UBI，美國）。

1.2 hPDLCs的培養(yǎng)

采用組織塊培養(yǎng)法進行hPDLCs的培養(yǎng)。收集上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院18～25歲患者臨床因正畸需要拔除的、牙周健康的、無齲的前磨牙和第三磨牙，所有牙齒收集之前患者均知情同意。在超凈臺內(nèi)用無菌PBS反復沖洗，刮取牙根中部1/3的牙周膜組織置于6 cm培養(yǎng)皿中，加入1 mL培養(yǎng)液使其在皿底鋪平，吸棄多余培養(yǎng)液，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后加入4 mL培養(yǎng)基。待細胞密度達70%～80%后常規(guī)傳代，選取第3～5代細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組

對照組：含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

實驗組：在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入IS，使其終濃度分別為62.5、125、250、500、1 000 μmol/L。

1.4 IS對hPDLCs細胞活性的影響

取第3～5代生長狀態(tài)良好的hPDLCs，以1.6×104/mL密度接種于96孔板。于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按上述實驗分組加入不同干預，再次培養(yǎng)24、48、72 h。加入配置好的0.5 mg/mL MTT溶液，避光孵育4 h，使用酶標儀檢測OD （490 nm）。以未加細胞的培養(yǎng)基孔為基準進行調(diào)零。

1.5 IS對hPDLCs炎癥因子基因和蛋白表達水平的影響

1.5.1 基因檢測 將細胞以2×105/mL密度接種于6孔板，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按實驗分組加入不同干預，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。用RNAiso Plus裂解細胞，提取細胞總RNA，反轉錄獲得cDNA，加入引物以及SYBR，在實時熒光定量系統(tǒng)內(nèi)進行基因擴增。采用相對定量2-△△CT法計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 基因引物序列Tab 1 Primer sequences for target genes

1.5.2 蛋白檢測 將hPDLCs以2×105/mL密度接種于6孔板，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按實驗分組加入不同干預，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后收集上清。取上述不同濃度IS處理4 h后的細胞上清，按照ELISA試劑盒說明書要求檢測IL-1β、IL-8、IL-6的濃度，實驗重復3次。

1.6 IS對hPDLCs ROS表達的影響

hPDLCs以2×105/mL密度接種于24孔板，于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按實驗分組加入不同干預，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，吸棄上清。用無血清培養(yǎng)液稀釋熒光探針DCFDA，使其終濃度為10 μmol/L，每孔加入500 μL。置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min后用熒光酶標儀檢測細胞內(nèi)熒光強度（激發(fā)光495 nm，發(fā)射光525 nm），使用熒光顯微鏡觀察、拍攝各組細胞的熒光圖像。

1.7 統(tǒng)計分析

使用Graphad Prism 6.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。定量資料采用±s表示。采用單因素方差分析法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IS對hPDLCs增殖活性的影響

如圖1所示：24 h時，與對照組相比，62.5 μmol/L IS濃度組細胞增殖活性無明顯變化（P＞0.05）；125、250、500、1 000 μmol/L IS濃度組細胞增殖活性顯著下降（P＜0.05），且細胞活性與IS濃度呈負相關。48 h時，125、250、500、1 000 μmol/L IS濃度組可觀察到細胞增殖活性受到抑制（P＜0.05），且抑制作用與IS濃度呈正相 關。72 h時，125、250、500、1 000 μmol/L IS濃度組細胞增殖活性與對照組相比均受到抑制（P＜0.05），且抑制作用與IS濃度呈正相關。125 μmol/L的IS作用于hPDLCs 72 h時的細胞相對生存率（0.706±0.039）較48 h時（0.849±0.038）顯著下降（P＜0.05）。500 μmol/L的IS作用于hPDLCs 72 h時的細胞相對生存率（0.417±0.097）也較48 h時（0.662±0.119）明顯下降（P＜0.05）。500、1 000 μmol/L IS濃度組的細胞增殖活性隨著IS作用時間延長而下降。

結果表明，125 μmol/L的IS即可對hPDLCs的增殖活性產(chǎn)生抑制作用，IS對hPDLCs的抑制作用呈濃度和時間依賴性。

圖1 IS對hPDLCs的增殖活性影響Fig 1 Effect of indoxyl sulfate on the cell viability of hPDLCs

2.2 IS對hPDLCs炎癥因子mRNA表達水平的影響

如圖2所示：IS刺激hPDLCs 4 h時，與對照組相比，62.5 μmol/L IS濃度組的IL-1βmRNA表達量增加，而IL-6、IL-8mRNA的表達無明顯變化；125 μmol/L IS濃度組的IL-1β、IL-6和IL-8mRNA表達量均增加（P＜0.05）；IL-1β、IL-6和IL-8mRNA表達量與IS濃度呈正相關。結果顯示hPDLCs炎癥因子表達對IS呈濃度依賴性。

圖2 IS對hPDLCs炎癥因子mRNA表達的影響Fig 2 Effect of indoxyl sulfate on cytokines mRNA expression of hPDLCs

2.3 IS對hPDLCs炎癥因子蛋白表達水平的影響

如圖3所示：4 h時，與對照組相比，62.5 μmol/L IS濃度可上調(diào)細胞內(nèi)IL-1β、IL-8蛋白的表達（P＜0.05）；125 μmol/L IS濃度可促進細胞內(nèi)IL-6蛋白的表達（P＜0.05）。結果表明，IS可促進hPDLCs細胞中炎癥因子IL-1β、IL-8和IL-6蛋白的分泌，蛋白表達量與IS濃度呈正相關，且具有濃度依賴性。

圖3 IS對hPDLCs炎癥因子蛋白表達的影響Fig 3 Effect of indoxyl sulfate on cytokines protein expressions of hPDLCs

2.4 IS對hPDLCs胞內(nèi)ROS表達的影響

如圖4所示：與對照組相比，125 μmol/L IS作用于hPDLCs 4 h時即可見細胞內(nèi)ROS熒光強度增強，且隨著IS濃度的增加hPDLCs胞內(nèi)ROS熒光強度進一步增強。

圖4 IS對hPDLCs ROS表達的影響Fig 4 Effect of indoxyl sulfate on ROS production in hPDLCs

3 討論

牙周炎是一種由病原微生物感染所致的宿主炎性破壞性疾病。宿主免疫應答在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，機體免疫系統(tǒng)紊亂會導致牙周感染概率或程度的增加[12]。近年來，氧化應激在牙周炎發(fā)展中的作用逐漸受到重視，許多研究認為氧化應激的直接和間接參與是導致牙周組織破壞的關鍵因素。牙周炎可以是氧化應激相關的全身疾病的局部表現(xiàn)，也可以通過氧化應激來加速全身疾病的進展[13]。IS是CKD患者腎功能衰退后在體內(nèi)大量蓄積的毒素[14]，尿毒癥患者的血清內(nèi)IS濃度較健康人群高43～88倍[15]。血液中IS的增加與腎小球硬化、腎纖維化和CKD的進展以及心血管疾病的不良結局密切相關[16]。IS可促進ROS表達增加，破壞體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡，造成內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞、神經(jīng)細胞等損傷。IS以多種途徑誘發(fā)炎癥免疫反應：IS進入T細胞可使其向Th17細胞分化，引起免疫功能紊亂；IS與蛋白結合可影響單核細胞的趨化功能從而刺激促炎因子的釋放，使機體處于炎癥狀態(tài)；IS可促進脂肪細胞TNF-α的表達，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。而氧化損傷及免疫炎癥反應中產(chǎn)生的過量炎癥介質(zhì)與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關。

已有研究[17-18]表明，IS可抑制巨噬細胞、膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞及腎臟細胞的增殖及代謝，且呈時間及濃度依賴性。本研究參考尿毒癥患者體內(nèi)平均IS濃度以及最大濃度（尿毒癥患者體內(nèi)平均IS濃度為211 μmol/L，最大濃度為940 μmol/L）[19]設立濃度梯度進行實驗，發(fā)現(xiàn)125 μmol/L的IS可對hPDLCs的增殖活性產(chǎn)生抑制作用，且IS對hPDLCs的抑制作用呈濃度和時間依賴性。hPDLCs是一類具有多向分化能力的間充質(zhì)干細胞，若hPDLCs的生物學功能受到損害，將會導致牙周組織再生修復能力下降[20]。IS可通過增加腎小管上皮細胞中ROS的表達以及細胞凋亡蛋白酶-3的表達，促進腎小管上皮細胞凋亡[21]。IS也可通過ROS的表達抑制腸黏膜上皮細胞增殖[22]。本研究中，經(jīng)IS處理的細胞胞內(nèi)ROS表達明顯上升，IS濃度為125 μmol/L的細胞胞內(nèi)ROS上升顯著，與細胞增殖受抑制IS濃度一致。由此表明，ROS可能在IS抑制hPDLCs增殖中起作用。

菌斑微生物是牙周炎的始動因子，但牙周炎所造成的病理破壞不僅與菌斑微生物相關，還與免疫應答產(chǎn)生的炎性因子密切相關。牙周炎患者的齦溝液及血清中?？蓹z測到多種炎癥因子水平增高，而炎癥過程中免疫細胞及牙周組織細胞產(chǎn)生的炎癥因子又進一步促進牙周炎的發(fā)生發(fā)展[20]。體外實驗研究[23-24]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腹腔注射IS的小鼠腎臟組織中炎癥因子IL-1β、IL-6水平明顯上升，且與腎臟纖維化密切相關；IS還可激活單核巨噬細胞IL-1β的表達。IL-1β是牙周炎發(fā)展過程中重要的炎癥因子，可激活淋巴細胞及單核細胞，其水平與牙周炎的一系列病理變化有關，包括上調(diào)炎癥性細胞因子、趨化因子、轉錄因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、黏附分子等；IL-1β還可抑制堿性磷酸酶表達，抑制組織形成，激活破骨細胞，刺激破骨細胞產(chǎn)生前列腺素E2并導致牙槽骨喪失[25]。IL-8是一種具有廣泛生物學效應的促炎趨化因子，可激活體內(nèi)中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和淋巴細胞，使其釋放溶菌酶，并增強溶菌酶的活性及吞噬效應，導致相應組織器官的病理損傷。Gamonal等[26]發(fā)現(xiàn)牙周炎患者齦溝液中的IL-8水平顯著高于正常對照者，提示IL-8可能是牙周炎的標志性炎癥因子之一。IL-6是一種多效應細胞因子，是牙周炎與CKD共同的炎癥因子，在牙槽骨的破壞中充當重要角色，其濃度與牙周炎的發(fā)生發(fā)展及其破壞程度密切相關。IL-6可通過增加急性期反應蛋白的產(chǎn)生加重炎癥反應，抑制hPDLCs生長，誘導破骨細胞的分化成熟，影響牙周組織健康[27]。Kobayash等[28]發(fā)現(xiàn)健康牙周組織中IL-6含量極少，在探診深度＞3 mm位點的牙周組織中分泌量增多，而在探診深度＞6 mm位點的牙周組織尤為明顯，牙周組織中IL-6含量與探診深度密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，IS在濃度為125 μmol/L時可上調(diào)hPDLCs炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8mRNA和蛋白的表達水平，且促炎作用呈濃度依賴性，表明IS可誘導hPDLCs產(chǎn)生炎癥反應。關于IS促進炎癥因子釋放，有研究[15,29]表明其可以通過體內(nèi)ROS的產(chǎn)生以及激活核轉錄因子κB產(chǎn)生各種細胞因子和炎癥介質(zhì)，從而導致腎臟受損。本研究中，125 μmol/L的IS可以上調(diào)hPDLCs炎癥因子、蛋白的表達，與ROS表達增加相符，與前述研究結果一致。

氧化損傷與牙周炎的嚴重程度密切相關，牙周炎患者的唾液和血液中的ROS水平高于牙周健康人群[30]。高水平ROS是牙周炎患者探診深度、附著水平、牙齦指數(shù)的危險因素[31]。在正常生理情況下，機體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，ROS可維持在無害的極低水平。但當機體代謝異常時，大量ROS自由基的產(chǎn)生或機體抗氧化物質(zhì)的不足可導致氧化與抗氧化失衡，使機體處于氧化應激狀態(tài)，并進一步引發(fā)以細胞死亡和組織損傷為表現(xiàn)的一系列病理過程[32]。Lin等[33]發(fā)現(xiàn)濃度為10 μmol/L的IS可通過增加ROS水平導致細胞凋亡。ROS可通過直接破壞牙周支持組織以及間接免疫損傷造成牙周炎的發(fā)生發(fā)展[34-36]。本研究發(fā)現(xiàn)當IS濃度為125 μmol/L時可增加hPDLCs中ROS的表達，且ROS表達量與IS濃度呈正相關。氧化應激的產(chǎn)生是IS導致腎臟、血管平滑肌細胞損傷的最主要因素，其核心為IS導致細胞內(nèi)炎性小體激活，使得炎癥因子增加[37]。本研究與上述研究結果一致，hPDLCs增殖及炎癥因子表達與ROS表達同步，表明ROS在IS對hPDLCs生物學特性的影響中可能起到重要作用，但其具體機制仍需進一步實驗探究。

本研究通過使用生理范圍內(nèi)不同濃度的IS刺激hPDLCs，發(fā)現(xiàn)125 μmol/L濃度水平的IS可抑制其增殖，并上調(diào)相關炎癥因子及ROS的表達水平。初步證實了IS可能是CKD患者更易罹患牙周炎的關鍵因素之一。該結果為CKD的治療提供了潛在的新思路，但IS作用于hPDLCs的具體機制仍有待進一步研究。