余從巧 鄧 芳 趙紅山 徐靖辰 王彥芹，2*

（1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300）

（2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾843300）

自然條件下，極端溫度［1］、水脅迫［2］、鹽脅迫［3，4］、病原物［5］、氧化脅迫等因素都可能嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育［6］。為降低由此帶來的惡劣影響，生物體通過自身的調(diào)節(jié)作用來抵御逆境脅迫［7］，其中WRKY家族起重要作用［8］。WRKYs是植物轉(zhuǎn)錄因子中較大的一類，其啟動子靶點(W-box)具有(T)(T)TGAC(C/T)序列，它是由大約60 個保守殘基組成的DNA 結(jié)合區(qū)域，該區(qū)域包含高度保守的WRKYGQK七肽［9］，因此而得名。

自Ishiguro 等從甘薯中克隆第一個WRKY 基因SPF1 以來［10］，研究人員已從玉米、水稻、擬南芥、可可、煙草、棉花等多種植物的根、葉片、花序、種子、微觀組織中克隆了超過500 個WRKY 基因的ESTs 序列。大量研究表明，WRKY 基因在抗旱、耐熱、抗鹽堿、抗病蟲害方面均有顯著的作用。例如：水稻中OsWRKY11 的過表達，可以使其抗旱性增強［11］；擬南芥AtWRKY39 的過表達，可以使植株耐熱性提高［12］；棉花的GhWRKY17 過表達，使其具有耐鹽堿的能力［13］；煙草中的NtWRKY3 和NtWRKY6 的基因沉默表達，可以使煙草抗煙草天蛾［14］。

自1994 年，WRKY 基因被爭相研究，水稻［15，16］、擬南芥［17］中對于WRKY 基因的描述與研究都相對詳盡，但其在花花柴中研究較少。花花柴（Kareliniacaspica）屬于菊科，花花柴屬，主要分布于內(nèi)蒙古西部、寧夏、甘肅中部及新疆地區(qū)，生于戈壁灘、沙丘、草甸鹽堿地或葦?shù)厮锱浴Ｗ鳛樗死敻缮衬c綠洲的過渡植物，花花柴在防風(fēng)固沙方面有顯著的作用［18］，對沙漠植物花花柴抗逆性的研究，將有利于抗逆性植物及其基因資源的發(fā)掘和利用。本文以花花柴為研究對象，從本課題組已完成的常溫-高溫轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中篩選出差異表達的WRKY 基因（差異表達倍數(shù)在兩倍以上），從中挑選出兩個表達趨勢相反的基因進行表達模式分析，并將篩選出的15 個WRKY 基因與水稻、擬南芥中的WRKY 基因建立系統(tǒng)發(fā)育樹進行分析，利用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果對花花柴中WRKY基因的結(jié)構(gòu)域進行功能預(yù)測。

1 實驗用品與方法

1.1 實驗用品

1.1.1 實驗材料與試劑

花花柴植株樣品來源于塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室恒溫培養(yǎng)室，處理環(huán)境為塔里木大學(xué)逸夫?qū)嶒灅菤夂蚺囵B(yǎng)箱。按0、2、4、8、12（h）時間梯度摘取葉片，用液氮速凍，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用TransGen Biotech 的試劑盒TransZolPlant、TransScriptALL-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2*EasyTaq PCR SuperMix、液氮、TAE緩沖液、DEPC。

1.1.2 實驗儀器與工具

電子天平、PCR 儀（eppendorf 型號）、低溫高速離心機（eppendorf 5415R）、核酸微量分析儀（Thermo NanoDrop One）、電泳儀（BIO-RAD 型號）、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、水浴鍋、研缽。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

對前期本課題組已完成的花花柴常溫-高溫轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析，篩選出15 個差異表達的WRKY基因，利用ggplot2 對其做熱圖分析。利用NCBI 中的ORF Finder 查找出WRKY 基因的開放閱讀框，利用MEME 在線軟件對其氨基酸序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析；再利用MEGA6 和Clastx 將這15 個WRKY 基因與水稻、擬南芥中的WRKY 基因進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，最后用PLACE 軟件對基因序列順式元件進行功能預(yù)測。

1. 2. 2 高溫脅迫下花花柴WRKY 基因的表達模式分析

選擇有8-10 個葉片的室內(nèi)培養(yǎng)的花花柴植株，在恒溫氣候箱中45℃高溫處理，將摘取的幼嫩葉片利用試劑盒TransZolPlant 提取總RNA，再用TransScriptALL-in-One First-Strand cDNA Synthesis Super-Mix for PCR 的試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按時間梯度五個一組進行表達模式分析。以cDNA 為模板，在PCR 管中加入Primer-R 0.4μL、Primer-F 0.4μL、模板1μL、2*EasyTaq PCR SuperMix 10μL，用ddH2O 補充至20 μl。用18S 與目標(biāo)基因進行對照實驗，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花花柴WRKY基因家族的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析與篩選

以高溫（45℃）這一逆境條件處理花花柴2 h，對WRKY基因家族進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，其中綠色代表基因下調(diào)表達，而紅色代表基因上調(diào)表達。所研究的15 個基因中上調(diào)表達的占8 個，下調(diào)表達的占7 個（ 如 圖 1）。 其 中 CL1655. Contig1_All、Unigene16322_All、Unigene8397_All、Unigene20809_All、CL5354. Contig2_All、CL4493. Contig1_All、CL4493.Contig2_All、Unigene31044_All 在高溫處理下上調(diào)表達，其中Unigene31044_All 基因上調(diào)表達的倍數(shù)最多，達3 109. 3 倍。 而Unigene19088_All、Unigene13217_All、 CL3390. Contig4_All、 Unigene24032_All、Unigene12940_All、Unigene10861_All、CL4998.Contig1_All在高溫環(huán)境下下調(diào)表達。

2.2 花花柴WRKY基因的保守序列分析

通過MEME 軟件比對分析（如圖2），發(fā)現(xiàn)15 個WRKY 蛋白均含有WRKY 家族絕對保守的氨基酸殘基WRKYGQK，有時也可采用WRKYGKK 的形式［9］，該結(jié)構(gòu)是WRKY 結(jié)構(gòu)域中的核心序列。 除WRKYGQK（WRKYGKK）序列具有高保守性，在第5位的D（天冬氨酸Asp）、第24 位的R（精氨酸Arg）、第26 位的Y（酪氨酸Tyr）、第29 位的C（半胱氨酸）同樣具有高保守性。

圖1 花花柴WRKY基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析熱圖

圖2 花花柴WRKY家族保守結(jié)構(gòu)域序列比對

2. 3 花花柴及幾種模式植物WRKY 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過聯(lián)合建樹，將WRKY 基因家族分為7 個亞族，分別表示為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ（如圖3）?；ɑ?柴Unigene8397_All、Unigene16322_All、CL1655.Contig1_All 這3 個WRKY 基 因 在Ⅲ族；Unigene12940_All、CL4998. Contig1_All2 個WRKY 基 因在Ⅳ族；Unigene31044_All、CL5354. Contig2_All2 個WRKY 基 因 在Ⅴ族；CL3390. Contig4_All、CL4493.Contig1_All、CL4493. Contig2_All、Unigene19088_All4個WRKY 在Ⅵ族 中；Unigene20809_All、Unigene10861_All、Unigene24032_All、Unigene13217_All4個WRKY基因在Ⅶ族。

圖3 花花柴與擬南芥、水稻W(wǎng)RKY基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 花花柴WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能預(yù)測

在PLACE 軟件上對順式元件進行功能預(yù)測，從表1 中可以發(fā)現(xiàn)篩選出的15 個基因中有共同的、與生態(tài)逆境有關(guān)的順式作用元件：ABR1 結(jié)合元件、CCAAT 盒、GT-1 盒、LTRE-1、CuRE 核心序列、Nt-BBF1、KST1、MYB1AT、W 盒、ACGT 盒、MYB 核心序列、MYC 識別位點、P 盒、LTRE 核心序列、HSE，在不同基因中順式作用元件的數(shù)量存在著一定的差距。如與高溫有關(guān)的HSE 熱激元件，僅在CL4998. Contig1_All 中存在。但大部分基因中含有與HSEs 共同促進熱激啟動子活性的CCAAT 盒。與低溫相關(guān)的有：LTRE-1、MYC識別位點、LTRE-1 核心序列，MYC識別位點在各個WRKY 基因中數(shù)量都較多。與干旱這一非生物脅迫有5個順式作用元件都與其相關(guān)，分別是：ABRE 類、KST1、ACGT 盒、MYB 識別位點、MYC識別位點。與抗病相關(guān)的元件W 盒也存在于各基因中，只是數(shù)量存在差異。

2.5 利用表達模式分析功能預(yù)測的準(zhǔn)確性

從15個差異表達的WRKY基因中篩選兩個表達趨勢相反的基因：CL4493. Contig1_All、CL4998. Contig1_All 進行表達模式分析。由圖4 可以看出基因CL4493.Contig1_All 在未處理時有較少量的表達，高溫處理2 h 后表達量降低，在處理4 h 后表達量明顯升高，在處理8 h 后表達量較4 h 低，但較未處理時

高，在處理12 h 后表達量在整個處理時間中最高。基因CL4998. Contig1_All 在處理4 h 前表達量均較低，在處理4 h 后表達量增加，但是在8 h 后表達量降低，在處理12 h 后表達量增加在整個處理過程中達到最高。

表1 花花柴WRKY基因順式作用元件功能預(yù)測

圖4 CL4998.Contig1_All、CL4493.Contig1_All的表達模式分析

3 討論

近年來，在水稻［11］、擬南芥［12］、大豆［19］、煙草［14］、棉花［13］等植物中對于WRKY 基因的研究尤為火熱，闡述了WRKY 基因在非生物脅迫下至關(guān)重要的作用［20］，但是查閱大量文獻數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)鮮少有關(guān)于花花柴這一荒漠植物該基因的研究。

本文主要是對基因進行篩選分析，著重研究花花柴WRKY轉(zhuǎn)錄因子在高溫脅迫下差異表達的15個基因。這個數(shù)據(jù)相對于水稻中的84個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，擬南芥中的72 個WRKY 基因較少，但較煙草的11 個WRKY 基因多，因此分析花花柴WRKY 數(shù)量較少可能是物種間差異及生長環(huán)境不同帶來的影響。通過熱圖分析，初步推斷高溫對基因的影響，在這15個基因中有8 個基因上調(diào)表達，7 個下調(diào)表達。我們將這15 個蛋白的氨基酸序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)均含有WRKY 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域WRKYGQK（WRKYGKK），兩者最大的不同在于第6 位上的谷氨酰胺（Q）和賴氨酸（K）的不同，其中有14 個氨基酸是WRKYGQK，僅有Unigene20809_All 這個氨基酸為WRKYGKK。

通過對系統(tǒng)發(fā)育樹同亞族其他基因的功能分析，推測花花柴WRKY 基因可能存在的作用。在Ⅲ中與3 個花花柴WRKY 同源性較高的ATWRKY70 具有抵御干旱脅迫［21］、抗?。?2］的功能，因此推測Unigene8397_All、Unigene16322_All、CL1655. Contig1_All同樣具有抵御干旱脅迫、抗病的功能。在Ⅳ中與Unigene12940_All 同源性較高的ATWRKY39 具有抵御氧化脅迫［23］、應(yīng)對高溫脅迫［24］的功能，因此推測Unigene12940_All 在氧化脅迫、高溫脅迫響應(yīng)中有重要意義；與CL4998. Contig1_All 同源性較高的是ATWRKY7，該基因具有抗?。?5］的功能，因此我們推測CL4998. Contig1_All 可能具有抗病的功能。在Ⅴ中與Unigene31044_All 同源性較高的ATWRKY61、與CL5354.Contig2_All 同源性較高的OsWRKY4 都具有抗?。?6、27］功能，因此推測Unigene31044_All、CL5354.Contig2_All 在抗病方面有重要意義。在Ⅵ中與CL3390. Contig4_All 同源性較高的ATERKY34 具有應(yīng)對低溫脅迫［28］、影響雄性配對發(fā)生［29］的作用，因此推測CL5354.Contig2_All 在應(yīng)對低溫脅迫、影響雄性配對發(fā)生起重要作用；與CL4493. Contig1_All、CL4493. Contig2_All 同 源 性 較 高 的ATWRKY26 具 有抗高溫［24］、干旱、NaCl［34］脅迫的功能，可推測這兩個基因同樣具有以上功能；與Unigene19088_All同源性較高的ATWRKY33 具有抵御干旱、抗NaCl 脅迫［31］、抗 高 溫［32］及 抗 ?。?3］的 功 能，由 此 推 測Unigene19088_All 同樣具有以上功能。Ⅶ族中與Unigene20809_All 同源性較高的ATWRKY51、與Unigene10861_All 和Unigene24032_All 同源性較高的ATWRKY57、與Unigene13217_All 同源性較高的ATWRKY71都具有抗病［34，35］的作用，因此推測該亞族的4個花花柴WRKY基因具有抗病的作用。

通過預(yù)測順式作用元件功能發(fā)現(xiàn)，一個作用元件都不只存在于一個基因上，每一個順式作用元件也不只具有一個功能。ID 為Unigene10861_All 的基因中就含有CCAAT 盒、GT-1 盒、LTRE-1、KST1、W盒、ACGT 盒、MYB 核心序列、MYC 識別位點、HSE 等多個順式作用元件；ABRE 類也同時具有耐旱、缺氧、氧化脅迫等多個功能。每個順式作用元件的作用位點都有差別，它們利用各自耐旱、耐高低溫、抗病、耐鹽、抗氧化等相關(guān)功能，相互協(xié)調(diào)，共同作用，使同一植株中同一基因家族的不同基因表現(xiàn)出其差異性，發(fā)揮不同功能。針對外界不同程度的非生物脅迫調(diào)節(jié)自身的表達量，以此來適應(yīng)外界的變化，以維持植物正常的生長發(fā)育。

研究表明鹽脅迫［3］、激素、干旱［2］、病蟲害［5］、極端溫度［1］等非生物脅迫對WRKY 基因的表達量有一定的影響。AtWRKY25 和AtWRKY26 在未處理時均不表達，但在高溫處理后表達量明顯增加［36］。而通過對篩選出來的2個基因進行表達模式分析，發(fā)現(xiàn)在對植株進行高溫處理時，兩個基因存在相同的變化趨勢，即在處理前表達較弱，而在處理4 h 后基因的表達量均存在先增加后減少再增加的過程。該變化趨勢與前期測定花花柴對高溫脅迫響應(yīng)的生理變化趨勢一致，表現(xiàn)出脅迫-應(yīng)激-適應(yīng)的波浪式變化過程［37］。以上分析均說明高溫對WRKY 基因的表達量有明顯影響。

本研究為荒漠植物及其基因資源的發(fā)掘利用提供一定的參考價值，但僅對基因前期工作進行探究，并未對基因的功能及調(diào)控系統(tǒng)進行具體的研究，因此還需要后續(xù)更深入的功能分析。