高佳敏 潘姣姣 魏鑫豪 桂成坤 孫世浩 張秋林 熱衣汗·玉素甫 李蓮瑞 石長(zhǎng)青

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的一種在家畜之間流行的高度傳染性疫病，豬為該病的主要傳染源和宿主［1］。母豬以繁殖障礙為主要癥狀，如妊娠母豬流產(chǎn)、死胎等情況；仔豬則以發(fā)熱、腹瀉、呼吸困難、神經(jīng)癥狀如共濟(jì)失調(diào)、肌肉震顫等為臨診特征［2］；患病公豬會(huì)出現(xiàn)睪丸腫脹、萎縮等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成公豬不育，影響繁殖數(shù)量，為生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3］。

阿克蘇地區(qū)位于新疆維吾爾自治區(qū)中部，塔里木盆地北部，天山山脈中段南麓。生豬養(yǎng)殖業(yè)是阿克蘇地區(qū)畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)之一，是阿克蘇地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要方向［4］。本次血清學(xué)調(diào)查主要在2019 年1 月-11 月期間，采用間接酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）的測(cè)定方法，檢測(cè)新疆阿克蘇地區(qū)6 個(gè)生豬標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)共計(jì)644 份血樣的PRV-gE 蛋白抗體情況，以期了解阿克蘇地區(qū)部分豬場(chǎng)偽狂犬病毒野毒的感染情況。

1 材料

1.1樣品來(lái)源

2019 年1 月-11 月期間，采集自新疆阿克蘇地區(qū)6 個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)644 份全血，將6 個(gè)生豬養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行編號(hào)A-F。采集全血樣品為不同年齡階段的豬群，分別為經(jīng)產(chǎn)母豬、種公豬、后備母豬、保育豬、仔豬。所采集血樣的6 個(gè)豬場(chǎng)均按照免疫程序免疫過gE 基因缺失疫苗，且未免疫過gE基因未缺失疫苗。

1.2試驗(yàn)儀器和材料

豬偽狂犬病病毒gE（PRV gE）抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒（北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司）、自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD+iMarK）、采血器、離心機(jī)、微量移液器（Eppendorf）、計(jì)時(shí)器、震蕩儀、量筒、燒杯、錐形瓶等。

2 方法

2.1樣品采集

使用采血器無(wú)菌采集豬的前腔靜脈血3-5 mL/頭，待血清析出后，將血樣放置帶有冰袋的泡沫箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。將血樣放入離心機(jī)3 000 rpm/min 離心5 min，吸取上部淡黃色、透明清亮液體至無(wú)菌離心管，編號(hào)后立即檢測(cè)。

2.2 檢測(cè)方法

按照PRV-gE 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)離心好的新鮮血清進(jìn)行PRV-gE蛋白抗體水平檢測(cè)。

首先，將1:1稀釋樣品、陰性對(duì)照血清（NC）、陽(yáng)性對(duì)照血清（PC）加入抗原包被板相應(yīng)孔中室溫（25±3 ℃）孵育1 h。然后，棄去孔中液體并進(jìn)行洗滌；每孔加入100μl抗PRV gE HRP 標(biāo)記抗體，室溫孵育20 min；孵育結(jié)束后棄去孔中的液體，再次進(jìn)行洗滌。洗滌完成后向每孔加入100 μl 的TMB 底物液，在室溫條件下孵育15 min。再向每孔加入50 μl 的終止液，以終止酶促反應(yīng)；最后，使用自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)量吸光度值。

2.3 結(jié)果判定

（1）試驗(yàn)成立條件：判定本試驗(yàn)是否成立，需要滿足以下條件：①陰性對(duì)照的OD450nm平均值＞0.7；②陽(yáng)性對(duì)照S/N 值＜0.3；③如果檢測(cè)結(jié)果不在界定范圍則需要重新進(jìn)行檢測(cè)。（本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果中有兩份樣品檢測(cè)結(jié)果為可疑樣品，重復(fù)檢測(cè)后判定為陰性）

（2）NC OD值計(jì)算方法：NC OD值=（NC1+NC2）/2。

（3）樣品S/N值計(jì)算方法：S/N=樣品OD值/NC OD值。

3 結(jié)果

3.1不同規(guī)?；i場(chǎng)PRV-gE 感染率分析

對(duì)阿克蘇地區(qū)不同規(guī)模豬場(chǎng)PRV-gE 感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果詳見表1。

表1 阿克蘇地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)偽狂犬病毒gE抗體檢測(cè)結(jié)果

由表1 可知：被檢豬血清644 份，gE 蛋白抗體陽(yáng)性13 份，陽(yáng)性率為2. 02%。生豬養(yǎng)殖場(chǎng)A-F 中，B、D、E 共3 個(gè)場(chǎng)（養(yǎng)殖場(chǎng)）檢測(cè)出gE 抗體陽(yáng)性血清，陽(yáng)性率分別為4.26%、4.25%、6.38%。6個(gè)豬場(chǎng)的平均抗體陽(yáng)性率為2. 48%。結(jié)果顯示，新疆阿克蘇地區(qū)部分豬場(chǎng)的PRV-gE蛋白抗體陽(yáng)性率偏低，但PRV在阿克蘇地區(qū)仍存在。

3.2 不同年齡豬群PRV-gE 抗體陽(yáng)性率分析

對(duì)阿克蘇地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)不同年齡階段豬群進(jìn)行PRV-gE感染情況進(jìn)行分析，結(jié)果詳見表2。

表2 阿克蘇地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)不同年齡階段豬偽狂犬病毒gE抗體檢測(cè)結(jié)果

由表2 可以看出：后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬、保育豬、種公豬、仔豬的PRV gE 抗體陽(yáng)性率分別為1. 36%、2.61%、1.82%、1.52%、2.78%。結(jié)果顯示：所檢測(cè)豬群中，PRV gE 抗體陽(yáng)性率最低的是后備母豬，最高的是仔豬。

4 討論

經(jīng)調(diào)查，本試驗(yàn)的6個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采用的偽狂犬疫苗均為PRV-gE 基因的缺失疫苗。PRV 病毒屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）、ɑ-皰疹病毒亞科（Alpha herpesviridae），具有典型的皰疹病毒特征，PRV 的gE、TK、gG、gI 等毒力基因是其復(fù)制的非必須基因［5］；其中g(shù)E 蛋白具有最典型的膜蛋白特征，對(duì)PRV 侵襲神經(jīng)、體內(nèi)毒力表達(dá)和沿著神經(jīng)傳遞都起著十分重要的作用［6］。幾乎所有的PRV 野毒株都可以表達(dá)gE糖蛋白，且gE缺失毒株與野生毒株相比，毒力大大降低，因此gE 基因在PRV 的野毒株鑒別診斷中具有重要意義［7］。本試驗(yàn)采用豬偽狂犬病毒的gE 蛋白作為包被抗原的間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，對(duì)新疆阿克蘇地區(qū)6 個(gè)生豬標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)共計(jì)644 份血樣的gE蛋白抗體情況進(jìn)行了檢測(cè)與分析。

4. 1 阿克蘇地區(qū)不同規(guī)?；i場(chǎng)PRV-gE 蛋白抗體水平

檢測(cè)結(jié)果表明：644份血清中，檢測(cè)出PRV-gE抗體陽(yáng)性血清13 份，陽(yáng)性率為2. 02%，低于2018 年魏其［8］報(bào)道的北疆地區(qū)PRV-gE 蛋白抗體陽(yáng)性率45. 14%，低于2018 年馬博［9］報(bào)道的新疆巴州地區(qū)PRV-gE抗體陽(yáng)性率9.48%，低于2013年宋剛?cè)A［10］報(bào)道的新疆庫(kù)車縣PRV-gE 抗體陽(yáng)性率13. 70%，也低于2015 年高亮［11］報(bào)道的伊寧市g(shù)E 抗體陽(yáng)性率19.31%。說(shuō)明阿克蘇地區(qū)生豬養(yǎng)殖場(chǎng)的偽狂犬病免疫保護(hù)工作做得比較好。6個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)中有3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)檢測(cè)出有g(shù)E 陽(yáng)性抗體，平均gE 抗體陽(yáng)性率為2.48%；不同豬場(chǎng)的感染率不同，說(shuō)明各個(gè)豬場(chǎng)對(duì)豬偽狂犬病的防控程度不一，這可能與各豬場(chǎng)的地理位置、養(yǎng)殖密度、飼養(yǎng)管理水平和疫苗程序等多方面因素相關(guān)。

4. 2 阿克蘇地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)不同類別豬群PRV-gE蛋白抗體水平

不同年齡階段的豬群豬偽狂犬病野毒感染情況存在差異，但差異情況并不明顯。調(diào)查結(jié)果表明：經(jīng)產(chǎn)母豬和仔豬陽(yáng)性率較高，分別為2.61%和2.78%；后備母豬和保育豬的陽(yáng)性率稍低，分別為1. 36%和1.82%；種公豬的陽(yáng)性率最低為1.52%；與2018 年馬博［9］報(bào)道的新疆巴州地區(qū)的結(jié)果相一致，與2017 年蘇玉賢［12］報(bào)道的河南地區(qū)平頂山市的結(jié)果也相一致。其中，經(jīng)產(chǎn)母豬陽(yáng)性率較高說(shuō)明經(jīng)產(chǎn)母豬經(jīng)過多次免疫，抗體效價(jià)較高；但也極有可能是經(jīng)產(chǎn)母豬帶毒普遍，只表現(xiàn)陰性感染，帶毒而不發(fā)病。若是陰性感染就需要加強(qiáng)經(jīng)產(chǎn)母豬的豬偽狂犬病抗原水平檢測(cè)［13］。而仔豬陽(yáng)性率較高可能是由染病母體傳染給胎兒，偽狂犬病病毒可通過胎盤垂直傳給胎兒，且被感染種豬和所生仔豬可長(zhǎng)期帶毒。

通過試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，阿克蘇地區(qū)預(yù)防PR 的免疫效果較好，但部分豬場(chǎng)仍有感染的情況，因而還需加強(qiáng)豬場(chǎng)飼養(yǎng)管理和疾病預(yù)防工作。