童劍軍 何川川 米麗開姆·托合提尼亞孜 張雪萍 段彥祥 李有文，2*

(1 塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾843300）

（2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾843300）

（3 塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾843300）

流行性乙型腦炎(Epidemic encephalitis type B)，簡稱乙腦，于1934年在日本發(fā)現(xiàn)，因此又被稱為日本乙型腦炎（Japanese encephalitis）。該病作為一種人獸共患傳染病，早已引起了業(yè)內(nèi)外人士的廣泛關(guān)注。本病主要流行于東南亞等地區(qū)，典型癥狀表現(xiàn)為意識障礙、體溫升高，昏迷，更甚者可出現(xiàn)神經(jīng)性癥狀［1，2］，在家畜中尤以豬感染最為嚴重［3，4］。主要表現(xiàn)為突然發(fā)病，體溫呈稽留狀態(tài)。妊娠期母豬出現(xiàn)高熱、流產(chǎn)、死胎等癥狀，公豬則出現(xiàn)生殖障礙［5，6］，嚴重影響了我國畜牧產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。世界衛(wèi)生組織也將其列為重點防控對象［7］。

乙型腦炎病毒作為黃病毒科的一種單鏈RNA病毒，由11 000 個核苷酸所構(gòu)成，含有一個特殊結(jié)構(gòu)---多聚蛋白編碼框。該框能夠編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白（C、M、E）以及七種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）［8］，而其中的NS4B 蛋白在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用［2］。據(jù)有關(guān)資料顯示，黃病毒科病毒由膜相關(guān)的復(fù)合體介導復(fù)制，ns4b 與ns2a、ns2b 和ns4a 三種基因共同構(gòu)成該復(fù)合體［9］。但其他黃病毒科病毒的研究結(jié)果顯示，ns4b與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性更高，然而其相關(guān)機制尚不明確。Tajima 等人認為黃病毒科中NS4A 與NS4B 發(fā)生互作［10］，但Yu 等卻發(fā)現(xiàn)在Vero 細胞中，西尼羅河病毒（West Nile Virus）的NS4A 與NS4B 未互作［11］。由此可知在整個黃病毒科中，不同病毒種的非結(jié)構(gòu)蛋白作用方式差異顯著。NS4B 蛋白自身就是一個典型的跨膜蛋白，有三個跨膜區(qū)域，來回穿梭于膜中，其可能對膜的活性、膜的物質(zhì)和能量交換意義重大。在其致病過程中，病毒自身的蛋白質(zhì)功能起著關(guān)鍵的作用，但我們對JEV 的NS4B 蛋白的功能知之甚少，為研究NS4B 蛋白的功能并進一步揭示其分子作用機制，本研究擬獲得乙型腦炎P3 株ns4b 基因的重組表達蛋白，預(yù)測蛋白性質(zhì)和功能，以期進一步研究該蛋白的功能。

1 材料

1.1 菌種與載體

乙腦病毒P3 株由華中農(nóng)業(yè)大學曹勝波教授饋贈；大腸桿菌DH5α、BL21 以及原核表達載體均保存于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室。

1.2 主要藥品及試劑

Primestar HS DNA Polymerase、dNTP、T4 DNA 連接酶(購自大連寶生物科技有限公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購買北京天根生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，Nde I、Xho I(購自Thermo 公司)，DNA 純化試劑盒(購自美國Omega 公司)。其他試劑按說明書配制。

1.3 主要使用儀器

DYY-12 瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司），全自動凝膠成像分析儀、HC 高電流電泳儀、T100Thermal Cycler 梯度PCR 儀、Mini-PROTEAN Tetra 電泳槽、Mini-Trans-Blot 電泳轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad生命科學有限公司），XMTP-204 梯三孔三溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SWCJ-2FD 超凈工作臺（BXOXUN）等。

2 方法

2.1 原核表達載體的構(gòu)建

2.1.1 ns4b基因特異性引物設(shè)計

參考GenBank 中公布的乙型腦炎病毒JaOArS982 參考株(登錄號：NC001437)4B 基因序列，用DNAstar 軟件設(shè)計特異性引物，送公司合成。如表1(下劃線為加入酶切位點：Nde I/Xho I)。

表1 引物合成表

2.1.2 ns4b基因的PCR擴增與產(chǎn)物回收

以乙型腦炎病毒P3 株基因組cDNA 為模板，進行PCR 擴增。PCR 產(chǎn)物純化回收并鑒定（按試劑盒說明書操作）。

2.1.3 原核表達載體pET-42b-NS4B的構(gòu)建及鑒定

用Nde I 和Xho I 雙酶切pET-42b 質(zhì)粒和回收的PCR 產(chǎn)物，酶切后產(chǎn)物利用DNA 純化試劑盒純化并收集。將二者連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂板培養(yǎng)篩選獲得陽性菌提取質(zhì)粒，并用雙酶切（Nde I/Xho I）鑒定，質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

2.2 NS4B蛋白表達鑒定

將陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21，對其表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE 電泳，并進行Western Blot檢測，具體參照李有文［12］的方法。

2.3 NS4B蛋白的生物信息學分析

2.3.1 蛋白信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測

NS4B 蛋白信號肽的預(yù)測，使用在線軟件服務(wù)器SignalP4. 1Server，網(wǎng)址為http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/；NS4B 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測，使用在線軟件服務(wù)器TMHMMServerv. 2. 0，網(wǎng)址為http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/。

2.3.2 蛋白糖基化位點、磷酸化位點和抗原決定簇的預(yù)測

NS4B 蛋白糖基化位點和磷酸化位點的分析預(yù)測，使用在線軟件服務(wù)器NetOGlyc4. 0Server(http://www. cbs. dtu. dk/services/NetOGlyc/)和NetPhos3.1Server(http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/)。NS4B 蛋白質(zhì)抗原決定簇的預(yù)測，使用在線軟件服務(wù)器PredictingAntigenicPeptides，網(wǎng) 址 為http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl。

2.3.3蛋白質(zhì)抗原指數(shù)和β-turn的預(yù)測

NS4B 蛋白抗原指數(shù)和β-turn 的預(yù)測，使用在線軟件服務(wù)器IEDB，預(yù)測的網(wǎng)址為http://www. iedb.org。

2.3.4蛋白質(zhì)親水性和柔韌性的預(yù)測

NS4B 蛋白親（疏）水性和柔韌性的預(yù)測，使用在線軟件服務(wù)器ProtScale 和IEDB，預(yù)測的網(wǎng)址分別為http://web. expasy. org / protscale/和http://www. iedb.org。

2.3.5蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的分析預(yù)測

對于NS4B 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析及預(yù)測，使用在線軟件服務(wù)器SOPMA(https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)和GalaxyTBM(http://galaxy. seoklab. org/)；對 于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的分析預(yù)測及立體模型構(gòu)建，使用在線軟件服務(wù)器Phyre2，網(wǎng)址為http://www. sbg. bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index。

3 結(jié)果與分析

3.1 ns4b基因的擴增

以JEV P3株的基因組為模板PCR 擴增的ns4b基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果(圖1)，在近800 bp處有一條帶，與預(yù)期大小相符。

圖1 ns4b基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

3.2 NS4B蛋白原核表達載體鑒定

3.2.1 酶切鑒定

經(jīng)菌液PCR 鑒定，將陽性菌提取質(zhì)粒并Nde I/Xho I 的雙酶切鑒定，結(jié)果得到了與理論相符的載體和目的基因兩條帶(圖2)，鑒定為陽性克隆。

圖2 pET-42b-NS4B質(zhì)粒雙酶切（Nde IXho I）

3.2.2 測序結(jié)果

將鑒定正確的單菌落37 ℃過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pET-42b-NS4B，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定，結(jié)果表明P3 株NS4B 基因全長765 bp，與參考株同源性99%以上，編碼255 個氨基酸，測序結(jié)果見表2。

表2 ns4b核苷酸和氨基酸序列

3.3 ns4b遺傳進化序列分析

根據(jù)P3 株測序結(jié)果與GenBank 中發(fā)表的JEVns4b 的序列進行遺傳進化分析(圖3)，可見ns4b 基因已發(fā)現(xiàn)的25 個毒株的遺傳距離很小，只有0.8，說明其親緣關(guān)系較近，其中P3 株該基因與JEV strain HW和JEV isolate JEV-hubei 親緣關(guān)系最近，說明ns4b 基因非常保守，對病毒生長繁殖作用重大。

圖3 ns4b遺傳進化序列分析

3.4 NS4B蛋白的表達

3.4.1 SDS-PAGE 鑒定

將正確克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 并誘導表達的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示：NS4B蛋白與His 標簽融合表達了27 KDa 的蛋白(圖4)，以包涵體形式表達在沉淀中，上清中含量很低。

圖4 pET-42b-NS4B蛋白表達

3.4.2 Western Blot檢測

以His 單抗進行Western blot 檢測其His 融合蛋白的表達(圖5)，于25 KDa-35 KDa 處出現(xiàn)蛋白印跡，說明融合表達成功。

圖5 Western blot結(jié)果

3.5 NS4B蛋白生物信息學分析結(jié)果

3.5.1 信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果

NS4B 無信號肽（圖6）。NS4B 為膜蛋白，有255個氨基酸，1-90aa 表示在膜內(nèi)區(qū)；91-113aa 表示跨膜區(qū)；113-251aa表示膜外區(qū)，有138個氨基酸殘基在膜外區(qū)（圖7），說明NS4B確實是一個跨膜蛋白。

圖6 NS4B蛋白信號肽預(yù)測

圖7 NS4B蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

3.5.2 糖基化位點、磷酸化位點和抗原決定簇的預(yù)測結(jié)果

NS4B 蛋白共有26 個磷酸化位點(第11、20、23、44、45、49、58、60、64、67、70、74、103、137、153、162、178、190、202、204、211、216、220、229、239、249 位氨基酸)（圖8）。NS4B 蛋白擁有10 個抗原決定簇，第26～34 位 氨 基 酸(PSMALDLRP)、第36～68 位 氨 基 酸(TAWALYGGSTVVLTPLLKHLITSEYVTTSLASI)、 第71～106位氨基酸(QAGSLFVLPRGVPFTDLDLTVGLVFLGCWGQITLTT)、第108～120 位 氨 基 酸(LTAMVLATLHYGY)、第126～132 位氨基酸(QAEALRA)和第142～149 位氨基酸(MKNAVVDG)、第151～157 位氨基酸（VATDVPE）、第168～190 位 氨 基 酸（KVGQVLLIGVSVAAFLVNPNVTT）、第192～203 位氨基酸（REAGVLVTAATL）、第219～233 位氨基酸（ATGLCHVMRGSYLAG）（圖9）。

圖8 NS4B蛋白磷酸化位點的預(yù)測

圖9 NS4B蛋白抗原決定簇的預(yù)測

3.5.3 蛋白質(zhì)抗原指數(shù)和β-turn的預(yù)測結(jié)果

NS4B 蛋白抗原指數(shù)最高為1.213（圖10）；NS4B蛋白β-turn結(jié)構(gòu)最高分值為1.236，主要分布于242～248位氨基酸（圖11）。

圖10 NS4B蛋白抗原指數(shù)分析結(jié)果

圖11 β-turn 預(yù)測結(jié)果

3.5.4蛋白質(zhì)親水性和柔韌性的預(yù)測結(jié)果

分值高的氨基酸為第14～21 位氨基酸，第207～245 位氨基酸，得分最高為5. 586（圖12）；分值高的氨基酸區(qū)段主要為第13～21 位氨基酸、第40～46 位氨基酸、第67～76位氨基酸、第214～221氨基酸、第242～250氨基酸，分值最高為1.069（圖13）。

圖12 NS4B蛋白親水性預(yù)測結(jié)果

圖13 NS4B蛋白柔韌性的預(yù)測結(jié)果

3.5.5 蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果

NS4B 蛋白中共有129 個氨基酸構(gòu)成α 螺旋，占總氨基酸數(shù)的51. 39%；有35 個氨基酸構(gòu)成了延伸鏈，占總氨基酸數(shù)的13.94%；有17個氨基酸構(gòu)成了β轉(zhuǎn)角，占總氨基酸數(shù)的6.77%；有70個氨基酸構(gòu)成無規(guī)則卷曲，占總氨基酸數(shù)的27.89%（圖14）。在線軟件服務(wù)器Phyre2 預(yù)測構(gòu)建了NS4B 蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型（圖15）。

圖14 NS4B 蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

圖15 NS4B 蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

4 討論

JEV 屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種重要的神經(jīng)性疾病病原，一直為人們所重視。由于黃病毒屬多聚蛋白編碼框的存在，使很多蛋白功能較為復(fù)雜。據(jù)研究，黃病毒屬的非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B 不僅參與病毒的組裝與復(fù)制，而且具有潛在的抗病毒靶點作用；另外，NS4B 可與另一個跨膜蛋白NS4A 通過2 KDa大小的信號肽連接形成異源二聚體而誘導膜重排［13］；還有，NS4B 蛋白能通過誘導宿主細胞的線粒體變性抑制先天性免疫反應(yīng)［14］。

本研究擴增了JEV 的P3 株ns4b 基因，其系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，JEV 雖為RNA 病毒，但其NS4B 基因的保守性較強，與目前基因庫中登錄的25 株病毒該基因的核酸序列同源性為98. 8%以上，遺傳距離僅0.8，說明NS4B 蛋白組成相當穩(wěn)定，可能對病毒生長繁殖發(fā)揮重要作用。這與黃病毒屬NS4B 蛋白參與病毒的組裝與復(fù)制的重要功能相一致。JEV-NS4B含有26 個磷酸化位點，是一個磷蛋白。磷酸化能介導蛋白活性［15］，增強蛋白相互作用的能力，因此推測JEV-NS4B 蛋白是一個活性很強的蛋白。現(xiàn)研究結(jié)果證明，NS4B 蛋白不僅可以自身相互作用形成同源二聚體，還可以與NS4A 蛋白通過2 KDa 信號肽連接形成異源二聚體，還可以與NS3 解旋酶相互作用［13］。這些蛋白間的相互作用是病毒復(fù)制復(fù)合體形成的分子基礎(chǔ)，對病毒的復(fù)制至關(guān)重要［11，16，17］，特別是NS4B蛋白與病毒的其他蛋白互作形成二聚體可以形成病毒復(fù)制泡，促進病毒增殖。但是對丙肝病毒（HCV）NS4B 蛋白研究發(fā)現(xiàn)其能通過其膜外區(qū)以及C 端的氨基酸發(fā)生自身互作，形成同源二聚體，破壞HCV NS4B二聚體的形成，能夠影響復(fù)制泡的形成，抑制病毒復(fù)制［18-20］。從這個角度考慮有望利用NS4B蛋白的自聚合來抑制病毒增殖而控制疫病。

經(jīng)預(yù)測JEV-NS4B 蛋白具有3 個跨膜區(qū)域，是一個標準的跨膜蛋白，原核表達得到不溶性的大小約為27 KDa 的蛋白，與其他黃病毒屬該蛋白疏水性非結(jié)構(gòu)膜蛋白的特性一致［8］。膜蛋白的功能之一就是作為轉(zhuǎn)運體，轉(zhuǎn)運體是細胞內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運的分子基礎(chǔ)，包括離子轉(zhuǎn)運體、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運體、營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運體以及外來物質(zhì)轉(zhuǎn)運體。有些藥物可通過對某種轉(zhuǎn)運體的抑制作用而產(chǎn)生效應(yīng)，因此轉(zhuǎn)運體可以作為藥物靶標用于疾病治療。NS4B蛋白就可作為治療黃病毒感染的一個新型藥物靶標［21］。研究表明，化合物NITD-618 能夠靶向登革熱病毒（DENV）的NS4B 蛋白，對DENV 具有明顯的抑制效果，其EC50在低至1.0μmol，但該化合物對WNV、YFV等其他黃病毒無效［22］。馬尼地平的病毒靶點是位于JEV 非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B 的130 位谷氨酰胺（Q），Q130 突變成正電氨基酸精氨酸（R）或賴氨酸（K），突變病毒對馬尼地平不敏感［23］。化合物CCG-3394和CCG-4088也能靶向NS4B 蛋白，抑制黃熱病毒（YFV）的復(fù)制［24］。因此加緊對NS4B 蛋白生物學特性和免疫特性的研究，才能更好地利用NS4B 靶標，開發(fā)更多更好的藥物治療黃病毒感染。

信號肽多由15～30個氨基酸組成，對蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移（定位）的N-末端的氨基酸序列有重要指導意義，在蛋白成熟后信號肽自然脫落，保證蛋白基本功能［25］。對JEV-NS4B 蛋白的氨基酸序列進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)其不含有信號肽，但是有研究表明黃病毒的NS4B 可與另一個跨膜蛋白NS4A 通過2 KDa大小的信號肽連接形成異源二聚體而誘導膜重排［13］，利于病毒的復(fù)制。資料顯示JEV-NS4A蛋白也不含有信號肽，這個二聚體的形成機制還有必要進一步研究。有關(guān)文獻報道，信號肽結(jié)構(gòu)有利于提高蛋白質(zhì)的可溶性［26］，無信號肽結(jié)構(gòu)的蛋白易因可溶性低而更易形成包涵體。這也提示如果要得到高質(zhì)量大量表達的該蛋白，在構(gòu)建時加一個信號肽可能會有較好的效果。NS4B 蛋白擁有10 個抗原決定簇，且含有17 個氨基酸組成可被稱為環(huán)（loop 區(qū)）的β 轉(zhuǎn)角，該區(qū)為功能性抗體的識別位點的可能性很大［27］，由此推測NS4B 蛋白具有功能性抗原的潛質(zhì)，可作為未來抗體的備選作用靶點，也能為乙型腦炎疫苗的研發(fā)提供多重選擇。NS4B 蛋白的柔韌性較為優(yōu)良，二級結(jié)構(gòu)內(nèi)α-螺旋結(jié)構(gòu)占比高達51.39%，其穩(wěn)定性可見一斑，可為篩選蛋白環(huán)節(jié)提供便利，提高抗體生產(chǎn)效率，加快疫苗研發(fā)進程；β 折疊和無規(guī)則卷曲區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)較為松散，更易于盤旋和扭曲，該區(qū)域可能存在優(yōu)勢抗原表位［28］，更容易與抗體分子結(jié)合，可有效促使機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)［29］，提高其抗病力，縮短病程。本試驗通過對乙型腦炎病毒NS4B 蛋白生物學信息分析，為后期更深入研究乙型腦炎病毒并發(fā)掘其潛在功能提供參考。