王洪巖，徐有青，李 鑫，徐睿玲，郭淑媛，付紅梅，閆朝岐

慢性酒精攝入可引起腸上皮屏障損傷、腸道通透性增加，導(dǎo)致“腸漏”，繼而引起腸源性內(nèi)毒素血癥和全身系統(tǒng)炎癥，對(duì)肝臟造成“二次打擊”，加速酒精性肝病進(jìn)展[1, 2]。目前，國(guó)內(nèi)外已有研究證實(shí)酒精通過(guò)不同的機(jī)制對(duì)腸上皮屏障造成直接的損傷，如酒精可激活Rho/ROCK信號(hào)通路，從而影響腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的分布，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞和腸上皮屏障損傷[3]。酒精可增加miRNA-212過(guò)表達(dá)，后者通過(guò)改變腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白組分ZO-1的表達(dá)和分布使腸上皮結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致“腸漏”的發(fā)生[4]。我們最新研究發(fā)現(xiàn)酒精可引起緊密連接蛋白Occludin發(fā)生細(xì)胞內(nèi)吞，破壞腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致“腸漏”[5]。腸上皮更新修復(fù)的動(dòng)力主要來(lái)源于腸上皮干細(xì)胞(intestinal stem cell，ISC)，ISC主要定位在腸隱窩基底部，它不斷增殖、分化為成熟的腸上皮細(xì)胞，后者從隱窩基底部不斷向絨毛頂端方向遷移，從而完成腸上皮的更新[6]。正常腸上皮更新修復(fù)能力很強(qiáng)，每3～4天更新一次，可在很大程度上彌補(bǔ)酒精導(dǎo)致的腸上皮屏障損傷，可實(shí)際并非如此。酒精處理小鼠小腸隱窩基底部增殖細(xì)胞數(shù)量明顯減少，推測(cè)酒精通過(guò)抑制ISC功能，損傷腸上皮更新修復(fù)能力。我們制備慢性酒精攝入小鼠模型，采用免疫組化法檢測(cè)ISC特異性標(biāo)志物L(fēng)gr5的表達(dá)，檢測(cè)腸隱窩基底部BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，研究酒精對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)動(dòng)態(tài)觀察了Brdu陽(yáng)性細(xì)胞在腸上皮的遷移情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酒精通過(guò)抑制ISC引起腸上皮細(xì)胞的增殖和遷移能力下降，從而導(dǎo)致腸上皮的更新修復(fù)能力受損。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品和試劑 18只C57BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，雄性，7～8周齡，體質(zhì)量19～23 g，在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)食，室溫為24±2℃，濕度為40%～70%，人工日夜循環(huán)照明。無(wú)水乙醇購(gòu)自北京市通廣精細(xì)化工公司(No.32061)；5-溴-2-脫氧脲苷(5-bromo-2′-deoxyuridine, BrdU)購(gòu)自Sigma試劑公司(B5002)，-20℃保存。大鼠來(lái)源抗BrdU抗體(ab6326)、兔來(lái)源抗Lgr5(ab75732)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗大鼠IgG(ab6734)和山羊抗兔IgG(ab6721)均購(gòu)自Abcam公司。

1.2 慢性酒精性肝損傷小鼠模型的制備 將18只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=9)和酒精處理組(n=9)。根據(jù)Gao-Binge模型[7]進(jìn)行改良，即給予含5%酒精的飼料喂養(yǎng)12 w，最后一次給予31.5%高濃度酒精(根據(jù)文獻(xiàn)[7]，將95%酒精6.6 ml與水13.4 ml混合，0.25 g/ml)5 g.kg-1灌胃；對(duì)照組9只小鼠正常進(jìn)食，飲用水中未添加酒精，實(shí)驗(yàn)前一天以生理鹽水灌胃。小鼠禁食8 h，2%戊巴比妥鈉(50 mg.kg-1)腹腔注射麻醉，固定小鼠，剖腹，暴露腹腔，剪取小腸組織(留取近端小腸5 cm)，置于裝有無(wú)菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，將5毫升注射器連接灌胃針，清洗腸腔內(nèi)容物，移入另一個(gè)裝有無(wú)菌生理鹽水的培養(yǎng)皿，剪成2 cm腸段，置于4%多聚甲醛固定液中。石蠟切片，脫蠟至水，制片。

1.3 腸上皮細(xì)胞增殖和遷移能力檢測(cè) 在造模成功后取材前，一次性腹腔注射BrdU(50 mg.kg-1)，分別在注射后2 h、24 h和72 h取材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3只小鼠。取小腸組織，石蠟包埋、切片，采用免疫組化法檢測(cè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。以注射BrdU后2 h時(shí)每個(gè)小腸隱窩BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)反映腸上皮細(xì)胞的增殖，動(dòng)態(tài)觀察三個(gè)時(shí)間點(diǎn)小腸絨毛最遠(yuǎn)端BrdU陽(yáng)性細(xì)胞距小腸隱窩基底部的距離，間接反映腸上皮細(xì)胞的遷移程度，使用Image J軟件測(cè)量。

1.4 ISC特異性標(biāo)志物L(fēng)gr5表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法，取石蠟切片，60℃烤片120 min；標(biāo)準(zhǔn)流程脫蠟、水化，PBST洗3次，每次5 min；加3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15～30 min；檸檬酸微波/高壓修復(fù)，室溫冷卻；PBST洗3次，每次5 min；加一抗，4℃過(guò)夜；用PBST洗3次，每次5 min；加二抗，室溫30 min；PBST洗3次，每次5 min；加DAB顯色，自來(lái)水沖洗；蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗；脫水透明，中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 小腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化 在光鏡下，與對(duì)照組小鼠比，酒精處理組小鼠小腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)大致完整，但小腸絨毛高度明顯縮短、萎縮，絨毛間隙增加(圖1)。

圖1 兩組小鼠小腸絨毛形態(tài)表現(xiàn)酒精處理組小鼠小腸絨毛明顯縮短、萎縮, 絨毛間隙增加(HE，bar=100 μm)

2.2 兩組小鼠腸隱窩Lgr5表達(dá)情況比較 酒精處理組ISC特異性標(biāo)志物L(fēng)gr5表達(dá)明顯低于對(duì)照組(圖2)。

圖2 兩組小鼠腸隱窩ISC特異性標(biāo)志物L(fēng)gr5表達(dá)情況(免疫組化, bar=25μm, 箭頭所示為L(zhǎng)gr5陽(yáng)性的ISC)對(duì)照組小鼠腸隱窩基底部可見少量Lgr5陽(yáng)性表達(dá), 酒精處理組Lgr5表達(dá)缺失

2.3 酒精抑制腸上皮細(xì)胞的增殖 酒精處理組小鼠每個(gè)腸隱窩BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為(3.50±0.65)個(gè)/腸隱窩，明顯低于對(duì)照組的【(7.90±1.08)個(gè)/腸隱窩，P<0.05，圖3A】；免疫組化結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠小腸隱窩基底部BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多，顯色清晰，而酒精處理組小鼠小腸隱窩基底部BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，顯色模糊、融合(圖3B)。

圖3 兩組小鼠腸隱窩BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)表現(xiàn)(免疫組化，bar=50μm)A：酒精處理組小鼠腸隱窩BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著下降(*P<0.05)；B：對(duì)照組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多, 結(jié)構(gòu)清晰，而酒精處理組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，顯色模糊融合

2.4 酒精抑制腸上皮細(xì)胞的遷移 在注射BrdU后72 h，對(duì)照組小鼠腸上皮細(xì)胞從小腸隱窩基底部遷移至絨毛頂端，而酒精處理組小鼠腸上皮細(xì)胞的遷移顯著滯后(圖4)。在2 h、24 h和72 h，酒精處理組小鼠小腸絨毛最遠(yuǎn)端BrdU陽(yáng)性細(xì)胞距腸隱窩基底部的距離分別為(66.67±1.60)μm、(219.40±12.11)μm和(313.90±9.76)μm，顯著短于對(duì)照組【分別為(111.10±1.60)μm、(319.00±10.04)μm和(625.90±3.34)μm，P<0.05】。

圖4 兩組小鼠腸上皮細(xì)胞遷移情況比較(免疫組化，bar=50 μm)A：腹腔注射Brdu 2 h、24 h和72 h，酒精處理組小鼠小腸絨毛最遠(yuǎn)端BrdU陽(yáng)性細(xì)胞距腸隱窩基底部的距離(即腸上皮細(xì)胞的遷移距離)均顯著短于對(duì)照組(*P<0.05)；B：兩組小鼠小腸BrdU陽(yáng)性細(xì)胞遷移表現(xiàn)

3 討論

國(guó)內(nèi)外關(guān)于酒精對(duì)ISC和腸上皮更新修復(fù)功能影響的研究甚少。在1987 年，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期慢性酒精攝入小鼠腸上皮隱窩細(xì)胞增殖率明顯低于對(duì)照組[8]。隨著ISC特異性標(biāo)志物(如Lgr5、Bmi1)的發(fā)現(xiàn)[9-11]，關(guān)于酒精對(duì)ISC影響的研究進(jìn)入一個(gè)新篇章。酒精可以明顯降低小鼠小腸組織和體外培養(yǎng)的小腸來(lái)源腸類器官ISC標(biāo)記蛋白Lgr5的表達(dá)，并可抑制體外培養(yǎng)的小腸來(lái)源腸類器官的生長(zhǎng)，提示酒精能抑制ISC的功能[12]。雖然酒精沒(méi)有明顯改變小鼠結(jié)腸組織和結(jié)腸來(lái)源腸類器官Lgr5的表達(dá)，但卻可以改變ISC的分化方向，即它降低了ISC向腸上皮吸收細(xì)胞分化，而增加ISC向腸內(nèi)分泌細(xì)胞分化，從而影響腸上皮屏障的完整性，導(dǎo)致結(jié)腸通透性增高[13]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組小鼠相比，酒精處理組小鼠腸隱窩基底部增殖細(xì)胞數(shù)量明顯降低。

腸上皮的更新修復(fù)動(dòng)力來(lái)源于ISC，它位于腸隱窩內(nèi)，具有自我更新和增殖分化功能，并受干細(xì)胞巢中多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。一個(gè)腸隱窩內(nèi)4～6個(gè)干細(xì)胞中只有一個(gè)表現(xiàn)為干細(xì)胞功能，其余的處于靜止?fàn)顟B(tài)，前者可產(chǎn)生多能祖細(xì)胞(亦稱短暫增殖細(xì)胞)，具有很強(qiáng)的增殖和分化能力，它們每 12～16 小時(shí)分裂一次，經(jīng)過(guò) 6 次細(xì)胞分裂，即離開隱窩向絨毛方向遷移，逐步分化成腸道另外四種上皮細(xì)胞，包括吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞和潘氏細(xì)胞，前三種細(xì)胞向腸腔絨毛頂端方向遷移，當(dāng)?shù)竭_(dá)絨毛頂端之后經(jīng)歷凋亡和脫落，起到腸上皮更新修復(fù)的作用[14-16]。本研究顯示，酒精處理組小鼠小腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)大致完整，但與對(duì)照組相比，酒精處理組小鼠絨毛高度明顯縮短、萎縮，提示酒精損傷了腸上皮的更新修復(fù)能力。本研究顯示酒精可以明顯抑制ISC特異性標(biāo)志物L(fēng)gr5的表達(dá)，提示酒精可導(dǎo)致ISC數(shù)量或功能的抑制，與Lu R et al[12]研究結(jié)果一致。酒精抑制ISC后，如何影響腸上皮的更新修復(fù)能力，我們分別檢測(cè)了酒精對(duì)腸上皮細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。BrdU為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶摻入DNA合成，活體注射或加入細(xì)胞培養(yǎng)，再采用抗BrdU單克隆抗體進(jìn)行顯色可顯示增殖細(xì)胞[17, 18]。只有增殖活躍有DNA合成的細(xì)胞才會(huì)摻入BrdU顯色，而腸上皮隱窩是增殖最為活躍的位置。腸上皮細(xì)胞3～4天更新一次，腸隱窩基底部細(xì)胞會(huì)沿著隱窩-絨毛軸向絨毛頂端遷移，直至凋亡脫落，完成腸上皮的更新修復(fù)[19, 20]。給小鼠一次性腹腔注射BrdU后，觀察小腸組織BrdU陽(yáng)性細(xì)胞從腸隱窩向絨毛頂端遷移的過(guò)程，結(jié)果顯示酒精處理組小鼠小腸隱窩基底部BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組小鼠，說(shuō)明酒精抑制腸上皮細(xì)胞的增殖。動(dòng)態(tài)觀察BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的遷移情況發(fā)現(xiàn)，正常小鼠小腸隱窩基底部的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞在第3天即可遷移至絨毛頂端，而酒精處理組小鼠腸上皮細(xì)胞的遷移明顯滯后。以上結(jié)果說(shuō)明酒精通過(guò)抑制ISC功能，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯降低，從而損傷腸上皮的更新修復(fù)能力。