牛麗影 李大婧 劉春泉 宋江峰 劉春菊 陳艷萍 袁建華

摘要：為了明確甜玉米和糯玉米2種鮮食玉米在重要呈味成分游離糖和游離氨基酸含量上的差別，以3個(gè)不同成熟度的蘇玉29普通玉米（C1、C2、C3）為對(duì)照，采用液相色譜技術(shù)對(duì)3個(gè)不同成熟度的晶甜5號(hào)甜玉米（S1、S2、S3）和京甜紫花糯2號(hào)糯玉米（W1、W2、W3）中的3種游離糖和18種游離氨基酸進(jìn)行定量測(cè)定。結(jié)果表明，玉米樣品中的糖主要為蔗糖、葡萄糖和果糖，氨基酸以甜味氨基酸和鮮味氨基酸為主;不同品種及不同發(fā)育程度的玉米樣品中游離糖和游離氨基酸含量均存在顯著差異，并且這些成分含量的變化主要表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系。主成分分析（PCA）提取了3個(gè)主成分（PC），分別解釋總變異量的49.6%、15.2%和12.1%;在主成分得分圖上，3個(gè)玉米品種在PC1上的得分按發(fā)育程度排列，而PC3將S1、S2、S3與W1、W2、W3分為2組。聚類分析結(jié)果顯示，C1與甜玉米更為接近，而C2、C3與糯玉米更為相似。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）可對(duì)S1、S2、S3與W1、W2、W3這2組樣品進(jìn)行識(shí)別，由變量投影重要性VIP值可知，區(qū)分2種鮮食玉米的最重要的2種組分分別為蔗糖和天冬氨酸，說(shuō)明氨基酸在鮮食玉米類型的區(qū)分上也有明顯作用。由結(jié)果可知，多元統(tǒng)計(jì)的方法可更直觀、有效地展示不同鮮食玉米滋味成分的差異，為進(jìn)一步研究鮮食玉米的風(fēng)味特征提供了方向。

關(guān)鍵詞：游離糖;游離氨基酸;鮮食玉米;采收期;偏最小二乘判別分析（PLS-DA）

中圖分類號(hào)：S513.01文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）02-0463-08

Abstract：The content difference of the important taste-related components such as free sugars and free amino acids in sweet corns and waxy corns was investigated， using conventional corn Suyu 29 with three grades of maturity（C1， C2， C3） as control. The contents of three kinds of free sugars and 18 kinds of free amino acids in sweet corn Jingtian-5 （S1， S2， S3） and waxy corn Jingtianzihuanuo-2 （W1， W2， W3） harvested at three developing stages were quantified based on high-performance liquid chromatography （HPLC）. The results showed that the fructose， glucose and sucrose were the major sugars in corn samples， and the amino acids grouped as sweet or umami taste-related composed the highest proportion of amino acid content. There were significant differences of the free sugars and free amino acids contents among the corn samples with different cultivars and different developing stages. Multiple correlation analysis indicated that most of the parameters correlated positively. In the principal component analysis （PCA）， three principal components （PCs） were extracted and explained 49.6%， 15.2% and 12.1% of the total variance， respectively. The figure of principal components score indicated that the scores of three corn varieties in PC1 showed the differences of developing stages， while S1， S2， S3 and W1， W2， W3 could be divided into two groups by PC3. The results of cluster analysis （CA） showed that C1 was close to sweet corn while C2 and C3 were similar with waxy corn. Partial least squares discriminant analysis （PLS-DA） could be used to identify samples such as S1， S2， S3 and W1， W2， W3. The two most important components in fresh-edible corn discrimination were sucrose and aspartic acid （Asp） according to the variable importance in the projection （VIP）， which indicated that amino acid also played an important role in identifying fresh-edible corn types. In conclusion， multivariable statistical method performs relatively more visible and valid results on taste-related components difference of fresh-edible corns， which provides the direction for further research on flavor characteristics of fresh-edible corns.

Key words：free sugars;free amino acids;fresh-edible corn;harvest time;partial least squares discriminant analysis（PLS-DA）

鮮食玉米為未完全成熟的玉米，以甜味和鮮嫩的口感區(qū)別于完熟玉米。基于胚乳中糖及淀粉的差異[1]，鮮食玉米主要分為甜玉米和糯玉米2種類型。鮮食玉米籽粒的發(fā)育程度對(duì)鮮食品質(zhì)的影響很大，主要表現(xiàn)為水分和可溶性糖含量的變化[2-3]，而不同成熟度的鮮食玉米游離氨基酸含量也存在顯著差異[4-5]。氨基酸作為重要的風(fēng)味成分，在食品中的呈味作用被廣泛報(bào)道，可呈現(xiàn)出如甜味、鮮味、苦味等風(fēng)味[6]。近年來(lái)，鮮食玉米的鮮味也引起了研究者的關(guān)注[7]，尤其是在特色鮮食玉米類型——糯玉米的研究中，以氨基酸為代表的鮮味成分與食味品質(zhì)研究成為遺傳育種的一個(gè)新方向[8]。目前，多元統(tǒng)計(jì)方法在樣品差異識(shí)別和特征指標(biāo)提取上顯示出良好的優(yōu)勢(shì)，例如主成分分析（Principal component analysis， PCA）是按照相關(guān)性關(guān)系將原變量數(shù)據(jù)矩陣轉(zhuǎn)換為完全無(wú)關(guān)的新變量矩陣，可以依據(jù)方差貢獻(xiàn)大小選擇主成分而實(shí)現(xiàn)降維，用少量變量來(lái)解釋大部分差異信息[9]。偏最小二乘判別分析法（Partial least squares discriminant analysis， PLS-DA）是一種與主成分回歸相關(guān)的統(tǒng)計(jì)方法，根據(jù)設(shè)定的組別，可在盡可能多地提取自變量信息的基礎(chǔ)上，保證提取成分與因變量間最大的相關(guān)性。PLS-DA模型可計(jì)算得到各變量投影重要性（Variable importance in the projection， VIP）值（閾值>1），從而篩選出標(biāo)志性成分[10-11]。將現(xiàn)代分析技術(shù)得到的大量數(shù)據(jù)與多元統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合，在樣品分類與識(shí)別[10]、標(biāo)志性成分篩選[11]、化學(xué)成分和感官數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)[12]上發(fā)揮了重要作用。

因此，本研究以3個(gè)不同發(fā)育程度的甜玉米、糯玉米為研究對(duì)象，并以普通玉米為對(duì)照，對(duì)鮮食玉米主要的滋味成分游離糖、氨基酸含量采用液相色譜法進(jìn)行分析，對(duì)定量結(jié)果采用PCA、PLS-DA等多元統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析，探討樣品的差異及特征指標(biāo)。旨在為因品種、采收期造成的品質(zhì)差別提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為從游離糖、氨基酸角度來(lái)分析甜玉米、糯玉米的特征及可能的風(fēng)味差異提供研究思路。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

甜玉米（晶甜5號(hào)）、糯玉米（京甜紫花糯2號(hào)）及普通玉米（蘇玉29）采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物科學(xué)基地。3種玉米均分為3個(gè)采收期采摘，晶甜5號(hào)于吐絲后19 d、25 d、34 d采摘，分別記為S1、S2、S3;京甜紫花糯2號(hào)于吐絲后21 d、24 d、27 d采摘，分別記為W1、W2、W3;蘇玉29于吐絲后24 d、32 d、37 d采摘，分別記為C1、C2、C3。玉米樣品的基本信息見(jiàn)表1。

1.2儀器設(shè)備與試劑

JMS-50分體式變速膠體磨，廊坊市廊通機(jī)械有限公司生產(chǎn);SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼蒸汽壓力滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn);分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);HPLC1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent科技有限公司生產(chǎn)），主要包括在線真空脫氣機(jī)、四元梯度洗脫泵、柱溫箱、二級(jí)管陣列檢測(cè)器（Diode array detector，DAD）、示差折光檢測(cè)器（Refractive index detector，RID）。

標(biāo)準(zhǔn)品游離氨基酸、鄰苯二甲醛（OPA）、3-巰基丙酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，分析純考馬斯亮藍(lán)-G250、三氯甲烷、甲醇、硼酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、磷酸均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜級(jí)乙腈、甲醇購(gòu)自美國(guó)天地公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1水分含量的測(cè)定采用 GB 5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》中的105 ℃恒質(zhì)量法[13]測(cè)定水分含量。

1.3.2淀粉含量的測(cè)定采用雙波長(zhǎng)法[14]測(cè)定直鏈淀粉、支鏈淀粉含量，將二者之和計(jì)作總淀粉含量。

1.3.3游離糖含量的測(cè)定將冷凍籽粒用剪刀剪碎后取5.0 g，加入50 ml 80%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，在研缽內(nèi)勻漿后于4 000 r/min離心10 min，沉淀用15 ml 80%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇潤(rùn)洗、離心2次。將上清液合并后用80%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇定容至100 ml，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，用蒸餾水定容至20 ml，10 000 g離心10 min，取上清液待測(cè)。高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定條件參照GB 5009.8-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》[15]中的方法，并略有改動(dòng)。吸取1 ml上清液，加入1 ml乙腈，過(guò)0.45 μm濾膜，供HPLC進(jìn)樣分析。HPLC分析色譜柱為Carbohydrate色譜柱（150.0 mm×4.6 mm， 5 μm），采用示差（RID）檢測(cè)器，流動(dòng)相為乙腈+水（體積比為75∶25），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)器溫度為30 ℃，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μl。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間的比對(duì)及采用外標(biāo)法分別進(jìn)行定性、定量。

1.3.4游離氨基酸含量的測(cè)定采用鄰苯二甲醛衍生法測(cè)定游離氨基酸含量，樣品處理和色譜條件參照文獻(xiàn)[16]。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用JMP 10.0進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukeys 多重比較檢驗(yàn)法研究差異顯著性（P<0.05）和主成分分析，用SIMCA-P 11.5進(jìn)行偏最小二乘判別分析。

2結(jié)果與分析

2.1玉米樣品的水分與淀粉含量

據(jù)報(bào)道，甜玉米在適宜采收期的水分含量一般為68%～73%[17]，糯玉米則要求水分含量為59%～64%[18]，結(jié)合表1中數(shù)據(jù)可知，S2、W2處于鮮食適采期，S1、W1采收偏早，S3、W3水分含量偏低。由表1還可以看出，晶甜5號(hào)中的總淀粉含量顯著低于京甜紫花糯2號(hào)和蘇玉29，以S2為例，其總淀粉含量?jī)H約為W2的1/2，C2的1/3，并且在京甜紫花糯2號(hào)的3個(gè)采收期中均未檢測(cè)到直鏈淀粉，說(shuō)明這3個(gè)品種的淀粉組成均符合甜玉米、糯玉米和常規(guī)玉米的分類特征[19]。

2.2游離糖含量的比較

由圖1A可以看出，晶甜5號(hào)S1、S2、S3中均以蔗糖含量最高，是果糖、葡萄糖含量的2～6倍，與有關(guān)甜玉米的報(bào)道一致[12]。但是，糯玉米與普通玉米卻顯示出與甜玉米不同的糖組成特征。糯玉米京甜紫花糯2號(hào)W2與W3中的葡萄糖、蔗糖含量未表現(xiàn)出顯著差異，普通玉米蘇玉29 C1、C2中，葡萄糖為含量最高的糖。在甜玉米S1中，蔗糖的含量最高，并隨采收期的延遲依次下降，表現(xiàn)為S1>S2>S3，但S1、S2、S3均高于W1、W2、W3和C1、C2、C3。葡萄糖、果糖含量的最高值出現(xiàn)在C1，3個(gè)品種的最低值則出現(xiàn)在采收最晚的樣品中，并且S3≈W3≈C3。在關(guān)于鮮食玉米游離糖的報(bào)道中，糯玉米的數(shù)據(jù)較少，在Gong等[20]的研究中，采用分光光度法測(cè)定糯玉米的轉(zhuǎn)化糖、蔗糖含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化糖含量是蔗糖含量的2倍，與本研究結(jié)果一致。

通過(guò)對(duì)圖1B中的總糖含量進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，3種玉米的總糖含量均隨采收期的延遲而顯著下降，下降幅度最小的為晶甜5號(hào)，S3的總糖含量為S1的60.8%，下降幅度最大的為蘇玉29，C3的總糖含量為C1的35.9%，糯玉米總糖含量的變化居中。以總糖含量最高的第1個(gè)采收期為例，S1>C1>W1，晶甜5號(hào)總糖含量顯著高于其他2個(gè)品種，達(dá)到糯玉米或普通玉米的1.8～2.6倍。

2.3游離氨基酸含量的比較

表2列出了18種氨基酸[包括天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、絲氨酸（Ser）、谷氨酰胺（Gln）、組氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）以及γ-氨基丁酸（GABA）]的定量比較結(jié)果?？梢钥闯觯煌贩N和不同采收期的游離氨基酸組成均表現(xiàn)出顯著差異。3個(gè)采收期的甜玉米中含量最高的氨基酸均為Ala，其次為Glu和Asp;糯玉米則與甜玉米不同，Ala、Asp與Glu這3種氨基酸的含量接近;普通玉米C1和C2中，Ala含量最高，但在C3中，其含量下降，與Asp相當(dāng)。Ala為甜味氨基酸，其他甜味氨基酸還有Gly、Ser、Thr，而鮮味氨基酸則主要為Asp與Glu，另外還有苦味氨基酸，包括His、Phe、Ile、Leu。將檢測(cè)出的不同呈味氨基酸進(jìn)行分組，可以看出，甜玉米S1、S2、S3以甜味氨基酸為主，分別占總氨基酸含量的56.04%、45.98%、39.32%，其次為鮮味氨基酸，分別占總氨基酸含量的23.09%、24.42%、34.12%;而糯玉米W1、W2、W3中甜味氨基酸和鮮味氨基酸的含量接近，分別為4.82～5.15 mg/g和4.86～5.29 mg/g，分別占總氨基酸含量的33.43%～36.92%和34.42%～36.69%;普通玉米C1、C2、C3中甜味氨基酸含量則介于甜玉米和糯玉米之間。甜玉米S1中甜味氨基酸的含量顯著高于其他樣品，所有玉米品種中的鮮味氨基酸含量表現(xiàn)為S1≈W1≈W2≈W3≥S2≈S3≈C1≥C2≈C3，甜玉米中鮮味氨基酸含量最高的S1與糯玉米W1、W2、W3間并未表現(xiàn)出顯著差異。在所有樣品中，苦味氨基酸含量占總氨基酸含量的6.24%～14.22%，含量較低。

2.4游離糖和氨基酸含量的相關(guān)性分析

對(duì)游離糖含量與游離氨基酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析，聚類相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢钥闯?，各指標(biāo)間主要表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系（紅色），負(fù)相關(guān)關(guān)系主要體現(xiàn)在Ile與12個(gè)指標(biāo)間，但經(jīng)分析均未達(dá)到顯著水平。進(jìn)一步分析可知，葡萄糖與果糖的相關(guān)性極顯著（P<0.01），Ala與蔗糖、Glu、Ser、Gln、Gly、Thr顯著相關(guān)（P<0.05），GABA與Ser的相關(guān)性極顯著（P<0.01），并與Gln、Gly、Arg顯著相關(guān)（P<0.05），Tyr與果糖、葡萄糖、Gly、Ala顯著相關(guān)（P<0.05），Val與Gly、Thr、Ala、Tyr顯著相關(guān)（P<0.05），Met與Glu、Ser、Gln、Gly、Thr、Ala、GABA顯著相關(guān)（P<0.05），Phe與His、Gly、Tyr顯著相關(guān)（P<0.05），Leu與果糖、Ser、Gly、Thr、Ala、GABA、Tyr、Val、Met的相關(guān)性顯著（P<0.05），Lys與Asp的相關(guān)性顯著（P<0.05）。

玉米籽粒中的葡萄糖、果糖均來(lái)自光合作用，也是淀粉合成的前體物質(zhì)，這2種糖含量之間的極顯著相關(guān)性可能反映了在不同玉米中二者消長(zhǎng)關(guān)系的一致性。Ala為所有玉米樣品中含量最高的甜味氨基酸，其含量與蔗糖和其他3種甜味氨基酸（Ser、Gly、Thr）及主要的鮮味氨基酸Glu均表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，可能說(shuō)明鮮食玉米中甜味、鮮味2種風(fēng)味強(qiáng)度具有同步性。

本研究選取了3個(gè)主成分，主成分1（PC1）提取了總變異量的49.6%，主成分2（PC2）和主成分3（PC3）分別提取了總變異量的15.2%和12.1%。表3列出了本研究測(cè)定的21個(gè)指標(biāo)在3個(gè)主成分上的載荷，其中有16個(gè)指標(biāo)在主成分1上的載荷最高，包括3種糖及Glu、Ala這些主要呈味成分，并且載荷均為正。從圖3可以看出，每種玉米在PC1上的得分均隨著發(fā)育期的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明PC1主要體現(xiàn)了玉米樣品發(fā)育程度的差異。在PC2上，載荷絕對(duì)值最高的指標(biāo)只有3個(gè)，分別為His、Phe和Ile。另外，在PC2上C2的得分最高，W3的得分最低。His、Phe和Ile這3個(gè)氨基酸均為苦味氨基酸，在植物的次生代謝和抗逆機(jī)制中具有重要作用[21]，上述結(jié)果說(shuō)明PC2可能體現(xiàn)了與發(fā)育程度有關(guān)的不同玉米樣品次生代謝的差異。在PC3上，載荷絕對(duì)值最高的為Asp、Asn，Asp是氨基酸代謝和糖代謝連接的紐帶，在PC3得分上則表現(xiàn)為W1最高、S1最低，并且3個(gè)糯玉米樣品的得分均為正值，而3個(gè)甜玉米樣品的得分均為負(fù)值，由此推測(cè)甜玉米與糯玉米之間的差別可能與Asp代謝相關(guān)。Asp可由Asn經(jīng)轉(zhuǎn)氨基作用產(chǎn)生[22]，Asn在PC3上的載荷為負(fù)值，但絕對(duì)值最高，說(shuō)明Asp與Asn之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng)可能是甜玉米和糯玉米之間產(chǎn)生差別的原因之一。

采用平均數(shù)聚類法對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，由圖4可以看出，C1與3個(gè)甜玉米樣品聚為一類，其他樣品聚為一類，說(shuō)明從游離糖和游離氨基酸角度分析，較早發(fā)育期的普通玉米與甜玉米更為接近，較晚發(fā)育期的普通玉米則與糯玉米更為接近。

偏最小二乘法是一種集主成分分析、典型相關(guān)分析和多元回歸分析的基本功能于一體的多元統(tǒng)計(jì)方法[23]，在分析過(guò)程中可以根據(jù)設(shè)定的組別進(jìn)行計(jì)算，消除眾多信息中相互重疊的部分，提取出特征因子[11]。通過(guò)設(shè)定甜玉米與糯玉米組別進(jìn)行判別分析，得到PLS-DA得分（圖5），可見(jiàn)2種玉米品種區(qū)分度良好、無(wú)重疊，此外，回歸曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.379 433、0.341 225，樣品辨別率為95%，說(shuō)明模型擬合得較好，具有較高的可靠性。由表4可以看出，蔗糖是最重要的分類成分，其次為Asp，另外His、Ala和Tyr也是對(duì)2種鮮食玉米品種分類較重要的3種氨基酸;其他VIP值大于1的成分還有Gly、Ile和Asn。可以看出，鮮味氨基酸Asp是區(qū)分2種鮮食玉米的重要指標(biāo)，該結(jié)果與主成分分析、PLS-DA分析結(jié)果表現(xiàn)一致。

3結(jié)論

蔗糖、果糖和葡萄糖是鮮食玉米中主要的游離糖，甜味氨基酸和鮮味氨基酸則是鮮食玉米中含量最豐富的2類氨基酸，不同發(fā)育程度和品種都會(huì)影響鮮食玉米中游離糖和氨基酸的含量。在本研究中的3個(gè)采收期內(nèi)，3種玉米品種的總游離糖和總游離氨基酸含量均隨采收期的延后而降低。多種游離糖和游離氨基酸之間存在顯著的相關(guān)關(guān)系，且大多數(shù)表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系。主成分分析結(jié)果表明，發(fā)育程度對(duì)鮮食玉米游離糖和游離氨基酸含量的影響最大，體現(xiàn)為3個(gè)品種在PC1上的得分均按發(fā)育程度排列。聚類分析結(jié)果顯示，普通玉米C2、C3與糯玉米更接近，C1則與甜玉米更接近。用PLS-DA法提取表征甜玉米和糯玉米差異的重要性因子發(fā)現(xiàn)，蔗糖是最重要的分類成分，其次為鮮味氨基酸Asp。VIP值大于1的成分中有7個(gè)氨基酸。研究結(jié)果充分說(shuō)明，基于游離糖和游離氨基酸含量的變化，多元統(tǒng)計(jì)的方法在鮮食玉米差異性評(píng)價(jià)與特征指標(biāo)的提取方面是可行的。

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（責(zé)任編輯：徐艷）