張 宇，張 繼，榮 濤，歐克緯，黃國(guó)弟，宋紅霞

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

杧果(MangiferaindicaL.)是熱帶亞熱帶以及干熱河谷地區(qū)主要栽培果樹(shù)[1-4]。隨著國(guó)內(nèi)生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)杧果品質(zhì)的要求也不斷提升，杧果新品種選育顯得尤為重要[5-7]。以植物分子生物技術(shù)進(jìn)行杧果遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒定可為新品種選育提供參考依據(jù)。目前，RAPD[8]、ISSR[2，4，9-10]、SRAP[11-12]和AFLP[13]等傳統(tǒng)分子標(biāo)記成功用于杧果種質(zhì)鑒定、親本選配以及遺傳親緣距離分析等。但這些標(biāo)記隨機(jī)性太強(qiáng)，往往偏離目標(biāo)性狀基因。帶有目標(biāo)性的分子標(biāo)記技術(shù)成為當(dāng)下分子標(biāo)記應(yīng)用的熱點(diǎn)[14]。

保守DNA衍生多態(tài)性(conserved DNA-derived polymorphism，CDDP)分子標(biāo)記的誕生豐富了目標(biāo)性分子標(biāo)記的選擇范圍，其原理是依據(jù)植物中基因家族或功能基因中保守堿基序列設(shè)計(jì)單引物，實(shí)現(xiàn)快捷鑒定植物種內(nèi)、種間的分子標(biāo)記手段。通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的堿基序列很有可能是基因的一部分或與基因緊密連鎖，標(biāo)記呈顯性，具有豐富的多態(tài)性，可用瓊脂糖凝膠電泳分離，擴(kuò)增條帶多，穩(wěn)定性好。與ISSR等隨機(jī)分子標(biāo)記相比，CDDP分子標(biāo)記目標(biāo)性更強(qiáng)，且具有操作易、成本低、精準(zhǔn)高等優(yōu)勢(shì)。采用CDDP分子標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系研究以及分子鋪助育種意義深遠(yuǎn)[15-17]，目前尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究以杧果作為研究對(duì)象，利用CDDP標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳親緣關(guān)系分析，為豐富杧果分子輔助育種技術(shù)手段提供借鑒和參考素材。

1 材料與方法

1.1 材料

31個(gè)杧果品種來(lái)自于廣西亞熱帶作物研究所資源圃(表1)，選取完整無(wú)任何損害的磚紅色嫩葉作為供試材料[3]。供試材料處理保存、DNA提取檢測(cè)參考張宇等[1]的方法。

表1 供試杧果種質(zhì)材料

Table 1 Mango materials used in this study

編號(hào)No.品種Variety原產(chǎn)地Source編號(hào)No.品種Variety原產(chǎn)地Source編號(hào)No.品種Variety原產(chǎn)地Source1粵西1號(hào)Yuexi No.1中國(guó)廣東Guangdong, China12緬甸球芒Miandianqiumang緬甸Burma22海頓Haidun美國(guó)America2金穗芒Jinsuimang中國(guó)廣西Guangxi, China13椰香Yexiang印度India23湯米Tangmi美國(guó)America3白象牙Baixiangya泰國(guó)Thailand14紫花芒Zihuamang中國(guó)廣西Guangxi, China24留香Liuxiang斯里蘭卡Sri Lanka4桂熱71號(hào)Guire No.71中國(guó)廣西Guangxi, China15桂熱芒10號(hào)Guiremang No.10中國(guó)廣西Guangxi, China25吉爾Jier美國(guó)America5沅江象牙Yuanjiangxiangya中國(guó)云南Yunnan, China16桂熱芒120號(hào)Guiremang No.120中國(guó)廣西Guangxi, China26生食芒Shengshimang泰國(guó)Thailand6四季芒Sijimang泰國(guó)Thailand17玉文Yuwen臺(tái)灣Taiwan27呂宋芒Lvsongmang菲律賓Philippines7三年芒Sannianmang中國(guó)云南Yunnan, China18愛(ài)文Aiwen美國(guó)America28金白花Jinbaihua泰國(guó)Thailand8鷹嘴芒Yingzuimang印度尼西亞Indonesia19凱特芒Kaitemang美國(guó)America29龍眼香芒Longyanxiangmang中國(guó)四川Sichuan, China9桂香芒Guixiangmang中國(guó)廣西Guangxi, China20金煌芒Jinhuangmang臺(tái)灣Taiwan30R2E2澳大利亞Australia10秋芒Qiumang印度India21貴妃芒Guifeimang臺(tái)灣Taiwan31馬切蘇Maqiesu緬甸Burma11串芒Chuanmang中國(guó)廣西Guangxi, China

1.2 杧果CDDP-PCR擴(kuò)增與檢測(cè)

參考已公布的21條通用型CDDP引物，篩選擴(kuò)增效果較好的若干條引物用于杧果CDDP-PCR擴(kuò)增[18]。引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序和PCR體系各組分濃度參考張宇等[3]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

計(jì)算擴(kuò)增條帶(number of bands，N)、多態(tài)性條帶(number of polymorphic bands，NPB)、多態(tài)性條帶比率(polymorphism rate，PPB)、等位基因數(shù)(average allele number，Na)、有效等位基因數(shù)(effective allele number，Ne)、Nei’s基因多樣度(Nei’s gene diversity，H)和Shannon信息指數(shù)(Shannon information index，I)等遺傳多樣性指標(biāo)；聚類(lèi)分析參考李永濤等[19]的方法；主成分分析和PCA圖構(gòu)建參考陳宗游等[20]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 杧果CDDP-PCR引物選擇及擴(kuò)增

目前已經(jīng)公布的21條CDDP引物均可用于杧果CDDP-PCR擴(kuò)增，遵循節(jié)約高效原則選出8條引物(表2)對(duì)31個(gè)杧果品種進(jìn)行擴(kuò)增。8條引物共擴(kuò)增出條帶(N)107條，平均條帶13條。其中多態(tài)性條帶(NPB)100條，平均條帶12條。多態(tài)性條帶比率(PPB)在84.62%～100%，平均為93.57%，除MADS-3引物外，其他引物擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性條帶比率均≥91.67%，ERF1引物效率最高。每個(gè)位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)(Na)為1.847 1，每個(gè)位點(diǎn)的平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.636 8，Nei’s平均基因多樣性(H)為0.410 8，Shannon平均信息指數(shù)(I)為0.84。

以MYB1引物為例，對(duì)31個(gè)杧果品種進(jìn)行CDDP擴(kuò)增分析，其擴(kuò)增條帶整潔、清晰、層次分明、差異性豐富(圖1)。擴(kuò)增條帶多數(shù)集中在500～2 000 bp，多態(tài)性條帶比率高達(dá)93.33%。

2.2 聚類(lèi)分析

利用UPGMA軟件對(duì)31個(gè)供試杧果品種進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖2)，在遺傳相似系數(shù)0.690 6處，供試杧果品種被分為7大類(lèi)，Ⅰ類(lèi)群包括粵西1號(hào)、金穗芒、白象牙、桂熱71號(hào)、沅江象牙、四季芒和三年芒，分別來(lái)自中國(guó)廣西、廣東、云南和泰國(guó)，遺傳相似系數(shù)為0.793 6～0.904 8；Ⅱ類(lèi)群包括鷹嘴芒、桂香芒、秋芒、串芒、緬甸球芒和椰香芒，分別來(lái)自印度尼西亞、中國(guó)廣西、緬甸和印度，遺傳相似系數(shù)為0.733 3～0.890 4；Ⅲ類(lèi)群包括紫花芒、桂熱芒10號(hào)和桂熱芒120號(hào)，全部來(lái)自中國(guó)廣西，遺傳相似系數(shù)為0.872 8～0.906 4；Ⅳ類(lèi)群包括玉文、愛(ài)文、凱特芒、金煌芒、貴妃芒、海頓、湯米、留香和吉爾，分別來(lái)自美國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣和斯里蘭卡，遺傳相似系數(shù)為0.704 8～0.890 3；Ⅴ類(lèi)只有生食芒和呂宋芒，在遺傳相似系數(shù)為0.871 2處可區(qū)分，生食芒來(lái)自泰國(guó)，呂宋芒來(lái)自菲律賓；Ⅵ類(lèi)包括金白花、龍眼香芒和R2E2，分別來(lái)自泰國(guó)、中國(guó)四川和澳大利亞，遺傳相似系數(shù)為0.765 6～0.834 4；Ⅶ類(lèi)只有馬切蘇。由聚類(lèi)樹(shù)狀圖分析可知：31個(gè)杧果品種間遺傳信息豐富，種間具有較高的遺傳差異，說(shuō)明CDDP分子標(biāo)記可為杧果品種的親緣關(guān)系研究提供較多的數(shù)據(jù)量。但CDDP標(biāo)記不能將來(lái)源地一致的杧果品種聚類(lèi)在一起，表明杧果有可能存在較為復(fù)雜的遺傳親緣關(guān)系，而地理隔離較弱。

表2 八條引物擴(kuò)增的CDDP條帶結(jié)果

Table 2 Amplification bands with eight of CDDP primer

引物名稱(chēng)PrimerNNPBPPB/%NaNeHIWRKY-F1161593.751.89401.65200.43530.86MYB1151493.331.88161.64230.42560.85MYB2131292.31184231.63250.40550.81ERF113131001.86251.65250.41650.88ERF3141392.861.87501.66290.42400.89MADS-111111001.79901.59500.38500.80MADS-2121191.671.80021.62330.39600.82MADS-3131184.621.82251.63350.39820.83平均Average131293.571.84711.63680.41080.84總計(jì)Total107100

M，DL2000 DNA marker。圖1 MYB1引物的杧果CDDP-PCR擴(kuò)增圖Fig.1 Mango CDDP-PCR amplification of MYB1 primer

2.3 主成分分析

基于CDDP標(biāo)記對(duì)31個(gè)杧果品種繪制主成分分析二維PCA圖(圖3)。PCA圖中杧果品種位置分布的聚散、遠(yuǎn)近代表品種之間的親緣關(guān)系，與聚類(lèi)分析結(jié)果對(duì)比，其親緣關(guān)系基本一致，但也有不同。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，粵西1號(hào)、金穗芒、白象牙、桂熱71號(hào)、沅江象牙、四季芒和三年芒聚類(lèi)在一組，但PCA圖結(jié)果顯示，四季芒與其他6個(gè)杧果品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，該組中四季芒原產(chǎn)地為泰國(guó)，聚類(lèi)分析不能較好地區(qū)分出杧果品種間地理隔離的差異，但主成分分析可以將部分存在地理隔離的杧果品種區(qū)分開(kāi)來(lái)；聚類(lèi)分析可將鷹嘴芒、桂香芒、秋芒、串芒、緬甸球芒和椰香聚為一類(lèi)，但主成分分析結(jié)果顯示，椰香與愛(ài)文、

材料編號(hào)對(duì)應(yīng)的具體材料名稱(chēng)見(jiàn)表1。下同。Material number was the same as that shown in Table 1. The same as below.圖2 三十一個(gè)杧果品種聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig.2 Cluster analysis tree of 31 mango varieties

圖3 三十一個(gè)杧果品種主成分分析Fig.3 Principal component analysis of 31 mango varieties

凱特親緣關(guān)系更近，有可能是不同的親緣關(guān)系分析軟件和方法側(cè)重考量的信息分析數(shù)據(jù)不一樣導(dǎo)致分析結(jié)果有差異。聚類(lèi)分析不能將來(lái)源地一致的杧果品種聚類(lèi)在一起，但主成分分析卻能將來(lái)源地一致的部分品種區(qū)分開(kāi)來(lái)，表明主成分分析可以更直觀(guān)地體現(xiàn)杧果品種間的遠(yuǎn)近，既可以體現(xiàn)聚類(lèi)分析類(lèi)別內(nèi)的緊密親緣關(guān)系，也可以體現(xiàn)類(lèi)別間親緣關(guān)系的疏離程度。

3 討論與結(jié)論

杧果的遺傳多樣性是新品種推陳出新的不竭動(dòng)力[21]。CDDP為一種新型高效分子標(biāo)記技術(shù)，可以獲得豐富的遺傳信息反映物種間的親緣關(guān)系[22-23]。本實(shí)驗(yàn)利用8條CDDP通用引物，在31個(gè)杧果品種上可以得到多態(tài)性豐富，層次分明的電泳圖譜，如圖1所示，表明CDDP技術(shù)可重復(fù)、高效地對(duì)不同杧果品種進(jìn)行遺傳分析。8條引物共擴(kuò)增出107條帶，其中多態(tài)性條帶100條，平均多態(tài)性比率(PPB)為93.57%，多態(tài)性豐富，每個(gè)位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性(H)、Shannon信息指數(shù)(I)分別為1.847 1、1.636 8、0.410 8、0.84，說(shuō)明杧果品種間具有較為復(fù)雜豐富的遺傳背景。采用不同的分子標(biāo)記技術(shù)以及供試品種的不同、數(shù)量的不同得出的多態(tài)性也存在差異，這符合杧果高度異花授粉、種子高度雜合且生命周期較長(zhǎng)的特點(diǎn)，具備了較為豐富的遺傳多樣性特性。

對(duì)31個(gè)杧果品種進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析反映出的品種間親緣關(guān)系基本一致，但也有不同。聚類(lèi)分析顯示，在相似系數(shù)0.690 6處，31個(gè)杧果品種可以分成7大類(lèi)。31個(gè)杧果品種相似系數(shù)為0.620 6～0.920 8，說(shuō)明杧果品種間遺傳親緣關(guān)系緊密聯(lián)系，卻又差異多樣豐富。主成分分析較聚類(lèi)分析可更直觀(guān)地反映不同品種間的親緣關(guān)系，但由于分析依據(jù)不同、側(cè)重不同，分析結(jié)果也略有不同。如：采用聚類(lèi)分析方法可以得出粵西1號(hào)、金穗芒、白象牙、桂熱71號(hào)、沅江象牙、四季芒和三年芒具有較近的親緣關(guān)系，但主成分分析方法得出結(jié)果顯示四季芒與其他6個(gè)杧果品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；聚類(lèi)分析可將鷹嘴芒、桂香芒、秋芒、串芒、緬甸球芒和椰香聚為一類(lèi)，但主成分分析結(jié)果顯示，椰香與愛(ài)文、凱特親緣關(guān)系更近。對(duì)比兩種分析方法發(fā)現(xiàn)，聚類(lèi)分析法不能將來(lái)源地一致的杧果品種聚為一類(lèi)，也不能將來(lái)源地不一致的杧果品種區(qū)分開(kāi)來(lái)，主成分分析法可以將來(lái)源地不一致的部分杧果品種區(qū)分開(kāi)來(lái)，但沒(méi)有顯示出來(lái)源地一致的杧果品種親緣關(guān)系較近。這有可能是供試的部分杧果品種帶有鮮明的獨(dú)特遺傳特性，恰好主成分分析側(cè)重的考量依據(jù)可以將這樣的杧果品種劃分出新的親緣關(guān)系。受科研技術(shù)所限，以往涉及物種遺傳多樣性的研究往往只采用聚類(lèi)分析法，如今主成分分析法的大量應(yīng)用為品種鑒別、分子遺傳育種提供了更多的參考依據(jù)，豐富了研究結(jié)果，也更加夯實(shí)了利用分子生物學(xué)服務(wù)農(nóng)業(yè)應(yīng)用的實(shí)踐基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)所選取的供試杧果品種與應(yīng)東山等[24]利用ISSR標(biāo)記進(jìn)行杧果種質(zhì)資源遺傳分析的部分杧果品種一致，通過(guò)聚類(lèi)分析可知CDDP和ISSR標(biāo)記技術(shù)可以得出較為相似的遺傳多樣性分析結(jié)果，印證了CDDP標(biāo)記在杧果種質(zhì)資源鑒定中應(yīng)用的可靠性。但也存在不一致的情況，如四季芒的遺傳情況有所不同，可能是因?yàn)镃DDP和ISSR標(biāo)記技術(shù)的原理不同造成其分析結(jié)果不同。ISSR是隨機(jī)標(biāo)記，引物多，操作簡(jiǎn)單，適合進(jìn)行大批量供試材料的遺傳多樣性分析，但其引物均為隨機(jī)引物，不能錨定目的基因序列，往往帶有很強(qiáng)的隨機(jī)性；而CDDP標(biāo)記雖然其引物不及ISSR標(biāo)記引物數(shù)量多，但其引物設(shè)計(jì)是依據(jù)植物材料中特有的保守序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，而這些保守序列通常存在于一些功能基因以及基因家族中。因此，CDDP標(biāo)記即具有適用于植物材料研究的普遍性，又具有目的功能基因的靶向性。以上研究表明，CDDP適用于杧果遺傳多樣性研究，并且優(yōu)于ISSR等隨機(jī)標(biāo)記，可以矯正隨機(jī)標(biāo)記結(jié)果的盲區(qū)。