嚴(yán)福林，王 波，溫 迪，徐文芬，孫慶文，魏升華

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

小花清風(fēng)藤(Sabiaparviflora)來源于清風(fēng)藤科(Sabiaceae)，主要分布于我國貴州、云南、廣西三省交界地區(qū)[1-2]。小花清風(fēng)藤為貴州苗族、布依族等少數(shù)民族常用藥，莖、葉入藥，具有清熱利濕，利膽，止血，祛風(fēng)止痛等功效，用于治療肝炎、風(fēng)濕痹痛、黃疸濕熱癥，外傷出血等疾病[3-4]?，F(xiàn)代研究表明[5-8]，小花清風(fēng)藤及同屬植物主要含有五環(huán)三萜類、生物堿類、苯衍生物、脂肪酸類和烷烴類等化學(xué)成分，具有顯著的抗乙肝病毒、保肝護(hù)肝、降酶、抗炎鎮(zhèn)痛、抗心律失常等作用，具有廣闊的開發(fā)利用前景。

物種多樣性是由環(huán)境與遺傳共同作用的結(jié)果，受生活史特性、居群環(huán)境、物種進(jìn)化等諸多因素影響，是種質(zhì)資源篩選、育種和可持續(xù)開發(fā)利用的物質(zhì)基礎(chǔ)[9-10]。隨著人類文明與科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，物種多樣性保護(hù)逐漸受到重視，成為了現(xiàn)代研究的熱點?；蚬こ膛c測序技術(shù)的進(jìn)步為動、植物遺傳多樣性的研究帶來了新的思路與機(jī)遇，是一種行之有效的技術(shù)策略[11]。psbA-trnH是來源于葉綠體基因psbA與trnH間的非編碼序列，具有進(jìn)化速率最快、變異位點和信息位點豐富等特點，廣泛應(yīng)用于訶子屬、太子參、何首烏、破布葉等中藥材、民族藥材的物種進(jìn)化分析、分類鑒定與遺傳多樣性等方面的分析研究[12-15]。本研究基于前期基礎(chǔ)，對黔產(chǎn)13個居群小花清風(fēng)藤及同屬外類群簇花清風(fēng)藤S.fasciculate的葉綠體基因psbA-trnH序列結(jié)構(gòu)特征、遺傳變異與進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，為小花清風(fēng)藤藥材DNA條形碼、遺傳多樣性與分子標(biāo)記開發(fā)等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究收集了貴州4個縣區(qū)13個居群小花青風(fēng)藤樣品，采集植株嫩葉，用硅膠快速干燥并低溫保存。樣品對應(yīng)標(biāo)本均由貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定，憑證標(biāo)本存于貴州省生藥重點實驗室。材料信息詳見表1。

1.2 樣品DNA的提取與擴(kuò)增

取硅膠干燥的葉片約20 mg，根據(jù)試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)操作提取樣品總DNA樣本。候選引物psbA-trnH(psbA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′，trnH：5′-CGCGCATGGTGGATTTCACAATCC-3′)。50 μL體系：24 μLTaqPCR MasterMix(2×，含藍(lán)染料)、正反向引物各2 μL，總DNA模板2 μL，ddH2O 20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳中檢測，條帶單一且清晰的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司純化及測序。

表1 試驗材料信息

Table 1 The samples information

種名Species樣品編號No.居群類型Population type采集地點Locality采集時間Time小花清風(fēng)藤S. parvifloraPA_1野生Wild普安縣Puan2015-10-03ZN_1野生Wild鎮(zhèn)寧縣Zhenning2014-10-06ZN_2野生Wild鎮(zhèn)寧縣Zhenning2014-10-06ZN_3野生Wild鎮(zhèn)寧縣Zhenning2014-10-06ZN_4野生Wild鎮(zhèn)寧縣Zhenning2014-10-06ZN_5野生Wild鎮(zhèn)寧縣Zhenning2014-10-06WM_1種植Planting望謨縣Wangmo2016-11-07WM_2種植Planting望謨縣Wangmo2016-11-07WM_3野生Wild望謨縣Wangmo2016-11-07WM_4野生Wild望謨縣Wangmo2016-11-07WM_5野生Wild望謨縣Wangmo2016-11-07XY_1野生Wild興義市Xingyi2014-10-15XY_2種植Planting興義市Xingyi2014-10-15簇花清風(fēng)藤DS_1野生Wild獨山縣Dushan2015-08-03S. fasciculata(Out group)DS_2野生Wild獨山縣Dushan2015-08-03

1.3 數(shù)據(jù)分析

測序峰圖使用Codon Code Aligner v. 8.0.2軟件(http://www.codoncode.com/)進(jìn)行校對拼接，去除引物區(qū)和低質(zhì)量序列。采用MEGA v. 7.0[16]軟件進(jìn)行多序列比對分析，統(tǒng)計各候選序列的堿基組成(GC含量、變異位點、保守位點和信息位點)，基于Kimura 2 Parameter(K-2-P)模型計算居群間遺傳距離，評價各居群間的變異情況；選用最大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)樹。應(yīng)用DnaSP v. 5.10[17]統(tǒng)計群體的單倍型數(shù)量、單倍型多樣性、單倍型多樣性方差、單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差、Tajima’s D值和Fu and Li’s F檢驗值等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同居群葉綠體基因psbA-trnH序列差異分析

psbA-trnH在13份小花清風(fēng)藤樣品中的擴(kuò)增成功率和測序成功率均為100%。通過對黔產(chǎn)4個縣13個產(chǎn)地小花青風(fēng)藤的葉綠體基因psbA-trnH比較研究發(fā)現(xiàn)，黔產(chǎn)小花青風(fēng)藤psbA-trnH序列長度為469～488 bp，GC含量為31.8%～33.0%；當(dāng)空位(gap)作為缺失處理時，13個居群序列檢測到保守位點422個，核苷酸變異(多態(tài)性)位點數(shù)共37個，其中簡約信息位點14個，自裔位點23個，插入/缺失片段3個，插入/缺失位點分別位于3、69、198 bp處，CpG、TpG (CpA)和TpA頻率為22.2%(102/460)，二倍簡并位點96個，四倍簡并位點44個(表2)。

2.2 遺傳距離分析

小花清風(fēng)藤psbA-trnH序列遺傳距離較大，13個小花清風(fēng)藤居群間的遺傳距離變化范圍為0～0.085 9，普安居群(PA_1)與鎮(zhèn)寧5號居群(ZN_5)遺傳距離最大，為0.085 9，平均遺傳距離為0.025 3。在同縣區(qū)，望謨(WM)縣所有居群的遺傳距離為0，興義(XY)、鎮(zhèn)寧(ZN)地區(qū)居群除ZN_5外，其余居群遺傳距離為0(表3)。

2.3 倍型多態(tài)性分析和中性檢驗分析

單倍型多樣性分析結(jié)果表明，13個小花清風(fēng)藤居群的序列共產(chǎn)生多態(tài)(分離)位點數(shù)S為37，突變總數(shù)(Eta)為38，單倍型數(shù)(h)為4個，單倍型(基因)多樣性(Hd)為0.679，核苷酸多樣性(Pi)為0.024 55，單倍型多樣性方差(Vh)值0.00 784、單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差(Sh)值0.089。

表2 小花清風(fēng)藤psbA-trnH變異位點分布情況

Table 2 Distribution of variable sites inS.parviflorapsbA-trnHsequence

“—”表示樣品在該部分堿基缺失；“.”表示與第一行樣品的堿基一致。

“—” represented the base deletion at this site; “.” represented the same base as that of PA_1 in the first row.

表3 不同居群小花清風(fēng)藤遺傳距離

Table 3 Genetic distance ofS.parviflorain different populations

中性檢驗表明，psbA-trnH序列的Fu and Li’s D*檢驗統(tǒng)計量為-1.314 44，無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.10；Fu and Li’s F*檢驗統(tǒng)計量為-1.214 80，無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.10；Tajima’s D值為-0.372 06，無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.10，符合中性進(jìn)化模式，表明從物種水平上小花清風(fēng)藤的psbA-trnH序列進(jìn)化模式符合中性進(jìn)化的假設(shè)。

2.4 小花清風(fēng)藤種質(zhì)資源的聚類分析

應(yīng)用最大似然法(maximum likelihood，ML)對貴州產(chǎn)13個居群小花清風(fēng)藤及同屬外類群簇花清風(fēng)藤進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，外類群簇花清風(fēng)藤與小花清風(fēng)藤在100%支持率下一開始就分為兩支，可見psbA-trnH序列易于將小花清風(fēng)藤與外類群區(qū)分。貴州4個縣區(qū)小花清風(fēng)藤種質(zhì)資源可分為2類：Ⅰ類，普安(PA)與望謨(WM)居群在支持率為100%上聚為一支，但二者又在99%支持率下分開，望謨(WM)居群的栽培與野生資源均能歸為一類，普安(PA)居群單列；Ⅱ類，除鎮(zhèn)寧5號居群(ZN_5)外，興義(XY)與鎮(zhèn)寧(ZN)居群在支持率為100%上聚為一支，歸為一類(圖1)。

圖1 不同居群小花清風(fēng)藤psbA-trnH序列ML樹Fig.1 ML tree of psbA-trnH sequence of S. parviflora in different populations

3 討論

植物的遺傳多樣性受其生活史特性、繁育方式、種子或花粉的傳播能力、地理分布、居群生境、物種的進(jìn)化地位等很多因素的影響。本研究收集了貴州4個縣區(qū)13個產(chǎn)地(居群)的小花清風(fēng)藤樣品，基本涵蓋小花清風(fēng)藤在貴州的自然分布區(qū)域與生境，基于葉綠體基因psbA-trnH序列測序，并進(jìn)行遺傳特性分析，測定并獲得了13條葉綠體基因psbA-trnH序列，長度為469～488 bp，保守位點422個，多態(tài)性位點數(shù)共37個，可見黔產(chǎn)小花清風(fēng)藤psbA-trnH序列變異較小，遺傳較為保守；13個小花清風(fēng)藤居群間的遺傳距離變化范圍為0～0.085 9，平均遺傳距離為0.025 3，總體上看，雖不同縣區(qū)小花清風(fēng)藤psbA-trnH序列遺傳距離較大，但同一區(qū)域(縣域)或地理分布較近的居群間遺傳距離較小，說明地理隔離與生長環(huán)境的差異導(dǎo)致了小花清風(fēng)藤的遺傳分化。

13個小花清風(fēng)藤居群的序列共產(chǎn)生突變總數(shù)(Eta)為38，單倍型4個，單倍型(基因)多樣性(Hd)為0.679；中性檢驗表明，psbA-trnH序列的Fu and Li’s D*檢驗、Fu and Li’s F*檢驗、Tajima’s D檢驗中，P值均大于0.10，無統(tǒng)計學(xué)意義，這與遺傳距離分析結(jié)果吻合。結(jié)果表明，物種水平上小花清風(fēng)藤的psbA-trnH序列進(jìn)化模式符合中性進(jìn)化的假設(shè)，黔產(chǎn)小花清風(fēng)藤種質(zhì)資源的遺傳多樣性較為豐富，這可能與小花清風(fēng)藤地理分布、生境條件、分布海拔、經(jīng)緯度等因素有關(guān)。

小花清風(fēng)藤及同屬外類群簇花清風(fēng)藤聚類分析發(fā)現(xiàn)，外類群與小花清風(fēng)藤在100%支持率下分為兩支，易于區(qū)分。因此，psbA-trnH序列可作為苗藥小花清風(fēng)藤藥材的DNA條形碼，用于其混偽品的鑒定。但栽培與野生居群遺傳未出現(xiàn)明顯的遺傳分化，不能鑒別藥材來源于栽培或野生。同時提示，苗藥小花清風(fēng)藤的栽培起步較晚，而且多為地方性近距離野生引種，人工馴化程度較低，這與實地調(diào)查結(jié)果基本一致，目前在貴州僅有興義市頂效開發(fā)區(qū)、望謨縣有小花清風(fēng)藤的零星栽培居群，面積較小，尚未發(fā)現(xiàn)大規(guī)模的引種馴化與品種選育等工作。不同居群葉綠體基因psbA-trnH序列差異與遺傳距離分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)寧5號居群(ZN_5)與其余居群比較變異位點差異、遺傳距離均最大導(dǎo)致ZN_5未能與其余居群樣品聚類，單列一支，這可能是因采樣居群與其他種類較近，出現(xiàn)雜交后代，物種鑒定錯誤或樣品污染混雜所致。

綜上，通過葉綠體基因psbA-trnH序列對黔產(chǎn)小花清風(fēng)藤種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，不同產(chǎn)地小花清風(fēng)藤存在一定遺傳變異，在進(jìn)化上存在一定的地域性特征，這為小花清風(fēng)藤種質(zhì)資源選擇、藥材的分類鑒定及雜交育種等方面研究提供了參考。