蒲路莎，蘇世博，陳肖韓，趙麗麗，*，陳洪巖，*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163000； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069)

星狀病毒(astrovirus，AstV)是一種無囊膜二十面體RNA病毒，直徑28～30 nm，病毒基因組包含5’端非編碼區(qū)(5′-untranslated region，5′-UTR)、3’端非編碼區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)和3個開放性閱讀框(open reading frames，ORFs)ORF1a、ORF1b、ORF2，其中ORF2負責(zé)編碼病毒必需的衣殼蛋白[1-3]。星狀病毒是導(dǎo)致動物腹瀉的主要病原之一[4]，可感染機體其他組織臟器，導(dǎo)致雛鴨致死性肝炎[5]、雞腎炎[6]、鵝內(nèi)臟痛風(fēng)和哺乳動物腦炎[7]等。2017年1月，我國東南地區(qū)兩家商品鵝養(yǎng)殖基地鵝群暴發(fā)了鵝痛風(fēng)病，3～5周齡家鵝發(fā)病率約為35%，死亡率接近20%[8]。2017年3—12月，在江蘇、安徽、山東和河南多地鵝場都發(fā)生以痛風(fēng)為主要特征的疾病[9]。一種以痛風(fēng)為主要癥狀的鵝源星狀病毒(goose astrovirus，GoAstV)病在我國迅速蔓延，給鵝養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[10]。本研究從實驗室分離的GoAstV HLJ01株(GenBank accession number：MN175321)擴增ORF2基因，對其進行遺傳進化分析，并利用原核表達系統(tǒng)表達GoAstV HLJ-1801株的ORF2基因，制備鼠抗ORF2蛋白多克隆抗體，為進一步建立GoAstV的血清學(xué)檢測方法，做到有效防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

GoAstV HLJ01株由本實驗室分離所得，大腸埃希菌BL21(DE3)菌株、pET-32a載體由本實驗室保存。6～8周齡健康雌性SPF級BALB/c小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。小量DNA膠回收試劑盒、提取質(zhì)粒試劑盒購自O(shè)mega公司，病毒RNA提取試劑盒購自天根公司，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ與BamH Ⅰ購自NEB生物技術(shù)公司，重組克隆試劑盒購自Vazyme公司，HRP標記的山羊抗鼠IgG購自Sigma公司，紅外標記的山羊抗鼠IgG購自LI-COR公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI中Genbank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的GoAstV全基因序列，應(yīng)用Primer Permier軟件設(shè)計GoAstVORF2基因特異性引物。上游引物序列：5′-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCAGACAGGGCGGTG-3′(下劃線處為BamH Ⅰ酶切位點)，下游引物序列：5′-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCACTCATGTCCGCCCTTCT-3′(下劃線處為XhoⅠ酶切位點)，預(yù)期擴增長度2 115 bp。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.2.2ORF2基因的擴增

使用病毒基因組RNA提取試劑盒提取GoAstV HLJ01毒株第3代病毒RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后使用PCR技術(shù)進行ORF2基因擴增。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，72 ℃退火40 s，72 ℃延伸2.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收純化試劑盒回收目的片段。

1.2.3ORF2基因遺傳進化分析

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取的鵝星狀病毒氨基酸序列和本研究中ORF2基因核苷酸序列，利用DNAstar Megalign序列比對程序進行基因序列和氨基酸序列分析，使用MEGA 7.0軟件進行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，參考毒株信息見表1。

1.2.4 重組質(zhì)粒pET32a-ORF2的構(gòu)建

將pET32a進行BamH Ⅰ、XhoⅠ雙酶切，酶切體系為：BamH Ⅰ 1 μL，XhoⅠ 1 μL，pET-32a 10 μL，ddH2O 33 μL，Buffer 5 μL，37 ℃處理5 h，膠回收載體目的片段。同源重組連接體系：pET-32a8.4 μL，cDNA 5.6 μL，5×CE Ⅱ Buffer 4 μL，Exnase Ⅱ 2μL，ddH2O 2 μL，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，搖菌，將陽性質(zhì)粒送往公司測序，并通過質(zhì)粒提取試劑盒獲得陽性質(zhì)粒。將鑒定正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，獲得pET32a-ORF2/BL21(DE3)陽性重組菌。

1.2.5 ORF2蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定

挑取含有pET32a-ORF2重組質(zhì)粒的BL21(DE3)單菌落，接種于含氨芐西林(100 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，待菌液D600達0.6時加入1.0 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達4 h，誘導(dǎo)后菌液經(jīng)超聲波破碎后，4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min，上清和沉淀同時進行SDS-PAGE分析。重組表達蛋白經(jīng)鎳親和層析柱純化并鑒定后，置于-80 ℃保存。采用Western blot分析純化后的蛋白及沉淀，一抗為1∶800稀釋的GoAstV HLJ01株全病毒免疫小鼠陽性血清，二抗為1∶10 000稀釋的紅外標記的山羊抗鼠IgG。

表1 星狀病毒分離株信息

Table 1 Information of the AstVs reference strains

GenBank No.毒株 Strains宿主 Host時間 Year地區(qū) AreaMN175321AstV/Goose/2018/HLJ01鵝 Goose2018黑龍江 HeilongjiangMH807626AstV/Goose/CXZ/18鵝 Goose2018山東 ShandongMG882765AHCZ4鵝 Goose2018安徽 AnhuiMG882764AHCZ2鵝 Goose2018安徽 AnhuiMH052598AstVSDPYGoose/1116/17鵝 Goose2018山東 ShandongMG882766JSCZ4鵝 Goose2018江蘇 JiangsuMF772821AAstV/Goose/CHN/2017/SD01鵝 Goose2017山東 ShandongMG934571GD鵝 Goose2018廣東 GuangdongKY807085HN1G鵝 Goose2017河南 HenanMH410610AHDY鵝 Goose2018安徽 AnhuiMK125058JSHA鵝 Goose2018江蘇 JiangsuNC034567FLX鵝 Goose2016湖南 HunanMH425243Tianjin/2018豬 Porcine2018中國 ChinaJX439643WF1201鴨 Duck2012中國 ChinaMH712856D51鴨 Duck2012中國 ChinaFJ434664C-NGB鴨 Duck2008中國 ChinaFJ919228DA93鴨 Duck2016中國 ChinaFJ919226DA07鴨 Duck2009中國 ChinaFJ919225DA06鴨 Duck2016中國 ChinaMK618656CA-RGDS-1016人 Human2018美國 the United StatesMG930777DIAPD5469-10豬 Porcine2015意大利 ItalyKY320412Avastrovirus 3火雞 Turkey2014瑞典 SwedenKJ621027VRDC/CAstV/SZ/VHINP-1雞 Chicken2012印度 IndiaKJ621033VRDC/CAstV/NZ/VHINP-7雞 Chicken2011印度 IndiaEU143850TAstV/TX/00火雞 Turkey2008美國 the United StatesEU143846TAstV/MI/01火雞 Turkey2008美國 the United StatesEU143844TAstV/CA/00火雞 Turkey2008美國 the United States

1.2.6 大腸埃希菌ORF2蛋白多克隆抗體制備

將純化重組蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1乳化(抗原含量為50 μg)，SPF級BALB/c雌鼠腹腔注射，14 d后使用弗氏不完全佐劑與純化蛋白按1∶1乳化，用同樣的方式進行免疫，21 d后使用弗氏不完全佐劑與純化后蛋白按1∶1乳化，用同樣的方式進行第3次免疫。28 d后采血，置于4 ℃冰箱靜置過夜后收集血清。陰性對照為采用相同方式注射等量的無菌PBS。

1.2.7 多克隆抗體效價檢測及免疫原性鑒定

采用ELISA法，以純化的重組ORF2蛋白作為包被抗原，一抗為ORF2蛋白免疫小鼠血清，二抗為HRP標記的山羊抗鼠IgG，一抗的稀釋梯度分別為1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800，1∶25 600、1∶51 200，TMB顯色后，檢測D450。確定抗體效價后，純化后的ORF2蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印到NC膜上，以1∶500稀釋的ORF2蛋白免疫小鼠陽性血清為一抗，1∶10 000稀釋的紅外標記的山羊抗鼠IgG為二抗，采用Western blot檢測免疫鼠血清的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORF2基因擴增產(chǎn)物

如圖1所示，ORF2基因擴增產(chǎn)物大小為2 115 bp，與已知目的基因大小相同。

M，DL2 000 DNA marker；1，ORF2基因PCR產(chǎn)物；2，陰性對照。M， DL2 000 DNA marker; 1， ORF2 gene PCR product; 2， Negative control.圖1 ORF2基因擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR product of ORF2 gene

2.2 ORF2基因核苷酸與氨基酸序列相似性分析

分離得到的GoAstV HLJ01株與GenBank中35株星狀病毒ORF2基因核苷酸序列的相似性為29.4%～99.2%。同種屬的11株鵝源星狀病毒中，GoAstV HLJ01與AstV/Goose/CXZ/18毒株ORF2基因核苷酸序列相似性最高，為99.3%；GoAstV HLJ01與FLX以及AHDY毒株間ORF2基因核苷酸序列相似性最低，分別為37.8%和38.5%。如圖2所示，HLJ01株與其他11株鵝源星狀病毒的氨基酸序列相似性介于6.8%～99.2%。其中，HLJ01與AstVSDPYGoose/1116/17氨基酸序列的相似性最高，為99.2%；而與FLX氨基酸序列的相似性最低，為6.8%。

123456789101112198.999.099.099.299.098.298.797.67.898.76.8121.099.299.299.399.498.799.397.97.899.36.8230.90.799.999.799.698.499.097.97.899.06.8340.90.70.099.799.698.499.097.97.899.06.8450.70.60.10.199.798.699.298.07.899.26.8560.90.40.30.30.198.799.397.97.899.36.8671.71.11.41.41.31.199.098.27.899.06.8781.10.60.90.90.70.60.997.97.899.66.8892.32.02.02.01.92.01.72.07.897.96.8910845.0845.0845.0845.0845.0845.0845.0845.0845.07.875.410111.10.60.90.90.70.60.90.32.0845.06.811121000.01000.01000.01000.01000.01000.01000.01000.01000.029.21000.012123456789101112

右上數(shù)據(jù)為同源性，%；左下數(shù)據(jù)為差異性，%。1，AstV/Goose/2018/HLJ01；2，AstV/Goose/CXZ/18；3，AHCZ4；4，AHCZ2；5，AstVSDPYGoose/1116/17；6，JSCZ4；7，AAstV/Goose/CHN/2017/SD01；8，GD；9，HN1G；10，AHDY；11，JSHA；12，F(xiàn)LX。

The upper right data is homology， %; the data at the bottom left is the difference， %. 1， AstV/Goose/2018/HLJ01; 2， AstV/Goose/CXZ/18; 3， AHCZ4; 4， AHCZ2; 5， AstVSDPYGoose/1116/17; 6， JSCZ4; 7， AAstV/Goose/CHN/2017/SD01; 8， GD; 9， HN1G; 10， AHDY; 11， JSHA; 12， FLX.

圖2ORF2基因氨基酸序列相似性分析

Fig.2 Similarity analysis of amino acid sequence ofORF2 gene

2.3 HLJ01株與參考毒株ORF2基因的遺傳進化樹分析

以O(shè)RF2基因開放閱讀框內(nèi)的核苷酸序列和氨基酸序列構(gòu)建遺傳進化樹(圖3、圖4)，以豬源星狀病毒4型毒株Tianjin/2018作為外群，所獲得的12株鵝源星狀病毒毒株形成了2個單獨的支系，HLJ01與其中9株毒株(AstV/Goose/CXZ/18、AHCZ4、AHCZ2、AstVSDPYGoose/1116/17、JSCZ4、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01、GD、HN1G、JSHA)處于同一分支，F(xiàn)LX與AHDY處于另一分支，2個分支差異巨大。

2.4 HLJ01與參考毒株ORF2基因氨基酸序列比對

HLJ01株ORF2基因氨基酸序列與位于同一分支的9株鵝源星狀病毒毒株ORF2基因推導(dǎo)的氨基酸序列進行比對(表2)，HLJ01株的ORF2基因氨基酸序列與同源性最接近的AstVSDPYGoose/1116/17相比，兩者在229(P，Q)、456(D，E)、540(Q，L)、594(S，G)、627(H，Q)、695(A，T)位的氨基酸不同，其他位點無變化。HLJ01株與處于不同分支的FLX和AHDY的氨基酸位點具有巨大差異(未列出)。

圖3 HLJ01株ORF2基因核苷酸與參考序列構(gòu)建的遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic relationship of ORF2 gene nucleotide sequence of HLJ01 with difference sequences

2.5 重組表達載體pET32a-ORF2的雙酶切鑒定

將pET32a-ORF2經(jīng)內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ單酶切或雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳，得到符合預(yù)期的條帶(圖5)，測序表明重組質(zhì)粒成功構(gòu)建，堿基并未發(fā)生突變或缺失。

2.6 重組蛋白的SDS-PAGE分析

通過SDS-PAGE分析可知，pET32a-ORF2/BL21重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后，可見分子質(zhì)量約為106 ku的特異性蛋白條帶(圖6)，與DNAStar軟件預(yù)測的理論值相符。目的蛋白主要在菌體沉淀中出現(xiàn)，說明目的蛋白以包涵體形式表達。

2.7 Western Blot鑒定

利用Western Blot對蛋白進行進一步分析，結(jié)果顯示，在硝酸纖維素膜上106 ku左右有一明顯條帶(圖7)，表明重組表達的ORF2蛋白具有良好的抗原性。

圖4 HLJ01株ORF2基因氨基酸與參考序列構(gòu)建的遺傳進化樹Fig.4 Phylogenetic relationship of ORF2 gene amino acid sequence of HLJ01 with difference sequences

2.8 多克隆抗體的制備及檢測

將純化的重組ORF2蛋白免疫組和PBS對照組血清進行1∶400稀釋，2倍倍比稀釋后進行間接ELISA檢測，以P/N≥2.1作為陽性判定標準，結(jié)果顯示其抗體效價達到1∶25 600(圖8)。通過免疫印跡反應(yīng)，ORF2蛋白多克隆抗體與ORF2蛋白產(chǎn)生清晰的條帶(圖9)，表明獲得的ORF2蛋白多克隆抗體具有良好的免疫原性。

3 討論

星狀病毒ORF2基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白，是星狀病毒基因分型的主要依據(jù)[11]，該結(jié)構(gòu)蛋白刺激宿主后可產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)[12-13]，可能對病毒的致病性起一定的作用[14]，其產(chǎn)物衣殼蛋白位于病毒粒子的外表面，能夠形成纖突結(jié)構(gòu)，參與細胞表面相關(guān)受體的識別及機體的免疫應(yīng)答[15-16]。

表2ORF2基因片段氨基酸變異情況

Table 2 Variant amino acides ofORF2 gene

突變位置Mutations position突變氨基酸 Mutated amino acidsHLJ01CXZAHCZ4AHCZ2SDPYJSCZ4GDSD01HN1GJSHA136RRRRRRRRR→KR224TT→ATTT→AT→AT→AT→ATT→A225RRRRRRRR→QR→QR229Q→PQQQQQQQQQ268SSSSSSSSS→AS303VV→AVVVVVVVV324EEEEEEEEEE→D355GGG→AG→AGGGGGG379PPPPPPPP→TP→TP424MMMMMMMM→IM→IM456E→DEEEEEEEEE525TTTTTTTTT→KT540L→QLLLLLLLLL586SS→GSSSSS→NS→NSS→N587NNNNNNNN→DNN590EEEEEEEE→GEE594SSS→GS→NS→GS→NSS→NSS→N610EEEEEEEEEE→G621YYYYYYYYY→FY627Q→HQQQQQQQQQ628TTTTTTT→ITTT634EEEEEEEEE→DE695AAA→TA→TA→TA→TAAAA

M，DNA marker；1，pET32a-ORF2重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；2，pET32a-ORF2重組質(zhì)粒BamH I單酶切產(chǎn)物；3，pET32a-ORF2重組質(zhì)粒Xho I單酶切產(chǎn)物；4，pET32a-ORF2重組質(zhì)粒。M， DNA marker; 1， pET32a-ORF2 recombinant plasmid digested by double enzyme; 2， pET32a-ORF2 recombinant plasmid digested by BamH I; 3， pET32a-ORF2 recombinant plasmid digested by Xho I; 4， pET32a-ORF2 recombinant plasmid.圖5 重組質(zhì)粒pET32a-ORF2酶切鑒定Fig.5 Identification of recombinant plasmid pET32a-ORF2 by enzyme digestion

星狀病毒衣殼蛋白不但是病毒刺激感染機體產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)的主要因素，同樣也是病毒宿主嗜性的主要決定因素[17]。本研究以近期分離獲得的AstV/Goose/2018/HLJ01對ORF2基因進行克隆與測序，并對其推導(dǎo)的氨基酸序列進行對比分析，分析毒株之間的遺傳關(guān)系。研究結(jié)果表明， GoAstV HLJ01與目前已發(fā)表的大部分鵝星狀病毒具有高度同源性，其中與來自山東的AstV/Goose/CXZ/18株的同源性為99.3%，但與來自安徽的AHDY株和湖南的FLX株同源性差異巨大。不同地區(qū)的毒株處于同一分支，說明不同的鵝源星狀病毒并沒有明顯的地域差異，這也可能表明我國東北部地區(qū)發(fā)生的鵝群痛風(fēng)病來源于我國東部的鵝群。通過對氨基酸序列的比較，HLJ01在第229、456、540、627位點出現(xiàn)了Q→P、E→D、L→Q及Q→H的突變，顯示出GoAstV具有高度的遺傳多樣性，但這些變化對GoAstV的影響尚不得知，有待進一步研究。同時，這些差異為GoAstV的基因功能及遺傳特征提供理論依據(jù)。對ORF2基因進行原核表達，構(gòu)建pET32a-ORF2重組質(zhì)粒，經(jīng)誘導(dǎo)表達可見大小約為106 ku的蛋白，主要以包涵體的形式存在。Western blot結(jié)果表明，該蛋白能夠與鼠源抗GoAstV血清發(fā)生特應(yīng)性免疫反應(yīng)，表明ORF2蛋白具良好的特異性和抗原性，證明ORF2蛋白可作為檢測抗原的靶標。目前國內(nèi)外尚未有商品化的鵝源星狀病毒血清學(xué)試劑盒或者疫苗，星狀病毒在鵝群中的暴發(fā)迫切需要建立針對鵝源星狀病毒毒株的血清學(xué)檢測方法以進行鵝源星狀病毒的血清學(xué)流行病學(xué)檢測。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1，未誘導(dǎo)的pET32a-ORF2全菌體；2，誘導(dǎo)后的pET32a-ORF2全菌體；3，誘導(dǎo)后的pET32a-ORF2菌體裂解上清液；4，誘導(dǎo)后的pET32a-ORF2菌體裂解沉淀；5，純化的重組ORF2蛋白。M， Protein marker；1， Total protein of pET32a-ORF2 without induction；2， Total protein of pET32a-ORF2 with induction；3， Supernatant of pET32a-ORF2 after induction；4， Precipitate of pET32a-ORF2 after induction；5， Purified ORF2 protein.圖6 pET32a-ORF2蛋白產(chǎn)物SDS-PAGE電泳Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis analysis of the pET32a-ORF2 protein product

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1，誘導(dǎo)后的pET32a-ORF2菌體裂解沉淀；2，純化的重組ORF2蛋白。M， Protein molecular weight marker；1， Precipitate of pET32a-ORF2 after induction；2， Purified ORF2 protein.圖7 Western-blot鑒定ORF2蛋白的體外表達Fig.7 Western-blot identification of ORF2 protein in vitro expression

圖8 ORF2多克隆抗體效價測定Fig.8 Titer determination of polyclonal antibody against ORF2

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1，純化的重組ORF2蛋白。M， Protein molecular weight marker；1， Purified ORF2 protein.圖9 ORF2多克隆抗體免疫原性測定Fig.9 Immunogenicity of polyclonal antibody against ORF2

綜上所述，本研究首次對黑龍江地區(qū)的GoAstV ORF2蛋白進行序列分析，為GoAstV的流行病學(xué)研究提供了一定的基礎(chǔ)；同時，制備了GoAstV ORF2重組蛋白和多克隆抗體，為GoAstV疫苗的研究提供了方向。