周 游 ，楊臘英 ，汪 軍 ，郭立佳 ，梁昌聰 ，劉 磊 ，黃俊生 *

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101）

芹菜（Apium graveolens L.）富含蛋白質(zhì)、維生素、鈣、磷、鐵等20多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是我國(guó)國(guó)民廣泛食用的蔬菜［1-2］。隨著對(duì)芹菜需求的日益加大，不少學(xué)者通過(guò)提高大量元素供給，施用黃腐酸鉀和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等物質(zhì)，或者利用微生物等手段研究提高芹菜產(chǎn)量的方法［3-6］。

前人研究表明，復(fù)合使用不同類型的微生物比使用單一微生物對(duì)植物的促生和控制植物病害的效果更好，呈現(xiàn)增效作用［7-9］。可能的原因是不同類型的微生物對(duì)植物和對(duì)病原菌的作用方式不同，分泌的作用物質(zhì)也不同［10-11］。有研究表明，不同種類的微生物共同培養(yǎng)后會(huì)加大有益物質(zhì)的分泌，例如Trichoderma asperellum和Bacillus amyloliquefaciens共同培養(yǎng)后會(huì)加大D-天冬氨酸等8種氨基酸的分泌［12］。并且不同種類菌株共同培養(yǎng)時(shí)會(huì)誘導(dǎo)單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)沉默基因的表達(dá)，Schroeckh等發(fā)現(xiàn)，Streptomyces hygroscopicus（現(xiàn)為S.rapamycinicus）和Aspergillus nidulans共培養(yǎng)后，能激活A(yù).nidulans沉默的polyketide synthase（PKS）基因簇表達(dá)［13］。值得注意的是，不同種類菌株共同培養(yǎng)也能誘導(dǎo)產(chǎn)生新的物質(zhì)，Dashti等將 Actinokineospora sp.和Nocardiopsis sp.共同培養(yǎng)后分離出在單獨(dú)存在的情況下不能產(chǎn)生的3種新物質(zhì)［14］。但以往研究多關(guān)注于兩種微生物之間的相互作用結(jié)果，而關(guān)于復(fù)合微生物促進(jìn)植物生長(zhǎng)的協(xié)同增效機(jī)制尚不清楚，且研究報(bào)道極為鮮見(jiàn)。木霉和芽孢桿菌是目前廣泛用來(lái)生產(chǎn)微生物菌肥的菌種。因此，本研究通過(guò)比較綠色木霉和枯草芽孢桿菌在單獨(dú)和混合施用情況下，對(duì)芹菜的防御酶活性和代謝物含量的影響情況來(lái)探明這兩種微生物對(duì)芹菜生長(zhǎng)的協(xié)同增效作用的機(jī)制。這將為微生物的復(fù)合使用提供理論基礎(chǔ)，也為芹菜的高產(chǎn)栽培提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

①枯草芽孢桿菌（BLG010）（專利號(hào)：CN102747020A）由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供，菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.5953。將BLG010接種在LB液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下180 r/min黑暗培養(yǎng)2 d后離心去除LB培養(yǎng)液獲得純孢子體，并用無(wú)菌蒸餾水把孢子稀釋成1.0×107個(gè)/mL濃度的孢子懸浮液。

②綠色木霉（H06）（專利號(hào)：CN102839131A）由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.6229。將H06接種到PDA平板上，在27℃條件下黑暗培養(yǎng)9 d，并刮取孢子用無(wú)菌蒸餾水制成孢子懸浮液（濃度為1.0×107個(gè)/mL）；

1.2 盆栽試驗(yàn)

2018年1月3日將長(zhǎng)至5～6 cm的西芹幼苗移栽至混合有滅菌的菜園土、營(yíng)養(yǎng)土以及椰糠作為栽培基質(zhì)的花盆中，幼苗移栽時(shí)各花盆均施用市購(gòu)復(fù)合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）1∶900倍液500 mL。移栽5 d后按以下4個(gè)處理澆灌芹菜，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含12株芹菜。移栽30 d后收獲芹菜，測(cè)定株高和鮮重。

①蒸餾水處理（CK）：每花盆澆灌300 mL 的無(wú)菌蒸餾水。

②BLG010處理：每花盆澆灌300 mL的BLG010 孢子懸浮液（1.0×107個(gè)/mL）。

③H06處理：每花盆澆灌300 mL 的H06 孢子懸浮液（1.0×107個(gè) /mL）。

④BLG010+H06處理：每花盆澆灌各150 mL的BLG010和H06孢子懸浮液（1.0×107個(gè)/mL）。

1.3 酶活性測(cè)定

分別于處理后10、20 d時(shí)采集4個(gè)處理的距離地面1～5 cm處莖稈用于提取總酶液，每6個(gè)莖稈作為一個(gè)重復(fù)。根據(jù)吳衛(wèi)等的方法獲得含有過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）的總酶液［15］。過(guò)氧化氫酶（CAT）活性利用H2O2測(cè)定［16］；過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定［17］。

1.4 差異代謝物GC-MS分析

分別于處理后10、20 d時(shí)采集4個(gè)處理的距離地面1～5 cm處莖稈用于代謝物檢測(cè)，每6個(gè)莖稈作為一個(gè)重復(fù)。氣質(zhì)聯(lián)用儀型號(hào)為T(mén)hermo TRACE1310/ISQTMQD GC-MS。

①代謝物提取及衍生化：根據(jù)Lisec等的方法提取代謝物，以核糖醇（0.2 mg/mL）作為內(nèi)標(biāo)［18］。利用甲氧基胺基鹽酸鹽吡啶溶液（吡啶含量為20 mg/mL）與N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含1% 三甲基氯硅烷）對(duì)代謝物進(jìn)行衍生化。

②色譜和質(zhì)譜條件：毛細(xì)管色譜柱為T(mén)hermo TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μ m），不分流進(jìn)樣，1.0 mL/min恒流模式。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0℃，維持2 min，然后以5℃/min的速度升至300℃，維持1 min。進(jìn)樣口溫度設(shè)定為 250℃。EI離子源，溫度250℃，電子轟擊電壓為70 eV。質(zhì)譜檢測(cè)范圍為45～600 m/z。每0.2 s掃描一次，溶劑延遲3 min。樣品采用隨機(jī)順序連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣。

③數(shù)據(jù)處理：對(duì)樣品的總離子圖進(jìn)行色譜峰識(shí)別，并與NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鑒定代謝物的種類，使用自動(dòng)積分方法進(jìn)行積分并進(jìn)行手動(dòng)積分校正，對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行的定性和定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)芹菜生長(zhǎng)的影響

由圖1和圖2可見(jiàn)，同時(shí)澆灌枯草芽孢桿菌（BLG010）和綠色木霉（H06）的處理比其它處理長(zhǎng)勢(shì)良好。BLG010+H06處理的株高分別是CK、BLG010、H06處理的1.44、1.13、1.21倍；株重分別是CK、BLG010、H06處理的3.4、1.39、2.07倍，這說(shuō)明BLG010和H06對(duì)芹菜的促生具有協(xié)同增效作用。

圖1 不同處理對(duì)芹菜生長(zhǎng)的影響

圖2 不同處理對(duì)芹菜株高和株重的影響

2.2 不同處理對(duì)芹菜酶活性的影響

經(jīng)過(guò)分析得知，CAT與POD活性在4個(gè)處理間表現(xiàn)出規(guī)律性變化。由圖3和圖4可知，BLG010+H06處理的CAT和POD活性在第10 d和第20 d時(shí)均比其它處理高，CK處理在第10 d和第20 d時(shí)的POD和CAT活性均比其它處理低。

圖3 不同處理對(duì)芹菜CAT活性的影響

圖4 不同處理對(duì)芹菜POD活性的影響

圖5 芹菜代謝物GC-MS總離子流色譜圖

在 第10 d時(shí)，BLG010+H06處 理 的POD活性分別為BLG010和H06處理的1.23和1.36倍；BLG010+H06處理的CAT活性分別為BLG010和H06處理的1.03和1.4倍。

在 第20 d時(shí)，BLG010+H06處 理 的POD活性分別為BLG010和H06處理的1.25和1.22倍；BLG010+H06處理的CAT活性分別為BLG010和H06處理的1.78和1.45倍。

由結(jié)果可知，BLG010和H06均能提高芹菜CAT和POD活性，但是同時(shí)澆灌BLG010和H06比單獨(dú)澆灌BLG010或H06對(duì)芹菜的CAT和POD活性具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)能力，這也說(shuō)明BLG010和H06對(duì)芹菜防御酶活性誘導(dǎo)具有協(xié)同增效作用。

2.3 不同處理對(duì)芹菜代謝物的影響

各處理樣品的GC-MS 總離子流色譜圖峰形較好（圖5），可根據(jù)峰面積計(jì)算代謝物質(zhì)相對(duì)含量和通過(guò)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)確認(rèn)各峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)。由結(jié)果可知，蘋(píng)果酸、甘露醇和蔗糖這3種物質(zhì)相對(duì)含量在不同處理間呈現(xiàn)規(guī)律性的差異。

與CK處理相比，BLG010、H06、BLG010+H06處理的甘露醇含量在第10 d和20 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá)（圖6），處理間的含量大小順序?yàn)椋築LG010+H06＞BLG010＞H06＞CK 處理。

由圖7可知，與CK處理相比，BLG010+H06處理的蘋(píng)果酸含量在第10 d和20 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá)，而B(niǎo)LG010處理、H06處理的蘋(píng)果酸含量在第10 d表達(dá)下調(diào)，但隨后BLG010處理的蘋(píng)果酸含量在第20 d上調(diào)表達(dá)。

圖6 不同處理對(duì)芹菜甘露醇含量的影響

圖7 不同處理對(duì)芹菜蘋(píng)果酸含量的影響

由圖8可知，在第10 d，CK處理的蔗糖含量分別是BLG010、H06、BLG010+H06處理蔗糖含量的5.78、2.33和7.01倍。但是在第20 d時(shí)，BLG010、H06、BLG010+H06處理的蔗糖含量分別是CK處理蔗糖含量的1.98、1.3和7.22倍。

結(jié)果表明，接種枯草芽孢桿菌或綠色木霉均能引起芹菜的蘋(píng)果酸、甘露醇和蔗糖含量變化，而混合接種枯草芽孢桿菌和綠色木霉則能導(dǎo)致這些變化程度加大。

3 結(jié)論與討論

POD和CAT是植物生長(zhǎng)過(guò)程中的重要抗性相關(guān)酶，其活性變化情況是反映植物抗病性的重要生理指標(biāo)［19-20］，眾多學(xué)者利用生防菌接種寄主植物來(lái)提高寄主的CAT和POD活性，由此使寄主獲得誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（Induced systemic resistance，ISR）。因此，測(cè)定枯草芽孢桿菌和綠色木霉在單獨(dú)和混合施用條件下對(duì)芹菜的CAT和POD活性影響，能探明這兩種生防菌對(duì)芹菜的防御酶是否有增效作用，也間接為其它生防菌的復(fù)合使用提供理論支撐。

圖8 不同處理對(duì)芹菜蔗糖含量的影響

本研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌和綠色木霉均能提高芹菜CAT和POD活性，且兩者混合接種芹菜提高這兩種酶的活性更高，呈現(xiàn)增效作用，這可能是兩種生防菌對(duì)芹菜的刺激比單一生防菌的刺激作用強(qiáng)，加強(qiáng)了激活CAT和POD活性的過(guò)程，這和前人的報(bào)道類似［21-22］，他們發(fā)現(xiàn)接種病原菌和芽孢桿菌處理的CAT和POD等抗性相關(guān)酶活性比只單獨(dú)接種病原菌或者生防菌的高。

本研究也發(fā)現(xiàn)，株高最高和株重最重的芹菜處理，其CAT和POD活性也最大，這與呂斌等［23］和趙英等［24］的研究類似，他們發(fā)現(xiàn)POD和SOD等抗性相關(guān)酶的活性與植物的生長(zhǎng)勢(shì)有相關(guān)關(guān)系。因此將來(lái)可以進(jìn)行深入的研究，探清芹菜CAT和POD活性與芹菜株高與株重的相關(guān)關(guān)系，作為預(yù)測(cè)微生物提高芹菜產(chǎn)量能力的檢測(cè)指標(biāo)。

代謝物的變化可視為植物對(duì)外界環(huán)境變化的響應(yīng)，研究植物響應(yīng)外源微生物的代謝組不僅能描述植物的狀態(tài)，也能了解植物與微生物互作的機(jī)制。本文對(duì)4個(gè)處理的芹菜進(jìn)行代謝組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果酸、甘露醇和蔗糖的含量在不同處理間呈現(xiàn)規(guī)律性的差異，這些差異變化是芹菜對(duì)枯草芽孢桿菌和綠色木霉的響應(yīng)。

蘋(píng)果酸是三羧酸（TCA）循環(huán)的中間產(chǎn)物，參與多種代謝反應(yīng)的調(diào)控，能生成蔗糖、丙酮酸、草酰乙酸等物質(zhì)，是一種重要的能量物質(zhì)［25］。本研究中，在兩個(gè)時(shí)間段，BLG010+H06處理的蘋(píng)果酸均比CK處理和其它處理高，這與董鮮等［26］和張風(fēng)革［27］的研究類似，他們發(fā)現(xiàn)植物接種微生物后，其體內(nèi)的蘋(píng)果酸含量上調(diào)。造成這種現(xiàn)象的可能原因是，芽孢桿菌和木霉對(duì)蘋(píng)果酸具有趨化性，蘋(píng)果酸可作為芽孢桿菌和木霉的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源之一，芹菜加大蘋(píng)果酸的分泌能促進(jìn)這兩種微生物在植物根部定殖［27-28］；也有可能是，在兩種生防菌的共同作用下，刺激芹菜上調(diào)蘋(píng)果酸產(chǎn)量進(jìn)而轉(zhuǎn)化為糖類，為芹菜的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量，從而達(dá)到顯著促進(jìn)芹菜生長(zhǎng)的目的。但是，第10 d時(shí)BLG010處理和H06處理、第20 d時(shí)H06處理的蘋(píng)果酸含量均比CK處理低，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，BLG010和H06均能誘導(dǎo)芹菜甘露醇累積，并且兩種生防菌共同處理的芹菜甘露醇相對(duì)含量比單一生防菌處理的高，這和Luo等［29］的研究結(jié)果類似，他們發(fā)現(xiàn)利用菌根真菌接種楊樹(shù)后，甘露醇在楊樹(shù)體內(nèi)累積。甘露醇是植物體內(nèi)重要的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)［30］，微生物與植物作用后會(huì)導(dǎo)致植物的滲透勢(shì)發(fā)生改變［31］，由此推測(cè)，芽孢桿菌和木霉處理芹菜導(dǎo)致其甘露醇累積的原因可能是，芹菜需要調(diào)節(jié)由這兩種微生物造成的滲透壓失衡，故而加大甘露醇的分泌，并且兩種微生物比單一微生物使芹菜累積甘露醇的作用更強(qiáng)，但是甘露醇與芹菜生長(zhǎng)勢(shì)之間的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

蔗糖能分解成果糖和葡萄糖，是植物體內(nèi)重要的能源物質(zhì)也是分子信號(hào)，是源庫(kù)碳水化合物代謝的樞紐，能影響植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)［32-33］。植物根系的蔗糖是木霉的能量來(lái)源，但是木霉獲得足夠的蔗糖后就下調(diào)其自身的蔗糖水解酶活性，以避免其對(duì)寄主蔗糖的過(guò)量吸收而導(dǎo)致寄主組織的破壞［34］。鄒英寧等［35］研究表明，柑橘接種叢枝菌根真菌能提高其株高和葉片數(shù)以及葉片蔗糖含量，經(jīng)分析得知菌根侵染率與葉片蔗糖含量正相關(guān)，他們認(rèn)為葉片產(chǎn)生的蔗糖向根部運(yùn)輸并分解為葡萄糖和果糖供給菌根真菌吸收利用。本研究結(jié)果表明，在第10 d時(shí)，各處理的蔗糖含量表現(xiàn)為CK處理＞BLG010處理＞H06處理＞BLG010+H06處理，在第20 d時(shí)各處理的蔗糖含量出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為BLG010+H06處理＞BLG010處理＞H06處理＞CK，這可能的原因是在枯草芽孢桿菌和綠色木霉定殖根部初期，芹菜產(chǎn)生的蔗糖向下運(yùn)輸給這兩種生防菌使用，導(dǎo)致莖部蔗糖含量變低，當(dāng)它們獲得足夠的蔗糖后產(chǎn)生調(diào)節(jié)信號(hào)給芹菜，芹菜調(diào)節(jié)蔗糖相關(guān)酶的活性，提高體內(nèi)蔗糖含量用于促進(jìn)自身生長(zhǎng)。這與劉春娟等［36］的研究類似，他們發(fā)現(xiàn)大豆葉片的蔗糖含量與大豆的產(chǎn)量正相關(guān)。本研究中，BLG010和H06聯(lián)合接種對(duì)提高芹菜的蔗糖含量呈現(xiàn)出了增效效應(yīng)，這可能是BLG010和H06促進(jìn)芹菜生長(zhǎng)呈現(xiàn)協(xié)同增效現(xiàn)象的原因之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)接種枯草芽孢桿菌（BLG010）和綠色木霉（H06）能促進(jìn)芹菜的生長(zhǎng)，并且同時(shí)接種BLG010和H06比單獨(dú)接種BLG010或H06促進(jìn)芹菜生長(zhǎng)的效果更好。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，芹菜CAT和POD活性、蘋(píng)果酸、甘露醇和蔗糖的含量在不同處理間呈現(xiàn)規(guī)律性的差異，這些差異變化可能是枯草芽孢桿菌和綠色木霉促進(jìn)芹菜生長(zhǎng)呈現(xiàn)協(xié)同增效的原因。這些研究結(jié)果將為生防菌的復(fù)合使用提供新思路，為芹菜的高產(chǎn)栽培提供技術(shù)支撐。