王家旺

摘 要：生物膜是嵌入在細(xì)胞外基質(zhì)中的微生物群落，具有高度組織結(jié)構(gòu)。齲病是多種因素參與的，生物膜中微生物長(zhǎng)時(shí)間在菌斑深層產(chǎn)酸，牙體硬組織發(fā)生慢性、進(jìn)行性破壞而形成的。基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生化特性，增強(qiáng)了生物膜的表面粘附性、空間和化學(xué)非均質(zhì)性、協(xié)同/競(jìng)爭(zhēng)性相互作用以及對(duì)抗菌藥物的耐受性。本文我們討論生物膜基質(zhì)在齲病發(fā)病機(jī)制中的作用的新進(jìn)展。

關(guān)鍵詞： 生物膜;齲病;細(xì)胞外基質(zhì)

齲病是以細(xì)菌微生物為病原體，多種因素參與的，發(fā)生在牙體硬組織的慢性、進(jìn)行性破壞的疾病。通常情況下，致齲性膳食糖緊緊貼附于牙面，使得唾液蛋白形成獲得性膜并牢固地附著于牙面 ;在適宜溫度下，生物膜中微生物長(zhǎng)時(shí)間在菌斑深層產(chǎn)酸，侵襲牙齒，使之脫礦，并進(jìn)而破壞有機(jī)質(zhì)，導(dǎo)致牙齒組織的缺損，乃至整個(gè)牙齒缺失。WHO對(duì) 186個(gè)國(guó)家的人群口腔健康進(jìn)行長(zhǎng)達(dá) 20 年的縱向調(diào)查結(jié)果顯示，齲病仍影響著 60%-90% 的學(xué)齡兒童和大部分成年人，給社會(huì)和個(gè)人帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

目前關(guān)于齲病病因?qū)W的說(shuō)法主要有三種[1]，一是認(rèn)為齲病是由口腔中的某些特異性致齲細(xì)菌所引起; 二是認(rèn)為齲病是由口腔中的一些常駐菌群所導(dǎo)致; 第三種也是目前比較公認(rèn)的說(shuō)法，認(rèn)為齲病是由于口腔微生態(tài)環(huán)境失衡所致。已經(jīng)知道，在微生物和宿主之間的共棲和共存中，口腔微生物群保持穩(wěn)態(tài)。然而，在某些情況下，寄生關(guān)系發(fā)生變化，齲齒微生物的上升導(dǎo)致齲齒。隨著先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了新的致齲微生物種類，人類口腔微生物群也逐漸被了解。然而，我們通常采取的齲病預(yù)防措施不能完全適用于每個(gè)人。個(gè)體發(fā)生蛀牙的機(jī)會(huì)取決于免疫系統(tǒng)和口腔微生物群等因素。本文中，我們回顧了相關(guān)文獻(xiàn)，并討論了微生物生物膜在齲病中的作用。

1口腔生物膜

生物膜被定義為基質(zhì)包裹的互相粘附，或粘附于牙面、牙間，軟而未礦化的微生物群落，其由口腔微生物、宿主和宿主飲食之間動(dòng)態(tài)相互作用，導(dǎo)致口腔表面的微生物定植及牙菌斑的形成[2-3]。隨著DNA和RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，不同口腔部位生物膜菌群的組成、基因組和行為的多樣性逐漸被認(rèn)識(shí)。同時(shí)，對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)如何控制細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用、創(chuàng)造微環(huán)境和改變生物膜毒力方面的認(rèn)識(shí)也逐步深入[4]。

影響口腔表面微生物群組成的因素有很多，尤其是當(dāng)牙齒萌出時(shí)，此時(shí)共生和機(jī)會(huì)性病原體的定植有了新的、非表皮的表面，這些影響因素包括年齡、飲食、口腔衛(wèi)生、全身情況和免疫狀況以及某些藥物作用等[5-6]。研究者們已在病人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物身上證明了飲食在微生物定植中所起的關(guān)鍵作用。當(dāng)宿主過(guò)度暴露于食物中的糖分時(shí)，牙齒上形成的生物膜的結(jié)構(gòu)和組成將發(fā)生顯著的變化，定植的微生物群落變得非常適合代謝碳水化合物并產(chǎn)酸，導(dǎo)致齲齒[7]。

2 EPS

早期的研究主要集中在生物膜的微生物組成上，近期的研究發(fā)現(xiàn)，生物膜內(nèi)的微生物嵌入在含有胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）的基質(zhì)中?；|(zhì)在微生物集體行為和毒力，以及對(duì)抗菌藥物的耐受性方面的作用，正日益得到認(rèn)識(shí)，并被認(rèn)為是生物膜生活方式的組成部分。EPS直接介導(dǎo)微生物對(duì)表面的粘附和細(xì)胞間的粘附，同時(shí)形成聚合物基質(zhì)，增強(qiáng)生物膜的機(jī)械穩(wěn)定性。此外，EPS基質(zhì)有擴(kuò)散修正特性，導(dǎo)致化學(xué)/營(yíng)養(yǎng)梯度的形成。pH、氧化還原和營(yíng)養(yǎng)利用率的不同，會(huì)影響生物膜內(nèi)微環(huán)境及其微生物行為[8]。因此，在基質(zhì)中，細(xì)胞組織成多細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)，彼此發(fā)生協(xié)同和拮抗作用，有助于創(chuàng)造具有不同致病潛能的局部微生態(tài)。

隨著微生物組學(xué)和基質(zhì)生物學(xué)的發(fā)展，逐漸認(rèn)識(shí)到多微生物相互作用和局部生物膜微環(huán)境的變化，對(duì)齲病的發(fā)生發(fā)展起重要作用。相反，數(shù)十年的研究清楚地表明，病原體已經(jīng)發(fā)展出一系列機(jī)制來(lái)增強(qiáng)生物膜[9]?？谇粌?nèi)環(huán)境的變化，例如糖的消耗增加或免疫反應(yīng)的改變，均可以觸發(fā)病原體重塑局部微環(huán)境和微生物群落。然而，關(guān)于病原體如何改變微生物群落和群落行為，重塑局部微環(huán)境的，卻鮮為人知。此外，共生菌和病原體是如何共存的，并且在生物膜基質(zhì)中相互競(jìng)爭(zhēng)以影響疾病過(guò)程仍然不清楚。

基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生化特性提供了生物膜的新特性，包括表面粘附性、空間和化學(xué)非均質(zhì)性、協(xié)同/競(jìng)爭(zhēng)性相互作用以及對(duì)抗菌藥物的耐受性增強(qiáng)。EPS基質(zhì)的形成取決于基質(zhì)有效性、胞外物質(zhì)的合成和分泌、剪切等應(yīng)力。與齲齒相關(guān)的口腔生物膜的主要基質(zhì)成分是多糖，特別是變形鏈球菌衍生葡聚糖。此外，其他物種（如放線菌、唾液鏈球菌和紅鏈球菌）和雜交種也可產(chǎn)生可溶性葡聚糖和果聚糖淀粉葡聚糖。與其他基質(zhì)一樣，致齲生物膜也含有eDNA[10]，具有淀粉樣特性的細(xì)菌衍生蛋白質(zhì)，以及宿主蛋白質(zhì)和糖蛋白，它們與葡聚糖結(jié)合形成基質(zhì)支架。然而，這些外聚物在基質(zhì)中的功能和結(jié)構(gòu)仍不清楚，它們?cè)谏锬さ奈⑸锝M成和致齲潛力中的作用需要進(jìn)一步研究來(lái)闡明。葡聚糖是由鏈球菌葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferases，Gtfs）協(xié)同作用產(chǎn)生的[11]。細(xì)胞外釋放的Gtf酶可以活性形式結(jié)合于牙齒表面，就地產(chǎn)生葡聚糖，提供新的細(xì)菌結(jié)合位點(diǎn)。此外，分泌的Gtf還與其他口腔微生物（共生鏈球菌，放線菌、乳酸桿菌，甚至白色念珠菌）結(jié)合，使其產(chǎn)生葡聚糖。研究者在Gtfs合成葡聚糖的過(guò)程中，使用熒光探針直接摻入時(shí)發(fā)現(xiàn)，EPS基質(zhì)時(shí)空順序及其與生物膜中細(xì)菌的空間排列被顯現(xiàn)出來(lái)。這些細(xì)胞外聚合物在細(xì)胞膜上的不同位置聚集，各種聚合物相互補(bǔ)充，形成新生的EPS基質(zhì)，并協(xié)調(diào)生物膜的發(fā)育，包括表面粘附、細(xì)胞-細(xì)胞粘附和形成類似于其他生物膜系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的微菌落的細(xì)胞團(tuán)。隨著生物膜的成熟，EPS的持續(xù)原位生成，使基質(zhì)三維擴(kuò)展，包圍細(xì)胞團(tuán)，并在3D基質(zhì)支架內(nèi)形成一個(gè)高度分隔但有凝聚力的結(jié)構(gòu)。EPS合成形成的這種空間組織，及其合成的不均勻性，恰恰可以解釋在人類口腔生物膜中發(fā)現(xiàn)的不同大小和組成的微生物群落[12]。

EPS也會(huì)影響生物膜的力學(xué)性能，例如增加對(duì)表面的粘合強(qiáng)度和粘結(jié)性。隨著生物膜的成熟，基質(zhì)硬度會(huì)增加。在后期，成熟的生物膜可以釋放出小的聚集體，甚至單個(gè)細(xì)胞，通過(guò)基質(zhì)降解，在其他部位重新啟動(dòng)生物膜的生命周期[13]。生物膜基質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)還可以通過(guò)減少藥物的獲取和觸發(fā)抗菌藥物的耐受性來(lái)保護(hù)嵌入的細(xì)菌。例如，EPS可以結(jié)合陽(yáng)離子抗菌藥物，如氯己定，防止?jié)B透到生物膜的深層，從而降低滅菌效能。

大多數(shù)生物膜內(nèi)化學(xué)和營(yíng)養(yǎng)“梯度”的形成，依賴于基質(zhì)物理屏障作用和局部微生物代謝之間的平衡。在此過(guò)程中創(chuàng)造出許多不同濃度的pH、O2、無(wú)機(jī)離子、信號(hào)分子、代謝物和其他溶質(zhì)的生物位點(diǎn)。因此，微生物的定位和它們的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制可能與它們對(duì)低pH或低氧環(huán)境的敏感性和特定配體、營(yíng)養(yǎng)素或生物分子的存在有關(guān)。這種異質(zhì)環(huán)境可以局部調(diào)節(jié)基因表達(dá)，影響不同物種之間或分布在生物膜結(jié)構(gòu)內(nèi)的不同細(xì)胞群之間的代謝和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，協(xié)調(diào)它們共同的“社會(huì)行為”、空間組織和/或生理異質(zhì)性。最近的研究表明，細(xì)菌聚集體可以誘導(dǎo)生物膜內(nèi)細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄組變化。

牙齒表面的唾液能夠緩沖中和口腔中的酸，而EPS基質(zhì)限制了帶電離子在緩沖液中的擴(kuò)散，而不帶電的溶質(zhì)，如蔗糖，可以擴(kuò)散到生物膜中并且可以很容易地被嵌入的細(xì)菌代謝成酸。此外，胞外葡聚糖似乎可以直接捕獲質(zhì)子，幫助在生物膜中保留和積累酸。生物膜基質(zhì)還可以通過(guò)固定外源酶，使它們能夠在接近細(xì)胞的同時(shí)代謝底物，參與基質(zhì)重塑。pH在口腔生物膜結(jié)構(gòu)中的不均勻空間分布一直備受重視。直接固定在生物膜基質(zhì)中的熒光pH探針顯示，盡管暴露在中性條件下，完整生物膜內(nèi)的仍顯示出三維pH分布，并且在這些特定區(qū)域積聚和限制的酸不易中和。因此，EPS可以通過(guò)幫助生物膜粘附、空間定位代謝物，調(diào)節(jié)牙齒界面的持續(xù)酸化，并可能限制唾液的緩沖，有助于創(chuàng)建齲齒微環(huán)境。

總之，EPS增強(qiáng)了細(xì)菌間的粘附-結(jié)合和種間的結(jié)合，同時(shí)通過(guò)基質(zhì)的形成，將細(xì)胞嵌入到不同的微生物群組中。EPS基質(zhì)作為一個(gè)擴(kuò)散控制屏障，通過(guò)調(diào)節(jié)溶質(zhì)進(jìn)入生物膜內(nèi)部并將產(chǎn)生的酸捕獲在生物膜內(nèi)，除了產(chǎn)生氧梯度外，還是內(nèi)源酸的產(chǎn)出場(chǎng)所。內(nèi)嵌的微生物必須處理各種應(yīng)力（酸性、低氧）和不斷波動(dòng)的營(yíng)養(yǎng)成分，以維持口腔生物膜，這是齲病發(fā)病的先決條件。產(chǎn)生EPS的病原體可以被認(rèn)為是“生物膜環(huán)境調(diào)節(jié)器”，有助于在復(fù)雜的微生物群落中建立病理微生態(tài)。

目前對(duì)于齲病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)分子和功能變化，及其與多微生物相互作用的時(shí)空變化仍有待進(jìn)一步研究。此外，目前對(duì)于EPS基質(zhì)如何提供結(jié)構(gòu)支架，如何控制微生物的聚集、定位和活動(dòng)的，并不十分清楚?；|(zhì)介導(dǎo)的變化可以改變細(xì)胞間的相互作用，特別是不同微生物物種之間的相互作用。深入分析生物膜基質(zhì)、局部微生物組分和宿主之間的結(jié)構(gòu)和功能相互作用，將促進(jìn)我們對(duì)口腔和其他多微生物疾病致病機(jī)制的了解，以提供精準(zhǔn)的靶向治療及預(yù)防措施。

參考文獻(xiàn)：

[1]李瑩，儀虹.高齲和無(wú)齲人群口腔唾液微生物群落結(jié)構(gòu)分析[J].中國(guó)醫(yī)刊，2015，50（3）：68-71.

[2]Marsh， P.D. and Zaura， E. （2017） Dental biofilm： ecological interactions in health and disease. J. Clin. Periodontol. 44 （Suppl. 18），S12–S22

[3]Hobley， L. et al. （2015） Giving structure to the biofilm matrix： an overview of individual strategies and emerging common themes.FEMS Microbiol. Rev. 39， 649–669

[4]Koo， H. and Yamada， K.M. （2016） Dynamic cell-matrix interactions modulate microbial biofilm and tissue 3D microenvironments. Curr. Opin. Cell. Biol. 42， 102–112

[5]David， L.A. et al. （2014） Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Nature 505， 559–563

[6]Maslowski， K.M. and Mackay， C.R. （2011） Diet， gut microbiota and immune responses. Nat. Immunol. 12， 5–9

[7]Pitts， N.B. et al. （2017） Dental caries. Nat. Rev. Dis. Primers 3，17030

[8]Mira， A. et al. （2017） Role of microbial communities in the pathogenesis of periodontal diseases and caries. J. Clin. Periodontol.44 （Suppl. 18）， S23–S38

[9]Lamont， R.J. and Hajishengallis， G. （2015） Polymicrobial synergy and dysbiosis in inflammatory disease. Trends Mol. Med. 21，172–183

[10]Rostami， N. et al. （2017） A critical role for extracellular DNA in dental plaque formation. J. Dent. Res. 96， 208–216

[11]Besingi， R.N. et al. （2017） Functional amyloids in Streptococcus mutans， their use as targets of biofilm inhibition and initial characterization of SMU_63c. Microbiology 163， 488–501

[12]Mark Welch， J.L. et al. （2016） Biogeography of a human oral microbiome at the micron scale. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.113， E791–E800

[13]Liu， Y. et al. （2016） Topical delivery of low-cost protein drug candidates made in chloroplasts for biofilm disruption and uptake by oral epithelial cells. Biomaterials 105， 156–166