鄭寧澤?陶亮?王琴

【摘要】目的 體外檢測黃芩素對順鉑抑制卵巢癌A2780細胞增殖的影響及其機制。方法 選擇對數生長期A2780細胞，采用CCK-8法分別檢測黃芩素對A2780細胞的毒性、有黃芩素和無黃芩素作用下順鉑對A2780細胞的半數抑制濃度（IC50）差異、在細胞縫隙連接（GJ）通道功能抑制劑18-α-甘草次酸（18-α-GA）的作用下順鉑對A2780細胞抑制率的變化以及增加黃芩素對順鉑作用的影響，使用細胞接種熒光示蹤法檢測黃芩素對A2780細胞GJ通道功能的影響。利用GEO公共數據庫，比較卵巢正常上皮組織和卵巢癌上皮組織中編碼Cx43的GJA1基因表達的差異。利用蛋白免疫印跡法檢測黃芩素對A2780細胞中Cx43蛋白表達的影響。利用Swiss Target Prediction 數據庫預測黃芩素的靶蛋白，并構建靶蛋白與GJ通道的互作網絡。結果 當黃芩素≤10.00 μmol/L，其對A2780細胞無明顯毒性。與單用順鉑比較，10.00 μmol/L

黃芩素可增加順鉑對A2780細胞的抑制率（P < 0.01）。GEO公共數據庫分析顯示，卵巢癌上皮組織中GJA1 mRNA的表達水平低于卵巢正常上皮組織（P < 0.01）;黃芩素可上調A2780細胞中Cx43蛋白表達量（P < 0.01）。18-α-GA可降低順鉑對A2780細胞的抑制率，并且能逆轉黃芩素對順鉑增敏作用（P均< 0.01）。Swiss Target Prediction 數據庫分析顯示，黃芩素直接靶向于GJ通道中的4個蛋白。結論 黃芩素能增強順鉑對卵巢癌A2780細胞的毒性，其機制可能與增強A2780細胞的GJ通道功能有關。

【關鍵詞】黃芩素;卵巢癌;順鉑;細胞縫隙連接

Effect of baicalein on the inhibitory role of cisplatin on the proliferation of ovarian cancer A2780 cells Zheng Ningze， Tao Liang， Wang Qin. Department of Pharmacology， Zhongshan School of Medicine， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China

Corresponding author， Wang Qin， E-mail： Wangqin6@ sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To evaluate the effect and mechanism of baicalein on the inhibitory role of cicplatin on the proliferation of ovarian cancer A2780 cells. Methods The A2780 cells in the logarithmic growth phase were selected. The cytotoxicity of baicalein on the ovarian cancer A2780 cells was assessed by CCK-8 assay. The difference of IC50 of cisplatin in the A2780 cells treated with and without baicalein was statistically compared. After the treatment with cell gap junction （GJ） pathway inhibitor 18-α-glycyrrhetinic acid （18-α-GA）， the effect of cisplatin on the inhibitory rate of A2780 cells was evaluated. The effect of baicalein treatment on the inhibitory role of cisplatin was assessed. The impact of baicalein on the function of GJ signaling pathway in the A2780 cells was evaluated by Parachute assay. Based on the GEO dataset， the expression levels of GJA1 （Cx43） genes between the normal ovarian epithelial and ovarian cancer epithelial tissues were statistically compared. The effect of baicalein on the expression of Cx43 protein in the A2780 cells was assessed by Western blot. The targeted protein of baicalein was predicted by Swiss Target Prediction database. The interaction network between the targeted proteins and GJ pathway was constructed.? Results Baicalein treatment at a dose of≤10 μmol/L provoked no obvious toxicity to the A2780 cells. Compared with cisplatin alone， baicalein treatment at a dose of 10 μmol/L could significantly increase the inhibitory rate of cisplatin on the A2780 cells （P < 0.01）. Administration of 18-α-GA could considerably lower the inhibitory rate of cisplatin on the A2780 cells and significantly reverse the sensitization effect of baicalein on cisplatin （both P < 0.01）. GEO dataset revealed that the expression level of Cx43 mRNA in the ovarian cancer epithelial tissues was significantly lower compared with that in the normal ovarian epithelial tissues （P < 0.05）. Treatment with baicalein could significantly up-regulate the expression level of Cx43 protein （P < 0.01）. Swiss Target Prediction database demonstrated that baicalein directly targeted to the four proteins in the GJ pathway. Conclusion Baicalein can increase the cytotoxicity of cisplatin upon the ovarian cancer A2780 cells， probably correlated with the enhancement of the function of GJ pathway in the A2780 cells.

【Key words】Baicalein;Ovarian cancer;Cisplatin;Gap junction

卵巢癌是常見的一種惡性腫瘤，患者病死率在婦科腫瘤中居于首位。大部分卵巢癌患者在經過一線化學治療之后，容易出現繼發(fā)性耐藥，導致化學治療失敗、腫瘤復發(fā)[1-2]。其中，導致卵巢癌患者出現耐藥的原因是，鉑類藥物的使用會出現一系列的不良反應，從而限制了鉑類藥物在臨床上的使用劑量[3]。因此，尋找提高一線化學治療藥物療效的方法，是延長卵巢癌患者生存期的關鍵所在。細胞縫隙連接（GJ）是連接相鄰2個細胞胞漿的一種蛋白質通道，由接合素蛋白（Cx）組成，如Cx32、Cx37、Cx43等。大多數腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中，GJ通道功能會明顯下降;而在恢復GJ通道功能之后，腫瘤細胞的生長會受到抑制[4]。重建和增強腫瘤細胞的GJ通道功能，由GJ通道介導的“旁觀者效應”能夠增強輻射和抗腫瘤藥物對腫瘤的殺傷作用[5-6]。抑制GJ通道功能可以減弱順鉑和紫衫醇等抗腫瘤藥物的細胞毒性[7]。因此，GJ通道可增強化學治療藥物的細胞殺傷作用。既往研究表明，人卵巢癌細胞中Cx的表達和GJ通道功能是降低的[8]。因此恢復卵巢癌細胞中的GJ通道功能，對提高藥物療效具有重要意義。

黃芩素是從黃芩根部提取出來的一種單體成分，對多種腫瘤都有明顯的抑制作用，包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌等。其發(fā)揮抗腫瘤作用的機制多種多樣，主要包括清除自由基、抑制細胞周期蛋白復合物的形成、誘導細胞凋亡等[9-11]。目前筆者尚未查及黃芩素與卵巢癌細胞中GJ通道功能關系的相關研究。為此，本研究觀察順鉑聯合黃芩素對卵巢癌細胞增殖能力的影響，探討黃芩素對順鉑毒性的影響及其作用機制，現報告如下。

材料與方法

一、材 料

黃芩素購于中國食品藥品檢定研究院。順鉑、二甲亞砜、18α-甘草次酸（18-α-GA）、Cx抗體、微管蛋白（Tubulin）抗體購于美國Sigma-Aldrich公司。羊抗鼠二抗購于美國Jackson公司;細胞計數試劑盒-8（CCK-8）購于日本Dojindo分子科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、活細胞染料CM-Dil和Calcein-AM購于美國Invitrogen生物試劑公司。雙抗、胰酶和胎牛血清購于美國Gibco公司。

二、細胞培養(yǎng)

卵巢癌A2780細胞來源于美國典型培養(yǎng)物收藏中心（ATCC），置于高糖DMEM培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清和100 U/ml的雙抗），在5% CO2、37℃溫箱中培養(yǎng)。

三、細胞存活率的測定

采用CCK-8法。取對數生長期的卵巢癌A2780細胞，稀釋成5×104/ml的細胞混懸液，然后以每孔0.1 ml接種至96孔板中，每組接種3個復孔，培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁之后，將培養(yǎng)基去除。對于黃芩素的毒性測定，于孔板中加入含有黃芩素（濃度為0、0.01、0.10、1.00、10.00、50.00 μmol/L）

的培養(yǎng)基，分別孵育48 h和72 h;對于順鉑與黃芩素的聯合實驗，于孔板中先加入含10.00 μmol/L黃芩素的培養(yǎng)基預孵育24 h，再與含順鉑（濃度梯度為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、30.00、50.00、100.00 μg/ml）的培養(yǎng)基共同孵育48 h;對于回復實驗，細胞先與10.00 μmol/L黃芩素預孵24 h，然后與4.00 μg/ml順鉑、25.00 μmol/L

18-α-GA和10.00 μmol/L黃芩素或其組合共同孵育48 h。吸取含藥培養(yǎng)基，加入CCK-8溶液孵育0.5 ～ 1.0 h，最后在450 nm的波長下檢測各個孔的吸光度（OD）。存活細胞比例= OD待測時點/OD0 h;抑制率= 1-（OD加藥孔-OD本底）/（OD對照孔-OD本底）;半數抑制濃度（IC50）使用GraphPad軟件繪制生存曲線計得。每組試驗至少平行重復3次，最后結果取平均值。

四、細胞接種熒光示蹤法

將細胞接種至12孔板中，孵育24 h。然后加入10.00 μmol/L的黃芩素孵育48 h。在培養(yǎng)供體細胞的孔中加入染料Calcein-AM（能通過GJ通道傳遞至相鄰細胞）和CM-Dil（能滲透進入細胞，但不能通過GJ通道傳遞），在37℃的條件下孵育30 min。將供體細胞消化下來，以500/孔接種至受體細胞所在的孔中，繼續(xù)孵育4 h。最后，利用免疫熒光顯微鏡進行拍攝。每個供體細胞周圍含有綠色熒光的細胞的數量，即為GJ通道功能的度量。

五、蛋白免疫印跡法

取對數生長期的A2780細胞，接種至6孔板中，培養(yǎng)24 h。去除試驗組中的培養(yǎng)基，加入含10.00 μmol/L黃芩素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。丟棄培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3遍，加入蛋白裂解液提取總蛋白。測定蛋白濃度，取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳分離、轉膜、5%脫脂奶粉封閉，然后加入抗Cx43抗體（1∶5000）4℃孵育過夜。次日加入過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，然后顯影，最后用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度分析。

六、卵巢癌相關的數據的提取和分析

為了分析Cx43 mRNA在卵巢癌組織中的表達情況，在“GEO profiles”數據庫的檢索框中輸入“GJA1; ovarian cancer”。檢索結果納入標準為：①種屬為“human”;②樣本分別為正常組織和腫瘤組織;③正常卵巢組織和卵巢癌組織的臨床樣本均≥3例。

七、黃芩素的作用靶點與GJ通道互作網絡的構建

在Pubchem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）中檢索黃芩素化合物的Canonical SMILES號，并將其導入到Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）中進行化合物作用靶點的預測，一共獲得100個靶蛋白基因。在KEGG數據庫中獲取GJ通道的基因集，然后利用STRING數據庫進行構建蛋白互作網絡。將黃芩素的靶基因集和GJ通道的互作網絡導入Cytoscape軟件中，最后獲得黃芩素的作用靶點與GJ通道之間的關系。

八、統計學處理

采用GraphPad Prism 7.0進行結果處理分析，正態(tài)分布的定量數據以表示，2組比較用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，進一步的兩兩比較則采用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、黃芩素對卵巢癌A2780細胞的毒性測定

0.01 ～ 10.00 μmol/L的黃芩素對卵巢癌A2780細胞生存率無影響（P > 0.05），50.00 μmol/L的黃芩素對細胞生長有抑制作用，其存活率低于0 μmol/L（P < 0.001），見圖1。當黃芩素濃度為10.00 μmol/L時，可認為對細胞生長無毒性，因此選擇黃芩素10.00 μmol/L作進一步研究。

二、有黃芩素和無黃芩素作用下順鉑對卵巢癌A2780細胞的IC50比較

單用順鉑對卵巢癌A2780細胞的IC50為7.6 μg/ml;當10 .00 μmol/L黃芩素孵育卵巢癌A2780細胞24 h，再與順鉑和黃芩素的混合液共同處理48 h，卵巢癌A2780細胞對順鉑的反應性增加，黃芩素+順鉑對A2780細胞的IC50下降至4.9 μg/ml，與單用順鉑的IC50比較差異有統計學意義（P < 0.01），見圖2。

三、有黃芩素和無黃芩素作用下卵巢癌A2780細胞的GJ通道功能變化

GEO數據庫分析顯示，與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中的Cx43蛋白編碼基因GJA1 mRNA表達水平降低（P < 0.01），見圖3A。細胞接種熒光示蹤試驗顯示，與無黃芩素的A2780細胞相比，經過黃芩素作用48 h的A2780細胞GJ通道功能增強，見圖3B。其Cx43蛋白的表達水平也隨之升高（P < 0.01），見圖3C。

四、黃芩素通過增強GJ通道功能增加順鉑的細胞增殖抑制作用

25.00 μmol/L 18-α-GA和4.00 μg/ml順鉑共同處理組的A2780細胞抑制率低于單用順鉑（P < 0.01）;相比于單用順鉑處理，10.00 μmol/L黃芩素和順鉑的共同處理能夠增加順鉑對A2780細胞抑制率（P < 0.01），而18-α-GA的加入可減弱這種增敏作用（P < 0.01），見圖4。

五、黃芩素預測靶點與GJ通道的關系

利用Swiss Target Prediction數據庫對黃芩素的作用靶點進行預測。在預測到的100個靶蛋白中，有4個蛋白存在于GJ通道中，分別是原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src、絲裂原活化蛋白激酶3? （MAPK3）、表皮生長因子受體（EGFR）和周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）。通過蛋白互作網絡的構建，可以看出黃芩素直接靶向的這4個蛋白與GJA1存在直接的相互作用關系（圖5），因此可推測黃芩素可通過作用于這4個靶蛋白，進而影響Cx43在細胞內的生物學效應。

討論

鉑類藥物的化學治療是卵巢癌術后的標準治療方案，但是由于鉑類藥物毒性較大，限制了鉑類藥物單獨使用的劑量[13]。特別是對于卵巢癌復發(fā)的患者，單獨使用鉑類藥物難以達到令人滿意的效果。所以目前對于卵巢癌的治療，越來越趨向于鉑類藥物與其他藥物的聯合使用[14]。這類藥物的作用機制與鉑類藥物的作用機制不同，比如血管生成抑制劑、多聚ADP核糖聚合酶抑制劑[15-16]。藥物的聯合使用，不僅降低了鉑類藥物的毒性，還增強了鉑類藥物的療效。既往的研究表明，GJ作為連接相鄰細胞胞漿的蛋白質通道，損傷的細胞所產生的死亡信號能夠通過該通道傳遞至相鄰未損傷的細胞中，從而介導了“旁觀者效應”，使得一些抗腫瘤藥物的療效增加[17]。本研究顯示，GJ通道功能抑制劑可減弱順鉑對卵巢癌A2780細胞的抑制作用，與以往的研究結果相一致。因此，GJ通道可以作為增加抗腫瘤藥物療效的靶點。

黃芩素是一種黃酮類化合物，研究顯示其對多種腫瘤具有明顯的抑制作用，而且其發(fā)揮抗腫瘤作用的機制多種多樣[9， 18]。本研究也顯示，黃芩素能夠在對卵巢癌A2780細胞無毒性的濃度下，增加順鉑對其的抑制作用。另外，多項研究顯示黃酮類藥物具有增強GJ通道功能的作用，比如槲皮素能夠增強腸上皮細胞的GJ通道功能[19]。山柰酚可上調結腸癌細胞中的GJ通道功能[20]。筆者團隊前期的研究顯示，黃芩素能夠通過增強Cx32-Hela細胞的GJ通道功能，進而增加順鉑對Hela細胞的殺傷作用[12]。本研究顯示，黃芩素同樣也能夠增強卵巢癌A2780細胞的GJ通道功能。結合前述研究結果，推測GJ通道參與了黃芩素發(fā)揮增敏作用的過程。進一步的研究使用了GJ通道抑制劑18-α-GA，結果顯示18-α-GA能削弱黃芩素的增敏作用，進一步證明了黃芩素所發(fā)揮的順鉑增效作用是通過增強A2780細胞的GJ通道功能實現。

在卵巢組織中，Cx43蛋白是組成GJ通道的主要成分，并在卵巢組織的正常發(fā)育中起到重要的作用[21]。有研究顯示，GJ通道功能在卵巢癌細胞中明顯減弱[22]。為此，本研究利用GEO數據庫比較了編碼Cx43蛋白的GJA1基因在卵巢正常上皮組織和卵巢癌上皮組織中的差異。結果顯示在卵巢癌上皮組織中，Cx43的表達降低。由此推測，卵巢癌組織中Cx43表達的下調導致GJ通道功能減弱，并且黃芩素增強GJ通道功能的作用可能與Cx43有關。為了驗證這個推測，本研究觀察了黃芩素對Cx43蛋白表達的影響，結果顯示黃芩素可上調Cx43蛋白的表達。另外，我們利用網絡數據庫進行預測黃芩素的作用靶點，并構建黃芩素靶蛋白與GJ通道的關系。根據所得的互作網絡圖，可看出黃芩素直接靶向于GJ通道的4個靶蛋白，并且這4個靶蛋白與Cx43蛋白有直接的相互作用關系。

綜上所述，本研究首次證明了黃芩素可通過增強卵巢癌A2780細胞中的GJ通道功能，進而增加順鉑對卵巢癌細胞的毒性。本研究結果為尋找化學治療增效、提高抗腫瘤藥物的效果以及克服腫瘤耐藥的難題提供了理論基礎。

參 考 文 獻

[1] Sinha A， Ignatchenko V， Ignatchenko A， Mejia-Guerrero S， Kislinger T. In-depth proteomic analyses of ovarian cancer cell line exosomes reveals differential enrichment of functional categories compared to the NCI 60 proteome. Biochem Biophys Res Commun， 2014， 445（4）：694-701.

[2] 高景陽， 黃淑華. 卵巢癌鉑類耐藥治療的研究進展. 新醫(yī)學， 2016， 47（5）：299-302.

[3] Siddik ZH. Cisplatin： mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance. Oncogene， 2003， 22（47）：7265-7279.

[4] Mesnil M. Connexins and cancer. Biol Cell， 2002， 94（7-8）：493-500.

[5] Sawal HA， Asghar K， Bureik M， Jalal N. Bystander signaling via oxidative metabolism. Onco Targets Ther， 2017， 10：3925-3940.，

[6] Wang L， Fu Y， Peng J， Wu D， Yu M， Xu C， Wang Q， Tao L. Simvastatin-induced up-regulation of gap junctions composed of connexin 43 sensitize Leydig tumor cells to etoposide： an involvement of PKC pathway. Toxicology， 2013，312：149-157.

[7] Wang Q， You T， Yuan D， Han X， Hong X， He B， Wang L， Tong X， Tao L， Harris AL. Cisplatin and oxaliplatin inhibit gap junctional communication by direct action and by reduction of connexin expression， thereby counteracting cytotoxic efficacy. J Pharmacol Exp Ther， 2010， 333（3）：903-911.

[8] Gershon E， Plaks V， Dekel N. Gap junctions in the ovary： expression， localization and function. Mol Cell Endocrinol， 2008， 282（1-2）：18-25.

[9] Liu H， Dong Y， Gao Y， Du Z， Wang Y， Cheng P， Chen A， Huang H. The fascinating effects of baicalein on cancer： a review. Int J Mol Sci， 2016， 17（10）：1681.

[10] Zheng F， Wu J， Zhao S， Luo Q， Tang Q， Yang L， Li L， Wu W， Hann SS. Baicalein increases the expression and reciprocal interplay of RUNX3 and FOXO3a through crosstalk of AMPKα and MEK/ERK1/2 signaling pathways in human non-small cell lung cancer cells. J Exp Clin Cancer Res， 2015， 34（1）：41.

[11] Wang YF， Xu YL， Tang ZH， Li T， Zhang LL， Chen X， Lu JH， Leung CH， Ma DL， Qiang WA， Wang YT， Lu JJ. Baicalein induces beclin 1- and extracellular signal-regulated kinase-dependent autophagy in ovarian cancer cells. Am J Chin Med， 2017， 45（1）：123-136.

[12] Wang Y， Wang Q， Zhang S， Zhang Y， Tao L. Baicalein increases the cytotoxicity of cisplatin by enhancing gap junction intercellular communication. Mol Med Rep， 2014， 10（1）：515-521.

[13] Bookman MA， Brady MF， McGuire WP， Harper PG， Alberts DS， Friedlander M， Colombo N， Fowler JM， Argenta PA， De Geest K， Mutch DG， Burger RA， Swart AM， Trimble EL， Accario-Winslow C， Roth LM. Evaluation of new platinum-based treatment regimens in advanced-stage ovarian cancer： a Phase Ⅲ Trial of the Gynecologic Cancer Intergroup. J Clin Oncol， 2009， 27（9）：1419-1425.

[14] Mullen MM， Kuroki LM， Thaker PH. Novel treatment options in platinum-sensitive recurrent ovarian cancer： a review. Gynecol Oncol， 2019， 152（2）：416-425.

[15] Schmitt J， Matei D. Targeting angiogenesis in ovarian cancer. Cancer Treat Rev， 2012， 38（4）：272-283.

[16] De Lorenzo SB， Patel AG， Hurley RM， Kaufmann SH. The elephant and the blind men： making sense of PARP inhibitors in homologous recombination deficient tumor cells. Front Oncol， 2013， 3：228.

[17] Liu Z， Wang Q， Fan L， Wu DP， Zhang Y， Liu L， Tao L. Gap junction enhances phototoxicity of photodynamic therapy agent 2-[1-hexyloxyethyl]-2-devinylpyropheophorbide-a （HPPH）. Lasers Surg Med， 2015， 47（1）：68-76.

[18] Ma Z， Otsuyama K， Liu S， Abroun S， Ishikawa H， Tsuyama N， Obata M， Li FJ， Zheng X， Maki Y， Miyamoto K， Kawano MM. Baicalein， a component of Scutellaria radix from Huang-Lian-Jie-Du-Tang （HLJDT）， leads to suppression of proliferation and induction of apoptosis in human myeloma cells. Blood， 2005， 105（8）：3312-3318.

[19] Chaumontet C， Droumaguet C， Bex V， Heberden C， Gaillard-Sanchez I， Martel P. Flavonoids （apigenin， tangeretin） counteract tumor promoter-induced inhibition of intercellular communication of rat liver epithelial cells. Cancer Lett， 1997， 114（1-2）：207-210.

[20] Nakamura Y， Chang CC， Mori T， Sato K， Ohtsuki K， Upham BL， Trosko JE. Augmentation of differentiation and gap junction function by kaempferol in partially differentiated colon cancer cells. Carcinogenesis， 2005， 26（3）：665-671.

[21] Wang HX， Tong D， El-Gehani F， Tekpetey FR， Kidder GM. Connexin expression and gap junctional coupling in human cumulus cells： contribution to embryo quality. J Cell Mol Med， 2009， 13（5）：972-984.

[22] Gershon E， Plaks V， Dekel N. Gap junctions in the ovary： expression， localization and function. Mol Cell Endocrinol， 2008， 282（1-2）：18-25.

（收稿日期：2019-12-20）

（本文編輯：林燕薇）