劉茜(譜尼測試集團上海有限公司，上海 200233)

0 引言

海洋微生物在海洋生態(tài)環(huán)境中具有極其重要作用，在全球生物地球化學(xué)過程以及生態(tài)環(huán)境的自然修復(fù)中，有著舉足輕重的地位。海洋沉積物中微生物組成復(fù)雜，不同海水區(qū)域，其微生物群落變化明顯。近代人類不可持續(xù)生產(chǎn)及生活方式，使海洋環(huán)境遭受嚴(yán)重污染。海水養(yǎng)殖業(yè)、工業(yè)污水排入、地表徑流及河流流入等，均給近海生態(tài)環(huán)境帶來影響。海洋沉積物異養(yǎng)菌總數(shù)在近岸污染生態(tài)基線(背景)調(diào)查和環(huán)境質(zhì)量綜合評價中，也作為必檢項目給予監(jiān)測[1]。

測量不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，用以表征合理賦予被測量值的分散性。CNAS—CL07：2011《測量不確定度的要求》對檢測實驗室要求，實驗室應(yīng)對每一項有數(shù)值要求的測量結(jié)果進行測量不確定度評估，尤其要求在開展新的檢測方法時，或在客戶有要求時，或用來確定是否符合某規(guī)范所依據(jù)的誤差限的寬窄時[2]。在目前關(guān)于微生物檢測不確定度的研究中，幾乎找不到關(guān)于海洋沉積物異養(yǎng)菌總數(shù)測量不確定度的相關(guān)報道。由于微生物在樣品中分布的不均勻性，及海洋沉積物微生物組成的復(fù)雜性，測量不確定度的研究顯得尤為重要。CNAS—CL09：2013《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》要求在微生物檢測領(lǐng)域，某些情況下，一些檢測無法從計量學(xué)和統(tǒng)計學(xué)角度對測量不確定度進行有效而嚴(yán)格的評估，這時至少應(yīng)通過分析方法，考慮它們對于檢測結(jié)果的重要性，列出各主要的不確定度分量，并做出合理的評估。有時在重復(fù)性和再現(xiàn)性數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上估算不確定度也是合適的[3]。本文參考各方資料，對海洋沉積物異養(yǎng)菌總數(shù)測量不確定度進行分析考察。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備

電子天平，型號JA21002，精度為0.1g，上海良平儀器儀表有限公司。

培養(yǎng)箱，型號MJX-250B-Z，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

凈化工作臺，型號SW-CJ-1F，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌器，型號YXQ-LS-100SII，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

無菌培養(yǎng)皿，直徑90mm。無菌錐形瓶，容量250mL、500mL。微量移液器及無菌吸頭。

1.2 試劑與材料

2216E 培養(yǎng)基，購于青島海博生物技術(shù)有限公司。樣品，海洋沉積物底泥來源于上海市南匯。

1.3 操作步驟

樣品制備：取海洋沉積物底泥，取樣前盡可能混合均勻。

檢測步驟 ：操作參考GB 17378.7—2007 海洋監(jiān)測規(guī)范 第7 部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測 附錄F 的方法。無菌稱取1.0g 沉積物(底泥)樣品，然后加入9mL 無菌海水，混勻；無菌操作吸取混勻后的混合樣1mL，加入到盛有9mL 無菌陳海水的試管內(nèi)混勻，并依同法依次連續(xù)稀釋至所需稀釋度。選擇2～3個適宜的稀釋度樣品勻液，吸取0.1mL 分別加入預(yù)先制備好的2216E 培養(yǎng)基平皿內(nèi)，每個稀釋度接種三塊平皿。用滅菌不銹鋼涂布棒涂布均勻，平皿置于超凈工作臺靜置20～30min，待樣液滲入培養(yǎng)基后，將此平皿移入恒溫箱25℃培養(yǎng)7 天，取出計數(shù)平板上菌落[1]。

1.4 菌落計數(shù)與計算結(jié)果

選取菌落數(shù)在30～300 范圍內(nèi)稀釋度的平皿進行菌落計數(shù)[1]。細菌總數(shù)為3 塊平板菌落數(shù)的平均值，再乘以稀釋倍數(shù)。出現(xiàn)其他計數(shù)情況，按標(biāo)準(zhǔn)中要求進行計數(shù)。

2 不確定度分析

2.1 不確定度的主要來源分析

微生物計數(shù)的測量不確定的評估一般采取整體法進行評估。以便控制結(jié)果來源的各個測試程序。整體法可看作是一個“黑匣子”系統(tǒng)[4]，對不確定度的主要來源均包含在其中，現(xiàn)對各來源進行分析，以確定對本測試有影響的重要分量。

2.1.1 取樣及次級取樣

從大量的待測樣品中取出測試單元的步驟，是總誤差的重要組成部分。但是該部分并不是測量本身不確定度的組成部分，因此在本分析中不予考慮。次級取樣是指從分析樣品中取出的測試部分，本測試中為初始懸液的制備。海洋沉積物中微生物種類豐富組成復(fù)雜，分布不均勻，個體差異較大，因此方案需考慮次級取樣的因素。

2.1.2 樣品的質(zhì)量

樣品質(zhì)量的不確定評定可通過不確定傳播的方式來獲得，即通過天平的不確定度。但是在微生物檢測中，樣品的質(zhì)量因素對測量不確定度的貢獻較小，因此該因素一般不作為結(jié)果不確定度的主要來源。

2.1.3 微生物在樣品中的分布及數(shù)量

狀態(tài)一致的樣品會由于污染情況不同，而出現(xiàn)不同分布。試驗前的樣品應(yīng)盡可能混勻，但是由于微生物間或微生物與設(shè)備間有相互吸引或相互排斥的傾向，導(dǎo)致樣品中的微生物過度離散，呈現(xiàn)隨機分布。按照統(tǒng)計學(xué)原理，其最終結(jié)果還是會呈現(xiàn)泊松分布。基于資料，一般不對低含量樣本的不確定度進行考察，因為當(dāng)含量過低時，重復(fù)性和再現(xiàn)性很難測量，不確定度沒有簡單統(tǒng)一的方法來評定。

2.1.4 操作方式

分析過程中的一系列因素，如不同稀釋倍度結(jié)果的差異、同一稀釋度不同平板計數(shù)的差別、人員對平板菌落觀察結(jié)果計數(shù)的差別、檢測時間、設(shè)備培養(yǎng)溫度的差異及培養(yǎng)基等因素，是不確定度貢獻的主要來源。對于隨機誤差，可能來源于人員操作手法及設(shè)備的使用，在重復(fù)性條件下實驗室內(nèi)部進行評定時可給予考慮。另外，因分析步驟直接決定測量結(jié)果，根據(jù)經(jīng)驗本次實驗不考慮偏倚因素。

2.2 建立數(shù)學(xué)模型[5]

測量中，設(shè)被測量異養(yǎng)菌總數(shù)為Y，實驗結(jié)果為X，則Y=X。

2.3 實驗方法的確認(rèn)與實施

本實驗方案為取不同濃度的沉積物基質(zhì)樣品，每份樣品分為A、B 兩組不同實驗員。因微生物濃度在樣品基質(zhì)中不穩(wěn)定，會隨時間變化有所改變，所以本方案中無法考慮不同分析時間帶入的影響。為盡可能得到不同的A、B 情況、兩組人員采用不同滅菌批次的培養(yǎng)基試劑、不同的操作臺、不同的移液器、不同的培養(yǎng)箱，以覆蓋人員、培養(yǎng)基配制、設(shè)備溫度等因素所引起的操作條件的變化。

對樣品分別準(zhǔn)備的10 組待測樣品，每組樣品重復(fù)測試2次。根據(jù)GB 17378.7—2007 進行菌落計數(shù)。

樣品不確定度計算：樣品10 組結(jié)果取對數(shù)，計算再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果見表1。

表1 樣品再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差的計算

式中：SR為再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差；yij為對數(shù)轉(zhuǎn)換值(lg(CFU/mL))；n為給定基質(zhì)樣品數(shù)量；i 為樣品的序號，i=1～n；j 為再現(xiàn)性條件的編號，j=A 或j=B。測試結(jié)果以Y=lgX 表示，再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差以SR表示，在包含因子為2(置信水平95%)時，則擴展不確定度為：U=2SR=0.18

2.4 結(jié)果報告

每組樣品結(jié)果以區(qū)間的形式表示為lgXi-0.18≤lgXi≤lg+0.18，取反對數(shù)得到每一樣品微生物含量的區(qū)間。以第1 組測試樣品為例，lgX 的取值范圍為2.65≤lgX1A≤3.01，該測試樣品異養(yǎng)菌總數(shù)取對數(shù)值得到微生物含量X1A的所在區(qū)間為447≤X1A≤1023。

3 討論

本文依據(jù)GB 17378.7 平板計數(shù)表面涂抹法對海洋沉積物異養(yǎng)菌總數(shù)進行測定，依據(jù)JJF1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》、RB/T 151—2016《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》等資料，對測量結(jié)果不確定度進行分析，建立了海洋沉積物異養(yǎng)菌總數(shù)不確定度的評估方法。由于微生物數(shù)據(jù)的發(fā)散性較大，平板計數(shù)呈偏態(tài)分布，需要先將檢測結(jié)果取對數(shù)，轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布后使用。由于x 和lgx 之間的非線性關(guān)系，計算得到的擴展不確定度U 不能直接換算到x，因此只能給出測定結(jié)果的可能區(qū)間。

4 結(jié)語

綜上所述，本文建立的不確定度評估方法，可為實驗室質(zhì)量管理及評價提供科學(xué)依據(jù)。對于不確定度的主要來源文中已詳細介紹，在此不再贅述。實驗室在操作過程中，應(yīng)關(guān)注各影響因素，一方面加強試劑耗材及關(guān)鍵性設(shè)備的質(zhì)量驗收，另一方面提高檢測人員的操作技能，以降低隨機誤差。