李婷婷 任麗琨 王當豐 宋敏杰 于海鳳 勵建榮*謝 晶 沈 琳 牟偉麗 黃建聯(lián)

（1 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連116600 2 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點實驗室 遼寧錦州121013 3 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海201306 4 大連東霖食品股份有限公司 遼寧大連116000 5 蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東煙臺265600 6 福建安井食品股份有限公司 福建廈門361022）

痛風(fēng)是日常生活中常見的慢性非傳染型疾病，主要是由人體嘌呤代謝紊亂及尿酸排泄受阻所致[1]。近年來，隨著研究者對痛風(fēng)的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)除與遺傳有關(guān)外，飲食也起著重要的作用[2]。由于我國居民生活水平的提高及膳食結(jié)構(gòu)的改變，我國痛風(fēng)患病率逐年上升。高秀林等[3]對我國93 例痛風(fēng)患者臨床資料進行分析，發(fā)現(xiàn)沿海地區(qū)痛風(fēng)發(fā)病率高于內(nèi)陸地區(qū)，推測可能與膳食結(jié)構(gòu)有關(guān)。沿海地區(qū)魚、蝦、貝類資源豐富，豐富的海產(chǎn)資源為提高當?shù)鼐用竦臓I養(yǎng)水平做出了巨大貢獻，然而，海產(chǎn)品中嘌呤含量較高，過多的攝入會導(dǎo)致人體嘌呤含量增多，尿酸水平升高，最終誘發(fā)痛風(fēng)。了解海水魚中嘌呤含量及分布，可為消費者尤其是痛風(fēng)患者選擇合適的食品提供科學(xué)指導(dǎo)。

現(xiàn)有的嘌呤檢測方法主要有高效液相色譜法[4]、氣相色譜法[5]、毛細管電泳法[6]以及離子對交換法[7]等。在眾多方法中，鑒于高效液相色譜具有簡便、快速、靈敏、準確的特點[8]，已在嘌呤檢測領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。然而，由于食品種類不同，所以無法建立完善、統(tǒng)一的高效液相色譜法的樣品前處理方法。本研究旨在建立海水魚中嘌呤含量檢測的高效液相色譜法，檢測常見的海水中的魚嘌呤，完善海水魚嘌呤數(shù)據(jù)，為痛風(fēng)及高尿酸血癥患者合理地食用海水魚提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料及藥品

新鮮鱈魚、美國紅魚、金倉魚、海鱸魚、黃花魚、踏板魚及鮮活大菱鲆，購于錦州水產(chǎn)市場；腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤（色譜級，純度≥99.0%），aladdin 公司；甲醇（色譜純），aladdin 公司；四丁基氫氧化銨（色譜純），aladdin 公司；冰乙酸（色譜純），aladdin 公司；三氟乙酸（色譜純），山東西亞化學(xué)股份有限公司；甲酸（分析純），天津市津東天正精細化學(xué)試劑廠；高氯酸（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

MS105DU 型電子分天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；LC-2030 型島津高效液相色譜儀，日本島津公司；DELTA 320 型pH 計，瑞士Mettler toledo 公司；UV-2700 型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；SK6210HP 型超聲清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；Biofuge Stratos 型冷凍高速離心機，美國Thermo 公司；EYELAN-1100 型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化公司；JYS-A800 型絞肉機，九陽股份有限公司；DK-8D 型電熱恒溫水槽；MiliQ 型超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

1.3.1.1 流動相的選擇

①參考程慶紅等[9]的色譜條件并稍作修改。色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（V/V=5/95），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm，進樣量20 μL。探究不同甲醇濃度（甲醇∶水體積比分別為2∶98，7∶93，10∶90）對分離結(jié)果的影響。

②采用劉鎮(zhèn)等[10]、劉桂英等[11]的色譜條件。具體方法如下：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.007 mol/L KH2PO4-H3PO4（pH=4.0），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長254 nm，進樣量20 μL。

③使用曲欣等[12]檢測食品中嘌呤含量的色譜條件，色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為水-甲醇-冰乙酸-10%四丁基氫氧化銨（V/V/V/V=879/100/15/6），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm，進樣量10 μL。探究最佳離子對試劑濃度。

1.3.1.2 流速的確定 使用選定的最佳流動相，保持其它色譜條件不變，分別以流速0.8，1.0，1.2，1.4 mL/min 對4 種嘌呤進行分離，確定4 種嘌呤分離的最適流速。

1.3.1.3 檢測波長的確定 配制質(zhì)量濃度為10 mg/L 的4 種嘌呤溶液（腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤），在200～400 nm 范圍對其進行全光譜掃描，找出最適檢測波長。

1.3.2 樣品處理 將海水魚去鱗，取魚皮、腹部魚肉、背部魚肉、魚眼睛、內(nèi)臟，用絞肉機將其絞碎，分類保存。

1）準確稱取0.2000 g 樣品加入8 mL 超純水，超聲提取150 min，將提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，以10 000 r/min 離心10 min，取上清液用超純水定容10 mL[13-14]，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾備用。

2）準確稱取0.2000 g 樣品加入2 mL 6%高氯酸，震蕩40 s 使其混合均勻，水浴60 min 并分別在30，40，50 min 時震蕩40 s，提取液冰浴冷卻。用氫氧化鉀溶液調(diào)pH 值至7，濾去沉淀，用甲酸將pH 值調(diào)至3.6，用最終確定的流動相定容10 mL[15]，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，備用。

3）參照Havlik J 等[16]的樣品處理方法，稱取0.2000 g 絞碎的樣品置于50 mL 離心管中，加入5 mL 三氟乙酸及5 mL 甲酸，85 ℃水浴15 min 后迅速冷卻，然后于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘余物用10 mL 確定的最適流動相復(fù)溶。將復(fù)溶后的液體以3 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液過0.45 μm 濾膜，備用。

1.3.3 標準曲線的制作 配制1 600 mg/L 的單一標準儲備液，4 ℃冰箱保存。檢測前取等體積的4種嘌呤單一標準儲備液，配制質(zhì)量濃度為400 mg/L 的混合標準儲備液，用超純水稀釋混標，配制質(zhì)量 濃 度 分 別 為300，200，100，50，10，5，1，0.5，0.1 mg/L 的系列梯度溶液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后進行色譜分析。以峰面積（Y）及樣品質(zhì)量濃度（X）作標準曲線，以3 倍信噪比（S/N）所對應(yīng)的濃度為檢出限（limits of detection，LOD）。

1.3.4 方法精密度 將300 mg/L 的混合標品用已確定的最佳色譜方法連續(xù)進樣6 次，根據(jù)測定量計算其相對標準偏差（RSD）。

1.3.5 重復(fù)性試驗 取大菱鲆背部魚肉樣品6份，每份0.2000 g，按照確定的最佳嘌呤提取方法處理樣品。將6 份處理的樣品用選定的色譜條件進行高效液相色譜檢測，根據(jù)測定量計算其相對標準偏差（RSD），檢驗水解方法的重現(xiàn)性。

1.3.6 加標回收率 準確稱取大菱鲆魚肉樣品12 份，每份0.2000 g。使用最佳嘌呤提取方法對12 份樣品進行處理，按照1.3.1 節(jié)確定的最適色譜條件測定其嘌呤含量。之后，按每種嘌呤含量的0.5，1，2 倍加入嘌呤標品，配制成低、中、高3 個濃度，上機檢測。每個樣品測定3 次，求回收率和相對標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化的色譜條件

2.1.1 流動相 采用V甲醇∶V水=5∶95、0.007 mol/L KH2PO4-H3PO4（pH=4.0）及水-甲醇-冰乙酸-10%四丁基氫氧化銨（V/V/V/V=879/100/15/6）作為流動相，測定嘌呤標準品中4 種嘌呤的含量。

當以V甲醇∶V水=5∶95 為流動相時，結(jié)果如圖1a 所示，4 種嘌呤中只能分離出3 種嘌呤，從左到右依次為鳥嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤，無法使4 種嘌呤分離。這與程慶紅等[17]對嘌呤標品的檢測結(jié)果相差較大，推測可能與色譜柱型號有關(guān)。程慶紅等[17]選用TC-C18色譜柱，而本文用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 色譜柱。兩種色譜柱雖均為C18色譜柱，但采用的填料技術(shù)不同。前者采用多孔硅膠微球，后者使用高純度硅膠，高純度的硅膠填料在色譜檢測中與流動相中的水相溶液親和度高。當其流動相中水所占比重較大時，使用TCC18色譜柱可以更好地保留極性化合物。另外，調(diào)節(jié)兩種流動相的體積比：甲醇∶水分別為2∶98，7∶93，10∶90，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇的添加量對嘌呤的分離度影響雖不大，但仍無法將4 種嘌呤完全分離。最終判定此流動相不適合多組分嘌呤分離。V甲醇∶V水=10∶90 的分離結(jié)果見圖1b。

圖1 嘌呤標準品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standards solution

使用劉鎮(zhèn)等[10]、劉桂英等[11]選出的最佳流動相0.007 mol/L KH2PO4-H3PO4（pH=4.0）對4 種嘌呤進行分離，結(jié)果如圖2所示，相較甲醇-水流動相，磷酸鹽可使4 種嘌呤基線分離，色譜峰從左到右依次為鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤，鳥嘌呤及腺嘌呤峰面積較小而未達到理想分離效果?，F(xiàn)有研究表明[18]，嘌呤有極性，而KH2PO4-H3PO4極性較小，兩者極性的差異導(dǎo)致嘌呤與流動相間結(jié)合不緊密，最終致使色譜圖中峰面積較小。本文參照毛玉濤等[19]的方法向KH2PO4-H3PO4中加入少量的（5%，10%）甲醇溶液，增加流動相極性，改善與周圍介質(zhì)的親和作用[20]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在磷酸二氫鉀緩沖液中添加甲醇雖對4 種嘌呤的分離效果影響不大，但仍存在峰面積較小的問題。曲欣[21]在KH2PO4-H3PO4基礎(chǔ)上添加少量甲醇，同樣發(fā)現(xiàn)甲醇對多組分嘌呤分離度影響較小，與本試驗結(jié)果相同。此外，使用純磷酸鹽作為流動，除以上峰面積較小的問題外，還存在色譜柱被鹽分腐蝕的危險，使柱壓升高，柱效下降，因此不建議使用。

圖2 嘌呤標準品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of standards solution

曲欣[21]將10%四丁基氫氧化銨、冰醋酸、超純水、甲醇以V/V/V/V=6/15/879/100 的比例混和，使腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤成功分離。流動相的4 種成分中甲醇用來改變流動相極性，提高分離效率。冰乙酸可以調(diào)節(jié)流動相pH，保持嘌呤活性，幫助嘌呤從固定相中分離[22]，提高檢測準確度。而四丁基氫氧化銨可與嘌呤生成中性離子，增強與非極性相的作用。在文獻[21]的基礎(chǔ)上探究了20%，30%，40%四丁基氫氧化銨對嘌呤分離效果的影響（見圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)當四丁基強氧化銨含量為10%時，4 種嘌呤不能基線分離且黃嘌呤有拖尾現(xiàn)象，可能是由于黃嘌呤中含有N 原子，N 原子與C18色譜柱上的硅醇基相互作用，當不加入離子對試劑或離子對試劑濃度較小時會產(chǎn)生嚴重的拖尾現(xiàn)象[23]。應(yīng)提高四丁基氫氧化銨濃度。20%，30%及40%的四丁基氫氧化銨分離效果較好，無拖尾現(xiàn)象，保留時間較為接近，其中20%的四丁基氫氧化銨峰值較高且節(jié)約流動相。最終選擇其作為流動相中四丁基氫氧化銨最適含量。

圖3 不同濃度四丁基氫氧化銨對分離效果的影響Fig.3 Influence concentrtion of Tetrabutyl ammonium hydroxide on purine bases separation

2.1.2 流速 選用水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氫氧化銨（V/V/V/V=879/100/15/6）為流動相，保持柱溫、檢測波長、進樣量與曲欣[21]方法一致，分別以流速0.8，1.0，1.2，1.4 mL/min 對4 種嘌呤進行分離。結(jié)果表明：使用以上流速，4 種嘌呤均在10 min 內(nèi)分離，當流速為0.8 mL/min 時分離度增加，分離效果提高，峰型較好。隨著流速的增大，保留時間縮短，當流速為1.4 mL/min 時色譜峰擴張降低，峰形較為尖銳，分離度下降，樣品中的雜峰難以分開，降低檢測準確度。高流速使柱壓升高，更易損壞色譜柱，縮短其使用壽命[24]。多數(shù)研究者采用1.0 mL/min 作為檢測流速，從圖4可以看出，0.8 mL/min 時的分離度略大于1.0 mL/min 的分離度，有利于分離樣品中的雜峰，提高檢測準確度，更好地保護色譜柱。綜上所述，本研究選用流速0.8 mL/min 為檢測流速。

圖4 不同流速下嘌呤的分離效果Fig.4 Effect of flow velocity on purine bases separation

2.1.3 檢測波長 對4 種嘌呤（腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤）在波長200～400 nm 范圍進行全光譜掃描，結(jié)果見圖5。從紫外吸收光譜圖上可以看出4 種嘌呤在200～300 nm 之間有吸收峰。腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤及黃嘌呤紫外最大吸收波長分別為267，273，254，279 nm。目前，嘌呤檢測所使用的紫外波長較多，Pi?eiro-Sotelo M 等[18]、Inazawa K 等[25]、劉鎮(zhèn)[10]等分別在紫外波長255，260，254 nm 處檢測食品中的嘌呤。本試驗中分別選擇254，260，270 nm 作為檢測波長，結(jié)果差異不顯著。最終本試驗選用254 nm 作為檢測波長。

經(jīng)優(yōu)化，最終選用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氫氧化銨（V/V/V/V=879/100/15/6）為流動相，設(shè)置流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm，進樣量10 μL 為色譜條件，檢測海水魚中的嘌呤含量。

2.2 樣品前處理方法

參照程慶紅[13]、李楠[14]、Rong S 等[15]、Havlik J 等[9]的樣品處理方法對大菱鲆魚肉分別進行超聲、高氯酸以及混合酸（V三氟乙酸∶V甲酸=1∶1）處理。采用2.1 節(jié)確定的色譜條件對處理樣品的嘌呤含量進行檢測。圖6顯示3 種處理方式的大菱鲆魚肉樣品嘌呤檢測結(jié)果，3 種方式均可將4 種嘌呤從食品中提取出來。其中使用三氟乙酸-甲酸處理樣品得到的嘌呤提取率最高，其次為高氯酸提取法，再次為超聲提取法。這是由于高氯酸使嘌呤降解，檢測峰面積減小。使用高氯酸操作繁瑣、費時并伴有大量有毒氯氣[26]，一般不建議使用。超聲提取法只用水作為提取劑，操作簡單，然而嘌呤提取率較低。當使用三氟乙酸、甲酸混合提取法作為樣品的處理方法時，可以很好地水解核苷和核苷酸，嘌呤提取率高，可能與甲酸對嘌呤的保護作用及三氟乙酸使嘌呤充分溶解有關(guān)[27]。本試驗最終選用混合酸對樣品進行處理。

2.3 標準曲線

采用2.1 節(jié)最終確定的液相色譜條件檢測混合標品中的4 種嘌呤，以峰面積（Y）及樣品質(zhì)量濃度（X）作線性回歸。線性關(guān)系及檢出限結(jié)果見表1。4 種嘌呤在0.1～400 mg/L 質(zhì)量濃度范圍線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R）均高于0.9998。檢出限在0.0465～0.1056 mg/L 之間。

圖5 嘌呤紫外吸收光譜圖Fig.5 UV absorption spectrum of purine

圖6 不同嘌呤提取方法的樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of different purine extraction methods

表1 線性試驗結(jié)果Table1 Results of linear relation

2.4 方法精密度

相對標準偏差結(jié)果見表2，相對標準偏差均小于0.7000%，表明本試驗建立的高效液相色譜檢測方法精密度良好，重現(xiàn)性高，可應(yīng)用于樣品檢測。

表2 HPLC 檢測精密度試驗結(jié)果Table2 The precision result of HPLC test

2.5 重復(fù)性

按照2.1 節(jié)、2.2 節(jié)確立的樣品處理及色譜方法對大菱鲆魚肉樣品中的嘌呤進行提取和測定，結(jié)果顯示：腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤4 種嘌呤含量的RSD 分別為1.2421%，0.9711%，0.8836%，1.9727%，重復(fù)性較好。

2.6 加標回收率

加標回收試驗結(jié)果見表3，腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤平均回收率分別為95.9460%，94.2888%，102.9188%，95.0948%，說明采用1.3.2節(jié)樣品處理方法可有效減少嘌呤損失，能較好地提取樣品中的嘌呤。

表3 加標回收試驗結(jié)果表（n=3）Table3 Recovery rates of samples with added specimen（n=3）

2.7 樣品嘌呤含量

將樣品按照2.2 節(jié)的方法處理，并在2.1 節(jié)確定的色譜條件下檢測部分海水魚的不同可食用部分及內(nèi)臟中的4 種嘌呤，每種樣品平行測定3 次，結(jié)果見表4。

表4 樣品中4 種嘌呤的含量（mg/kg）Table4 The contents of four kinds of purine in sample（mg/kg）

（續(xù)表4）

由表4可知，不同部位的海水魚中嘌呤含量差異較大。魚肉中的嘌呤含量在779.92～1 500.00 mg/kg 之間，腹部魚肉嘌呤含量高于同種魚類背部魚肉的嘌呤含量。其中金倉魚腹部魚肉嘌呤含量高達1 456.65 mg/kg，且所有魚肉樣品中次黃嘌呤含量較高；魚皮樣品中嘌呤總量在853.25～2 600.00 mg/kg 間，不同種類的魚，其魚皮嘌呤總量差異較大，如海鱸魚魚皮的嘌呤值為2 590.72 mg/kg，美國紅魚魚皮中嘌呤含量僅為853.28 mg/kg。此外，檢測的魚皮樣品中鳥嘌呤含量均高于其它3 種嘌呤含量，為最主要的嘌呤；不同魚內(nèi)臟中鳥嘌呤含量均最高，其次為腺嘌呤和次黃嘌呤。其中黃花魚內(nèi)臟中鳥嘌呤約占總嘌呤的54.77%，未檢出黃嘌呤值。海水魚的眼睛中含有豐富的碳五烯酸和碳六烯酸[28]，具有營養(yǎng)保健作用，成為“新晉”美食，深得消費者的喜愛，而檢測的海水魚樣品中魚眼睛的總嘌呤含量范圍在1 432.77～3 945.63 mg/kg，大菱鲆魚眼樣品中總嘌呤含量高達3 945.63 mg/kg，海鱸魚、美國紅魚總嘌呤含量次之。所有魚眼樣品中鳥嘌呤含量均較高，約占65%以上，大菱鲆樣品中更是高達96.88%。

同種海水魚嘌呤分布差異較大，所有樣品中，內(nèi)臟中的嘌呤含量始終高于魚肉中的嘌呤值，這與榮勝忠[29]的研究結(jié)果一致?；w中的嘌呤大多以核苷酸的形式存在，產(chǎn)生上述試驗結(jié)果可能是因內(nèi)臟代謝率較高所致。此外，不同種類魚的魚皮、魚眼睛嘌呤含量數(shù)據(jù)的差異可能與其生長環(huán)境及組織中水分含量、蛋白含量差異有關(guān)[21]。

為了預(yù)防和治療高尿酸血癥及痛風(fēng)，在食用海水魚時，建議徹底清除內(nèi)臟。魚眼睛和魚皮雖有很高的營養(yǎng)價值，但要嚴格控制其攝入量。食用魚肉時，建議消費者少食用金倉魚、海鱸魚、大菱鲆等高嘌呤含量海水魚，合理食用美國紅魚、黃花魚、踏板魚和鱈魚，且優(yōu)先食用背部魚肉。

3 結(jié)論

本試驗確立了檢測海水魚中4 種嘌呤含量的高效液相色譜法。選用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氫氧化銨（體積比879/100/15/6）為流動相，檢測海水魚中的腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤。經(jīng)方法學(xué)驗證，此方法在線性范圍（0.1～400 mg/L）線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R）在0.9998～1.0000 之間，方法檢出限為0.0465～0.1056 mg/L，高效液相色譜檢測方法精密度RSD%在0.0200%～0.7000%之間。樣品處理重復(fù)性試驗結(jié)果表明腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤RSD值依次為1.2421%，0.9711%，0.8836%，1.9727%。4 種嘌呤加標回收率高于94.2888%，適用于海水魚中4 種嘌呤的測定。應(yīng)用此方法測定的部分海水魚可食用部分及內(nèi)臟的嘌呤含量數(shù)據(jù)，可為沿海地區(qū)及痛風(fēng)患者提供科學(xué)健康的飲食指導(dǎo)。