劉淑婷 王 穎，2，3* 王志輝，2 王 迪 張艷莉

（1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院 黑龍江大慶163319 2 國家雜糧工程技術(shù)研究中心 黑龍江大慶163319 3 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室 黑龍江大慶163319）

抗性淀粉（Resistant starch，RS）又稱抗酶解淀粉，是指在健康人體小腸中難以被消化降解，而在結(jié)腸中能被微生物菌群完全或部分利用，產(chǎn)生對人體有積極作用的一類淀粉[1-2]。抗性淀粉根據(jù)來源不同可分為5 種類型[3-4]，其中RS3 型抗性淀粉因較強的抗酶解性而成為研究焦點。與可消化淀粉相比，抗性淀粉消化緩慢且能在體內(nèi)發(fā)酵增加短鏈脂肪酸含量，具有降低餐后血糖，增加飽腹感，預(yù)防結(jié)腸癌，促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等功效。

肖兵[5]和騫宇[6]等研究發(fā)現(xiàn)不同品種及不同類型的抗性淀粉發(fā)酵后產(chǎn)生的短鏈脂肪酸種類和含量存在顯著性差異。Zhang 等[7]采用壓熱-酶解法制備玉米抗性淀粉；Lu 等[8]采用超聲波-酶解法制備豌豆抗性淀粉；Mutlu[9]采用微波輻射法制備高直鏈玉米抗性淀粉，兩種方法聯(lián)用均可有效提高抗性淀粉得率。然而，目前傳統(tǒng)方法多采用單一超聲波處理或微波輻射法聯(lián)合酶解法制備抗性淀粉，超聲-微波協(xié)同方法較少，且原材料主要為高直鏈玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、香蕉淀粉等，有關(guān)雜豆類抗性淀粉研究報道較少。作為我國出口量第一的蕓豆，干蕓豆粒中淀粉含量50%～60%，其中直鏈淀粉30%～40%，而較高的直鏈淀粉含量正是促進(jìn)抗性淀粉形成的根本[10]。本研究以東北主產(chǎn)蕓豆為原料，優(yōu)化制備工藝條件，探究抗性淀粉結(jié)構(gòu)特性，拓寬抗性淀粉來源，為抗性淀粉的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花蕓豆，市售；普魯蘭酶（1 000 ASPU/g）、葡萄糖淀粉酶（100 000 U/mL）、耐高溫α-淀粉酶（20 000 U/mL），上海源葉生物有限公司；直鏈淀粉（＞99%）、支鏈淀粉，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；鹽酸、氫氧化鈉等試劑均為分析純級。

1.2 主要儀器

CW-200A 超聲-微波協(xié)同反應(yīng)儀，上海新拓分析儀器科技有限公司；A360 紫外分光光度計，上海翱藝儀器有限公司；Nicolet 6700 傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher 公司；GPC-50 常溫凝膠色譜儀（配RI230 示差折光檢測器），安捷倫科技有限公司；JSM-7800F 型掃描電鏡，日本電子株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 蕓豆抗性淀粉的制備

1）蕓豆淀粉提取工藝流程 紫花蕓豆→清洗、浸泡→去皮→干磨、過篩→蕓豆粉→脫脂→堿液浸提（料液比1 ∶7 g/mL，NaOH 溶液0.2 g/100 mL）→反復(fù)離心（3 000 r/min，10 min）→收集沉淀（呈白色）→調(diào)節(jié)pH 值至中性→離心→烘干→粉碎、過篩→蕓豆淀粉

2）抗性淀粉的制備 稱取3.5 g 蕓豆淀粉于錐形瓶中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的淀粉懸浮液。設(shè)置超聲-微波協(xié)同反應(yīng)儀溫度40 ℃、微波功率300 W、處理20 min。調(diào)節(jié)pH=5.0，添加普魯蘭酶（9 ASPU/g 干基），在溫度55 ℃恒溫振蕩酶解10 h，沸水浴滅酶10 min。121 ℃壓熱30 min，流水冷卻至室溫，4 ℃老化24 h。烘干老化淀粉（50 ℃，12 h），高速粉碎、過80 目篩，即得蕓豆抗性淀粉。

1.3.2 單因素試驗 以抗性淀粉得率為指標(biāo)，考察淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲-微波時間、普魯蘭酶添加量和微波功率對抗性淀粉得率的影響，考察的因素水平如表1所示?？疾靻我蛩貢r，固定其余反應(yīng)條件：淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、超聲時間20 min、微波功率300 W、溶液pH 5.0、普魯蘭酶（9 ASPU/g 干基淀粉）、酶解10 h。

表1 單因素試驗因素與水平Table1 The factor and level of single factor experiment

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化蕓豆抗性淀粉制備工藝 結(jié)合響應(yīng)面試驗設(shè)計原理，篩選優(yōu)化淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時間、普魯蘭酶添加量和微波功率工藝參數(shù)，以抗性淀粉得率Y 為響應(yīng)值，設(shè)計Box-Behnken 中心組合試驗確定最佳工藝條件，響應(yīng)面因素水平設(shè)計如表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計因素水平表Table2 The factor level table of response surface design

1.3.4 抗性淀粉得率測定 參照Goni[11]、宋洪波[12]的方法純化抗性淀粉，并作適當(dāng)改進(jìn)。取純化后的抗性淀粉1.0 g 加入5 mL KOH 溶液（2 mol/L），劇烈震蕩溶解、沉淀；調(diào)節(jié)pH 值至4.0～4.5，加入過量的葡萄糖淀粉酶，60 ℃恒溫震蕩60 min，滅酶5 min，冷卻，4 000 r/min 離心10 min，收集上清液，水洗沉淀并離心，反復(fù)3 次，合并上清液，用蒸餾水定容100 mL。

用DNS 法測定還原糖的含量，計算蕓豆抗性淀粉得率：

式中：Y——抗性淀粉得率/%；M——還原糖含量/g；M1——淀粉干基質(zhì)量/g。

1.3.5 顆粒形態(tài)掃描 取少量樣品，均勻涂抹于導(dǎo)電膠上，固定在樣品臺上噴金處理，掃描電鏡觀察，拍攝不同放大倍數(shù)的樣品顆粒形態(tài)顯微照片，選擇具有代表性照片分析研究[13]。

1.3.6 紅外光譜掃描 稱取干燥樣品2.0 mg，磨細(xì)干燥的KBr 粉末200 mg，于研缽中充分研磨，混合均勻，壓片，用傅里葉紅外光譜儀全波段掃描，設(shè)置掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1[14]。

1.3.7 碘吸收曲線及平均聚合度測定 稱取樣品20 mg，用無水乙醇潤濕，吸取1 mL 氫氧化鉀溶液（2 mol/mL）充分溶解樣品。調(diào)節(jié)溶液pH 6.0～7.0，用去離子水定容50 mL。取10 mL 定容液與2 mL碘液混合，用去離子水定容100 mL。用紫外分光光度計于波長450～800 nm 范圍掃描樣液[15]。根據(jù)Banks[16]公式計算平均聚合度（DP）：

1.3.8 分子質(zhì)量測定 參照吳小婷[17]和Naguleswaran 等[18]的方法，稱取樣品20 mg，用流動相做前處理。凝膠色譜儀操作條件：色譜柱型號：Waters Styragel（7.8 mm×300 mm）；流動相：VDMSO∶V水相=1∶2，流速0.8 mL/min，柱溫45 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 用Design Expert 8.0.6 和SPSS 20 軟件分析和處理數(shù)據(jù)，用Excel、Origin 軟件繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

由圖1a 可見，隨著淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，抗性淀粉得率呈先增大后減小趨勢。較低或較高的淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不利于抗性淀粉的形成，淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時，淀粉分子分散在溶液中不易接觸碰撞，分子間無法締合形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)[19-20]；淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時，顆粒的聚集和凝沉導(dǎo)致淀粉在后續(xù)反應(yīng)中無法充分糊化和酶解，阻礙了大分子鏈斷裂形成短直鏈淀粉分子[21]。

由圖1b 所示，固定微波功率300 W，延長超聲時間，可提高抗性淀粉得率。延長超聲時間，抗性淀粉得率未增加卻略有減小，推測超聲波加速溶液中聚合物分子間摩擦，降解淀粉分子，將長鏈分子切割成短直鏈淀粉分子，通過改變分子聚合度，間接影響抗性淀粉得率。

由圖1c 所示，抗性淀粉得率隨普魯蘭酶添加量的增加逐漸升高。推測淀粉顆粒糊化后吸水膨脹使結(jié)晶區(qū)氫鍵斷裂，小分子淀粉溶出，酶直接作用于支鏈淀粉α-1，6-糖苷鍵，水解形成較多游離的直鏈淀粉分子，促進(jìn)老化過程中分子重排。酶過量還可能促進(jìn)淀粉分子過分水解，分子鏈聚合度太低而不易形成抗性淀粉。

圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1 Results of single factor experiment

由圖1d 所示，隨著微波功率的增大，抗性淀粉的得率逐漸升高，然而過大的微波功率使抗性淀粉得率呈緩慢降低趨勢，推測較高的微波功率使體系迅速升溫，大量能量聚集在淀粉凝膠中，使其受熱不均勻；淀粉顆粒在水分氣化作用下吸水膨脹破裂，部分分子被過度降解，不利于重結(jié)晶形成抗性淀粉[22]。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計與分析 采用Design Expert 8.0.6 中Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計超聲-微波輔助酶解法制備蕓豆抗性淀粉參數(shù)，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。利用Design Expert 8.0.6 軟件回歸分析。

表3 Box-Behnken 試驗設(shè)計及抗性淀粉得率Table3 Box-Behnken test design and the yield of resistant starch

根據(jù)二次回歸方程的方差分析及顯著性檢驗分析可知：模型P 值小于0.0001，回歸方程模型達(dá)到極顯著，失擬項不顯著，回歸方程模型成立，R2=97.10%，大于90%，表明方程模型與實際試驗結(jié)果具有良好的擬合度和相關(guān)性，此模型可優(yōu)化超聲-微波輔助酶解法制備蕓豆抗性淀粉的工藝，判斷抗性淀粉得率。

回歸方程模型中一次項、二次項均達(dá)到顯著水平（P＜0.05，P＜0.01），表明A、B、C、D 4 個因素對抗性淀粉得率的線性效應(yīng)、曲面效應(yīng)顯著。根據(jù)4 個因素對響應(yīng)值影響程度得出其對抗性淀粉得率的影響順序：微波功率＞淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞普魯蘭酶添加量＞超聲時間。二次多項回歸模型如下：

Y = 24.2 + 1.0 A+0.51 B + 0.99 C+1.72 D -0.84 AC-1.04 BC-0.96 BD-0.85 CD-2.69 A2-2.54 B2-2.07 C2-3.66 D2

2.2.2 交互作用分析 由圖2可知，各因素交互作用的等高線呈橢圓形，說明交互作用顯著；響應(yīng)曲面圖開口向下，說明方程有極大值；圖2c、2d 的等高線較圖2a、2b 密集，表明BD、CD 交互作用對抗性淀粉得率影響更顯著。經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件確定超聲-微波輔助酶解法制備紫花蕓豆抗性淀粉的最佳工藝參數(shù)：淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.83%，超聲時間20.08 min，普魯蘭酶添加量12.46 ASPU/g，微波功率310.94 W，此條件下蕓豆抗性淀粉得率預(yù)測值為24.55%?？紤]實際操作的可行性與準(zhǔn)確性，確定最佳工藝參數(shù)為淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%，超聲20 min，普魯蘭酶添加量12.5 ASPU/g，微波功率300 W。平行試驗3 次，紫花蕓豆抗性淀粉得率為（24.37±0.41）%，接近模型預(yù)測值，表明該回歸模型能準(zhǔn)確預(yù)測抗性淀粉得率。

圖2 各因素交互作用影響蕓豆抗性淀粉得率的響應(yīng)面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot of the interaction of various factors on the yield of cowpea resistant starch

2.3 顆粒形貌分析

用掃描電鏡直接觀察樣品表面細(xì)微結(jié)構(gòu)，通過電子束與樣品間相互作用獲取被測樣品形貌特征，通過分析物質(zhì)的顆粒形貌，說明物質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)與內(nèi)在性質(zhì)間的關(guān)系。紫花蕓豆淀粉及抗性淀粉顆粒形貌掃描圖如圖3所示。蕓豆淀粉顆粒飽滿完整，分布均勻，大小不一，呈腎形或不規(guī)則球形，部分呈圓形，表面光滑；紫花蕓豆抗性淀粉顆粒呈不規(guī)則且棱角分明的多邊形結(jié)構(gòu)，質(zhì)地緊密，表面粗糙，橫斷面呈片層狀結(jié)構(gòu)[23]，推斷超聲波的高頻率振動使淀粉溶液中的微小泡核重復(fù)生長、閉合，產(chǎn)生空化作用[24]。其緊密的片層狀結(jié)構(gòu)可能因微波輻射導(dǎo)熱而使直鏈淀粉分子快速從原淀粉顆粒中溶出，結(jié)晶區(qū)吸水膨脹，后經(jīng)脫支酶直接作用于α-1，6-糖苷鍵，使其斷裂，形成適宜結(jié)合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的短直鏈淀粉分子，淀粉分子在老化回生過程中憑借分子間氫鍵及范德華力重新形成有序的無規(guī)則穩(wěn)定晶體結(jié)構(gòu)。

圖3 紫花蕓豆淀粉及抗性淀粉顆粒形貌掃描圖（500×）Fig.3 Scanning diagram of the morphology of purple kidney bean starch（a）and resistant starch（b）（500×）

2.4 紅外光譜分析

蕓豆淀粉及抗性淀粉的紅外光譜掃描圖如圖4所示。蕓豆淀粉及抗性淀粉譜線走勢相同，均在2 929.35，1 648.33，930.00，859.07，766.3 cm-1處出現(xiàn)特征吸收峰，分別對應(yīng)C-H 伸縮振動峰，C=O振動吸收峰以及指紋區(qū)的C-O，C-C 伸縮振動峰和C-H 面外彎曲振動吸收峰，說明抗性淀粉在制備過程中未生成新的官能團(tuán)，只是原淀粉分子鏈的有序重排過程[25-26]。與原淀粉相比，蕓豆抗性淀粉在1 019.70 cm-1處吸收峰較寬，此吸收峰于淀粉結(jié)晶區(qū)和無定型區(qū)之間，對應(yīng)淀粉老化的特征吸收峰，推測是淀粉分子老化過程中氫鍵的締合作用導(dǎo)致此吸收峰變寬。

2.5 碘吸收曲線及平均聚合度

圖4 蕓豆淀粉及抗性淀粉紅外光譜掃描圖Fig.4 Infrared spectrum scan of different varieties of cowpea starch and resistant starch

圖5 蕓豆淀粉及抗性淀粉碘吸收曲線Fig.5 Iodine absorption curve of kidney bean starch and resistant starch

淀粉與碘形成有色絡(luò)合物，該絡(luò)合物在特定波長范圍內(nèi)的最大吸收波長和吸收峰的變化直接關(guān)系淀粉分子鏈長和平均聚合度[27]。蕓豆淀粉及抗性淀粉碘吸收曲線如圖5所示。相同吸收波長處的抗性淀粉吸光度遠(yuǎn)大于蕓豆淀粉，說明抗性淀粉中直鏈淀粉含量明顯高于蕓豆淀粉，這與張煥新的研究結(jié)果一致[28]。由表4可知，蕓豆抗性淀粉的最大吸收波長和平均聚合度均顯著低于原淀粉，推測較大的平均聚合度使淀粉分子間存在較強的排斥作用，在超聲-微波的聯(lián)合外力作用下淀粉分子震動摩擦增加分子間排斥力，使壓熱和酶解脫支處理更易將相互排斥的分子鏈切割斷裂，增加短直鏈分子的數(shù)量和移動速度，利于淀粉分子在老化過程中重結(jié)晶形成穩(wěn)定三維空間結(jié)構(gòu)，降低分子聚合度，同時促進(jìn)抗性淀粉形成。

2.6 分子質(zhì)量分析

淀粉作為一種高分子聚合物，其理化性質(zhì)與分子質(zhì)量、分子質(zhì)量分布密切相關(guān)，通常利用凝膠滲透色譜分離此類聚合物中不同體積和相對分子質(zhì)量的分子[29]，其中重均分子質(zhì)量（Mw）和數(shù)均分子質(zhì)量（Mn）分別決定聚合物中高分子質(zhì)量部分和低分子質(zhì)量部分；多分散系數(shù)（Mw/Mn）決定分子質(zhì)量分布范圍，分散系數(shù)值越接近1 表明物質(zhì)組分越單一，分散系數(shù)值大于1 表明分子質(zhì)量分布越寬[30]。蕓豆淀粉及抗性淀粉分子質(zhì)量如表5所示。蕓豆抗性淀粉的Mw/Mn 低于原淀粉，說明制備抗性淀粉過程中體系組分單一化，分子質(zhì)量分布更集中，符合2.5 節(jié)中抗性淀粉平均聚合度變小的結(jié)果。推斷超聲波的機(jī)械力及微波輻射的熱能將體系中長支鏈淀粉分子降解為短支鏈組分，降低直、支鏈淀粉比例[31]，導(dǎo)致分散系數(shù)降低，而壓熱酶解過程重新形成適合重結(jié)晶的直鏈淀粉長度，使直鏈淀粉分子在老化過程聚合，更易形成凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

表4 蕓豆淀粉及抗性淀粉平均聚合度Table4 Average polymerization degree of cowpea starch and resistant starch

表5 蕓豆淀粉及抗性淀粉分子質(zhì)量Table5 Molecular quality of kidney bean starch and resistant starch

3 結(jié)論

1）響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到超聲-微波協(xié)同酶法制備蕓豆抗性淀粉的最佳工藝條件：淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%、普魯蘭酶添加量12.5 ASPU/g、微波功率300 W、超聲-微波處理20 min，此時抗性淀粉得率最高為（24.37±0.41）%。

2）超聲-微波處理及酶解脫支作用破壞淀粉顆粒表面結(jié)構(gòu)，在制備抗性淀粉過程中不產(chǎn)生新的官能團(tuán)。

3）超聲-微波處理及酶解脫支作用使抗性淀粉的平均聚合度降低；抗性淀粉的多分散性降低，使分子質(zhì)量分布范圍變窄。