蔣予箭 何炯靈 王晶晶

（浙江工商大學 杭州310018）

酵母代謝相關的發(fā)酵副產物（酯類、醇類、醛類等）形成了黃酒香氣的主體成分，對黃酒風味、品質等有著重要影響[1-3]。傳統(tǒng)用游離酵母在開放的環(huán)境中發(fā)酵[4]。有研究表明酵母菌用載體固定化后發(fā)酵可以重復利用[5-6]，這簡化了酵母擴培過程，降低了生產成本，同時載體的保護作用可以減少有害物質對其的抑制作用[7]。游離酵母的增殖倍數(shù)明顯大于固定化酵母，而香氣物質作為酵母發(fā)酵的主要副產物[8-9]。酵母增殖倍數(shù)的不同必然會導致香氣物質生成量的差異，影響黃酒的品質。對酵母進行固定化處理，是否會影響黃酒香氣物質的生成量，值得深入研究。雖然當前固定化發(fā)酵的技術比較成熟，但是研究固定化發(fā)酵對黃酒中香氣物質形成的影響鮮有報道。

目前檢測黃酒中香氣物質的方法主要有氣相色譜法[10]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[11-12]、毛細管氣相色譜法[13]、頂空固相微萃取-氣-質譜聯(lián)用法[14]等。氣相色譜法是比較常用的檢測方法，分析速度快，分離效率高，靈敏度高，應用范圍廣[15-16]。殷德榮[17]用氣相色譜法對乙醛、乙酸乙酯、甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯、乙酸、β-苯乙醇進行定量分析。胡健等[18]用氣相色譜法檢測黃酒中的香氣物質。本文采用氣相色譜法對黃酒中的特征性香氣物質進行定性、定量分析，研究發(fā)酵過程中游離酵母與5 批次固定化酵母發(fā)酵黃酒中的特征性香氣物質生成量的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米：購于超市；液化酶、糖化酶、麥曲，紹興古越龍山集團提供；酵母（Saccharomyces cerevisiae），安琪黃酒專用活性干酵母，市售。

正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯甲醛、β-苯乙醇、乙醛、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯和乙醇均為色譜級試劑。

1.2 設備與儀器

HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；TG16-WS 臺式高速離心機，湖南滬康離心機有限公司；XFB-200 型小型粉碎機，廣州鴻興機械有限公司；SPX-250B-Z 型恒溫培養(yǎng)箱，上海精密儀器儀表有限公司；酒精計，武強縣華洋儀表廠；GC-2014C 氣相色譜儀（配有FID 檢測器和AOC-20i 自動進樣器，日本島津有限公司；FFAP（30 m×0.20 mm×0.25 μm）型毛細管色譜柱，上海安因科學儀器有限公司。

1.3 工藝流程

1.4 試驗方法

1.4.1 酵母菌的活化 稱取30 g 活性干酵母加到450 mL、2%已滅過菌的葡萄糖溶液中，38 ℃活化30 min，3 000 r/min 離心10 min，棄上清液，得到底部的酵母泥。取酵母泥40 g 加入180 mL 滅菌的蒸餾水中，得到活化好的酵母菌液。

1.4.2 固定化酵母顆粒的制備 最終發(fā)酵液體積為每瓶800 mL。為了達到發(fā)酵液酵母含量為1.0×107個/mL 的試驗要求，計算800 mL 發(fā)酵液中應添加的酵母菌液的體積。將其與9 倍1.5%的海藻酸鈉溶液混勻，在37 ℃水浴條件下用10 mL 注射器（帶9#針頭）滴加到4%CaCl2溶液中[19-20]。在21℃水浴條件下固定化1 h，最后用無菌水沖洗數(shù)遍，放入0.05%CaCl2溶液中，4 ℃平衡過夜，備用。

1.4.3 發(fā)酵液的制備 糯米用粉碎機粉碎成糯米粉，過60 目篩，備用。在1 L 錐形瓶中放入250 g糯米粉和625 mL 蒸餾水，攪拌均勻后加入1 g 液化酶，在溫度為70 ℃的水浴鍋中液化60 min。將游離酵母及固定化酵母分別加入后置于28 ℃培養(yǎng)箱中主發(fā)酵5 d，然后在15 ℃后發(fā)酵15 d。

1.4.4 制備糖化液

1）糖化液（糖化劑為酶）在1 L 錐形瓶中放入250 g 糯米粉和625 mL 蒸餾水，攪拌均勻后加入1 g 液化酶，1 g 糖化酶，在溫度為70 ℃的水浴鍋中糖化60 min，離心取上清液，121 ℃滅菌20 min，備用。

2）糖化液（糖化劑為麥曲）在1 L 錐形瓶中放入250 g 糯米粉和625 mL 蒸餾水，攪拌均勻后先加入1 g 液化酶（70 ℃，液化60 min），后加入麥曲37.5 g（50 ℃，糖化4 h），離心取上清液，121℃滅菌20 min，備用。

1.4.5 酵母菌的計數(shù) 將活化好的酵母菌液稀釋至一定的倍數(shù)，用血球計數(shù)法計算酵母菌稀釋液中的酵母數(shù)。由此得到酵母菌液中的酵母數(shù)。

1.4.6 理化指標測定 酒精度測定采用蒸餾比重法[21]，總糖測定采用亞鐵氰化鉀滴定法[21]，總酸測定采用酸堿中和滴定法[21]。

1.4.7 氣相色譜測定香氣物質 用20%乙醇溶液作溶劑配制各香氣物質（正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯甲醛、β-苯乙醇、乙醛、乙酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯）的單標和混標溶液，用氣相色譜分析香氣物質，得到各香氣物質的保留時間和回歸方程。

氣相色譜檢測條件參考王晶晶[22]。色譜柱：DB-FFAP 30 m×0.20 mm×0.25 μm 毛細管色譜柱；進樣口溫度：250 ℃；分流比：25∶1；柱流量：恒流1.5 mL/min（N2）；檢測器（FID）溫度：280 ℃；補充氣（N2）：45 mL/min。升溫程序：50 ℃（2 min）→（10 ℃/min）→80 ℃→（20 ℃/min）→150 ℃→（50 ℃/min）→200 ℃（3 min）→（20 ℃/min）→230 ℃（3 min）。氫氣：40 mL/min；空氣：400 mL/min；進樣量：1 μL.

2 結果與分析

2.1 不同糖化液、發(fā)酵類型的酵母增值數(shù)比較

使游離酵母和固定化酵母分別在糖化劑為酶、麥曲的糖化液中增殖，分別計算發(fā)酵液中和固定化顆粒中的酵母數(shù)，結果見表1。

表1 酵母增殖數(shù)（個/mL 糖化液）Table1 Yeast breeding number（cells/mL saccharification liquid）

試驗結果表明，發(fā)酵5 d 后，對于固定化發(fā)酵酵母，用酶和麥曲作為糖化劑，固定化顆粒中的酵母數(shù)增值倍數(shù)分別為11 和12.3；對于游離發(fā)酵酵母，用酶和麥曲作為糖化劑，糖化液中的酵母數(shù)增值倍數(shù)分別為18.1 和22.3。從表1可以看出，固定化酵母發(fā)酵的糖化液中的酵母數(shù)遠小于固定化顆粒中的酵母數(shù)，說明固定化顆粒包埋效果好，流失少。游離酵母的增殖倍數(shù)明顯大于固定化酵母，而香氣物質主要為酵母發(fā)酵的副產物，酵母增殖倍數(shù)不同必然導致香氣物質生成量的差異。無論是固定化酵母發(fā)酵還是游離酵母發(fā)酵，糖化劑為麥曲的酵母增殖倍數(shù)大于糖化劑為酶的酵母增殖倍數(shù)。下述試驗均采用麥曲為糖化劑。

2.2 游離酵母和固定化酵母發(fā)酵過程理化指標跟蹤測定結果

為研究固定化酵母多次發(fā)酵性能的穩(wěn)定性，每次發(fā)酵結束后都將其中的固定化酵母分離出來，用于下一批次的發(fā)酵。固定化酵母第1～5 批次發(fā)酵過程中理化指標見圖1～圖3。

由圖1可以看出，游離酵母發(fā)酵的黃酒在第1 天酒精體積分數(shù)就達到5.1%，固定化酵母第1至5 批酒精體積分數(shù)分別為0.6%，1.6%，2.2%，2.7%，1.8%，遠小于游離酵母的酒精體積分數(shù)，可能是因為酵母被固定在載體內，存在傳質限制，營養(yǎng)物和氧氣有濃度梯度，導致固定化酵母一開始不能充分接觸發(fā)酵底物，生長和繁殖受到限制。發(fā)酵第2 天，固定化酵母第1 至5 批的酒精體積分數(shù)快速上升到7.2%，8.2%，8.9%，9.8%，9.3%，接近游離酵母發(fā)酵的酒精度10.0%，這說明載體內部的酵母菌經過第1 天的適應期，產酒精速率趕上游離酵母。不論是固定化酵母（第1 至5 批）還是游離酵母，在主發(fā)酵前4 d，酒精體積分數(shù)快速上升，之后緩慢升高，趨于穩(wěn)定，符合酵母發(fā)酵規(guī)律。20 d 發(fā)酵結束后，游離酵母和固定化第1 至5 批的酒精體積分數(shù)分別為14.5%，13.3%，14.1%，14.5%，13.8%，14.3%，游離酵母發(fā)酵和5 批次固定化酵母發(fā)酵的酒精體積分數(shù)沒有明顯差異。

圖2表示第1 天發(fā)酵結束后，5 批固定化酵母的總糖含量明顯高于游離酵母，這個變化與酒精體積分數(shù)的變化相關聯(lián)。5 d 主發(fā)酵結束時各批次的總糖含量比較接近，游離酵母和固定化第1至5 批的總糖分別為5.1，5.8，6.3，5.4，6.1，7.6 g/L，15 d 低溫后發(fā)酵期間總糖含量呈少量下降，最終（總）糖含量在5.1～7.6 g/L（＜15 g/L），各批次黃酒發(fā)酵正常、徹底。

圖1 游離酵母和固定化酵母發(fā)酵過程中酒精度的比較Fig.1 The comparison of alcohol degree fermented by free yeast and immobilized yeast

圖2 游離酵母和固定化酵母發(fā)酵過程中總糖的比較Fig.2 The comparison of residual sugar fermented by free yeast and immobilized yeast

圖3 游離酵母和固定化酵母發(fā)酵過程中總酸的比較Fig.3 The comparison of total acid fermented by free yeast and immobilized yeast

在酒精發(fā)酵過程中酸度有所上升，一部分原因是酵母菌糖代謝產生部分有機酸副產物使黃酒酸度略有上升，這個酸度大約不超過3.3 g/L（見游離發(fā)酵）；另一部分原因是黃酒發(fā)酵為開放式發(fā)酵，發(fā)酵過程中會有少量醋酸菌、乳酸菌等雜菌進入發(fā)酵液，雜菌繁殖產生乳酸、醋酸也會使黃酒酸度上升。從圖3結果看黃酒的酸度符合第5 批＞第4 批＞第3 批＞第2 批＞第1 批＞游離，初步判斷固定化條件下醋酸菌、乳酸菌等產酸菌的污染程度比游離發(fā)酵為甚。隨著固定化發(fā)酵批次的增多黃酒酸度呈上升趨勢，第5 批次發(fā)酵結束時黃酒的總酸含量達5.3 g/L。此值符合國家標準（GB/T13662-2008）規(guī)定的3.0～7.0 g/L（干黃酒），對口感和產品保質期無明顯影響。

綜上，固定化酵母發(fā)酵過程的總糖、酒精度、總酸變化曲線與游離發(fā)酵過程曲線差異不大，說明固定化發(fā)酵性能穩(wěn)定，重復利用率高。發(fā)酵結束時總酸含量遠小于國家標準上限值（7 g/L），雜菌污染可控。

2.3 游離酵母和固定化酵母發(fā)酵黃酒的典型香氣物質生成量的差異比較

綜合壽虹志等[23]、鮑忠定[24]、羅濤等[25]的研究和實際生產調研，確定正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇、乙醛、苯甲醛、乙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯這9 種香氣物質作為黃酒發(fā)酵過程中的典型香氣物質進行考察，它們的生成量作為黃酒香氣的定量指標。以黃酒蒸餾液為樣品，測定其中的香氣物質含量，結果見圖4。每個樣品平行進樣3 次，取平均值。

圖4 酵母游離與固定化發(fā)酵結束后各香氣物質生成量Fig.4 The aroma substances content after fermentation by free and immobilized yeast

由圖4可以看出，發(fā)酵結束時，游離發(fā)酵和固定化發(fā)酵的黃酒樣品中，正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇、乙醛、苯甲醛、乙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯這9 種香氣物質的含量比例相似，香氣物質量有可比性，說明固定化酵母發(fā)酵模式不會破壞黃酒的整體香味特性。

2.3.1 黃酒中高級醇形成的差異 黃酒中的高級醇主要是在前5 d 的主發(fā)酵過程中形成，后發(fā)酵時溫度降到15 ℃，高級醇形成速度迅速降低，如圖5所示。游離酵母發(fā)酵產物中醇類含量較高，20 d 發(fā)酵結束時正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇的總高級醇含量為680.91 mg/L，固定化酵母第1 至5 批黃酒的總高級醇含量為633.63，649.79，658.17，637.63，614.68 mg/L。

黃酒中的高級醇類物質過高是引起酒類“上頭”的重要原因[26-28]。試驗結果表明采用固定化酵母發(fā)酵，酵母的增殖倍數(shù)低于游離酵母發(fā)酵，副產物高級醇的形成量也較低，這對控制黃酒中的高級醇含量是有利的。

2.3.2 黃酒中酯類物質形成的差異 固定化酵母發(fā)酵產物中酯類物質的積累遠超游離發(fā)酵（見圖6），且黃酒中酯類總量隨固定化酵母的使用次數(shù)的增多而遞增，即：固定化第5 批（115.90 mg/L）＞第4 批（90.81 mg/L）＞第1～3 批（80.10～81.81 mg/L）＞游離酵母（55.66 mg/L）。結合圖4可看出酯類中的乙酸乙酯的生成量為固定化第5 批（64.79 mg/L）＞第2 批（47.93 mg/L）＞第1 批（45.66 mg/L）＞第4 批（44.57 mg/L）＞第3 批（42.33 mg/L）＞游離酵母（41.53 mg/L）；乳酸乙酯的生成量為固定化第5批（51.11 mg/L）＞第4 批（46.24 mg/L）＞第1～3 批（32.17～39.41 mg/L）＞游離酵母（14.13 mg/L）。20 d發(fā)酵結束時，固定化發(fā)酵黃酒的乙酸乙酯平均值49.06 mg/L 比游離發(fā)酵提高了18%，乳酸乙酯平均值41.02 mg/L 比游離發(fā)酵提高了190%。

圖5 不同發(fā)酵類型醇類總量的變化趨勢Fig.5 The variation tendency of total alcohols content during fermentation by different types

圖6 不同發(fā)酵類型酯類總量的變化趨勢Fig.6 The variation tendency of total esters content during fermentation by different types

如果把醇類、羧酸、酯類都看作酵母的直接代謝產物，那么游離發(fā)酵過程酵母的增殖倍數(shù)大，得到的酯類物質也應該是游離發(fā)酵黃酒中更多。然而，試驗結果卻相反，這表明由醇類和羧酸通過酯化反應獲得的酯類物質具有二次代謝產物的屬性，它們在固定化的顆粒內具有一定的積累-釋放效應。黃酒的酯類物質愈多，黃酒的香氣愈加濃郁[29-31]。

2.3.3 固定化發(fā)酵對黃酒香氣強度的影響 香氣強度可以用香氣活力a（OAV）來表示，它是香氣物質濃度與香氣物質閾值之比值，以此描述各香氣物質對黃酒香氣的貢獻程度。嗅覺閾值是指嗅覺器官感覺到氣味時，嗅感物質的最低濃度[32]。黃酒中的香氣物質在嗅感強度上有著很大的差異，有些組分雖在黃酒中的濃度高，但其閾值大時，它對總的香氣的貢獻不會很大。本文的嗅覺閾值主要參考文獻[33]，見表2。

各香氣物質香氣強度的和計算公式：

由表2可以看出固定酵母發(fā)酵的香氣物質最終K 值依次為13.19，13.81，13.43，12.87，13.60，這些值（除第4 外）略高于游離發(fā)酵的K 值13.10，由此得出固定化發(fā)酵釀得的黃酒的香氣不會比游離酵母釀得的黃酒差，有商業(yè)化應用的前景。

表2 發(fā)酵20 d 各香氣物質的含量（mg/L）及根據(jù)嗅覺閾值計算的總香氣強度K 值Table2 The content of the aroma substances（mg/L）and the total aroma intensity calculated by the olfactory threshold value K value after 20 d fermentation

3 結論

在實驗室條件下，分別用游離酵母和5 批次固定化酵母發(fā)酵黃酒。經主發(fā)酵5 d（28 ℃），后發(fā)酵15 d（15 ℃），游離酵母和5 批次固定化酵母發(fā)酵的黃酒酒精體積分數(shù)分別為14.5%，13.3%，14.1%，14.5%，13.8%，14.3%vol，且固定化酵母發(fā)酵過程的總糖、酒精度、總酸變化曲線與游離發(fā)酵過程曲線差異不大，表明固定化酵母發(fā)酵性能穩(wěn)定，重復利用率高。

用氣相色譜法檢測固定化發(fā)酵和游離發(fā)酵的黃酒中的9 種特征性香氣物質（包括醇類、酯類、醛類），發(fā)現(xiàn)20 d 發(fā)酵結束時游離發(fā)酵、固定化酵母第1 至5 批黃酒的總高級醇含量分別為680.91，633.63，649.79，658.17，637.63，614.68 mg/L，說明固定化發(fā)酵有利于控制黃酒中的高級醇含量；固定化酵母發(fā)酵黃酒中的酯類總量排序為：固定化第5 批（115.90 mg/L）＞第4 批（90.81 mg/L）＞第1～3 批（80.10 ～81.81 mg/L）＞游離酵母（55.66 mg/L），說明固定化發(fā)酵使得黃酒的香氣愈加濃郁。從香氣總強度K 值看，固定化發(fā)酵的黃酒香氣K 值普遍略大于游離酵母獲得的K 值，增加香氣強度。

綜上，酵母固定化發(fā)酵可以簡化酒母擴增環(huán)節(jié)，改善黃酒的香氣物質，具有深化研究和應用的價值。