趙城彬 尹歡歡 鄢健楠 劉景圣 杜 琛 牛 希 齊寶坤

（1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 長(zhǎng)春130118 2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030）

大豆中含有40%左右的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是經(jīng)濟(jì)、安全且最具發(fā)展?jié)摿Φ闹参锏鞍踪Y源之一[1]。大豆蛋白屬全價(jià)蛋白，具有良好的功能性和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含必需氨基酸，與魚(yú)、肉、蛋、奶接近，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，被廣泛應(yīng)用于食品加工中[2]。大豆分離蛋白（SPI）是大豆油工業(yè)的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量高于90%，由脫脂豆粕在低溫下除去水溶性非蛋白成分而制得，其結(jié)構(gòu)、組成和性質(zhì)與純大豆蛋白幾乎相同[3]。為了反映營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用特性，根據(jù)體內(nèi)消化情況建立體外消化模型，將復(fù)雜的體內(nèi)胃、腸消化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化成體外模擬消化體系，從而實(shí)現(xiàn)了消化特性研究的可行性和便捷性，在營(yíng)養(yǎng)成分消化吸收及有效成分生物利用等方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[4]。目前，國(guó)內(nèi)外涉及蛋白質(zhì)體外模擬消化研究對(duì)象主要為小麥蛋白、大豆蛋白和菜籽蛋白等植物蛋白[5]以及乳清蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白等動(dòng)物蛋白[6]，采用的消化酶主要包括胰蛋白酶、胃蛋白酶和胰液素等。然而，大豆蛋白分子在空間排布上具有緊密的折疊結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其對(duì)蛋白酶的消化作用不敏感[7]，這極大地降低了大豆蛋白的消化效率。Tang 等[8]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)豌豆球蛋白進(jìn)行預(yù)處理，使其緊密結(jié)構(gòu)變得松散，利于蛋白質(zhì)消化。胡少新等[9]研究指出對(duì)大豆蛋白進(jìn)行適當(dāng)?shù)募訜嶙冃蕴幚砟軌蛱岣咭鹊鞍酌该附庑?，獲得抗氧化活性強(qiáng)的功能性蛋白肽。熱處理能夠使大豆蛋白緊密的結(jié)構(gòu)展開(kāi)，變得松散，導(dǎo)致分子內(nèi)部的酶作用位點(diǎn)暴露出來(lái)，從而利于蛋白酶與作用位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)其對(duì)大豆白質(zhì)的消化作用。目前，關(guān)于熱處理下SPI 體外模擬消化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量分布鮮有研究報(bào)道，且SPI亞基組成、分子結(jié)構(gòu)與體外消化率之間關(guān)系方面的報(bào)道更是罕見(jiàn)。本試驗(yàn)對(duì)熱處理后的SPI 進(jìn)行體外模擬胃消化，利用凝膠電泳分析SPI 亞基的降解情況，采用紅外光譜法分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)體積排阻-凝膠色譜法分析蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布，探究熱處理對(duì)SPI 體外模擬胃消化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量分布的影響，為建立及評(píng)價(jià)大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)消化模式及影響SPI 消化特性的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（陜豆125），陜西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；胃蛋白酶，諾維信生物技術(shù)有限公司；三硝基苯磺酸（TNBS），美國(guó)Sigma 公司；無(wú)水乙醇、NaOH、HCl、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O 等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 設(shè)備與儀器

DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；FD 5-3 型冷凍干燥機(jī)，美國(guó)SIM公司；1600PC 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；Mini-Protean 4 電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；MAGNA-IR560 傅里葉變換紅外光譜系統(tǒng)，美國(guó)尼高力公司；HiLoad 16/60 Superdex 200、Sephadex G-75 制備級(jí)預(yù)裝凝膠層析柱，美國(guó)GE 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆分離蛋白（SPI）的制備 SPI 的制備根據(jù)Petruccelli 等[10]的方法。將脫皮、粉碎的大豆過(guò)60 目篩，采用正己烷40 ℃脫脂2 h。將脫脂豆粕與水以料液比1∶10 的比例混合，采用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至8.0，室溫下堿提1 h，然后10 000×g 離心30 min，取上清液，用HCl 溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至4.5，靜置后6 000×g 離心30 min，取沉淀，將沉淀水洗后復(fù)溶，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.0，以10 000×g 離心30 min，然后將上清液凍干，即得SPI。通過(guò)凱氏定氮法（GB/T5009.5-2010）測(cè)得SPI 中蛋白質(zhì)含量為90.84%。

1.3.2 SPI 體外模擬消化 將SPI 分散于蒸餾水中，室溫下磁力攪拌2 h，配成5%的蛋白溶液，然后對(duì)蛋白溶液進(jìn)行熱處理，熱處理?xiàng)l件分別為70℃處理20 min，85 ℃處理10 min，85 ℃處理20 min，85 ℃處理30 min，100 ℃處理20 min，然后迅速冰浴冷卻，待用。將人工模擬胃液緩沖液（pH 1.2，84 mmol/L HCl 溶液，35 mmol/L NaCl 溶液）的溫度控制在37 ℃，待體系溫度穩(wěn)定后添加胃蛋白酶（酶活3 000 U/g），使酶與底物比為1∶100，攪拌混勻后添加到蛋白溶液中，在恒定的溫度和pH條件下進(jìn)行消化反應(yīng)1 h[11]。消化結(jié)束后調(diào)節(jié)pH值至7.0，將消化產(chǎn)物凍干后4 ℃保存，備用。以未經(jīng)熱處理的SPI 消化產(chǎn)物為對(duì)照樣。

1.3.3 水解度測(cè)定 根據(jù)Adler-Nissen[12]的研究，水解度（DH）采用三硝基苯磺酸（TNBS）法測(cè)定。在弱堿性條件下TNBS 與游離氨基酸反應(yīng)生成的產(chǎn)物在波長(zhǎng)340 nm 處有吸收峰，而在酸性條件下即終止反應(yīng)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線L-Leu（0～2.0 mmol/L）。DH 的計(jì)算公式如下：

式中，AN1——蛋白水解前氨基氮的含量（mg/g 蛋白）；AN2——蛋白水解后氨基氮的含量（mg/g蛋白）；Npb——蛋白底物中肽鍵的氮含量（mg/g蛋白），大豆球蛋白的為109.2 mg/g。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）測(cè)定 蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 測(cè)定參照Yadav 等[13]的方法。樣品緩沖液：0.05 mol/L Tris-鹽酸緩沖液，2.5% β-巰基乙醇，0.02%溴酚藍(lán)，1%SDS 和5%甘油。將樣品溶于樣品緩沖液中配成3 mg/mL 的蛋白溶液，95 ℃加熱5 min 后上樣，上樣量為10 μL。濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%。濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)R250 染色，脫色后用Tanon 凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.5 傅里葉紅外光譜（FTIR）測(cè)定 FTIR 的測(cè)定參照Z(yǔ)hao 等[14]的方法。將1 mg 蛋白樣品與100 mg 溴化鉀研磨均勻后壓片，置于紅外光譜儀中測(cè)定。波數(shù)掃描范圍4 000～500 cm-1，掃描次數(shù)64 次，波數(shù)精度0.01 cm-1，分辨率4 cm-1，測(cè)定溫度25 ℃。利用Peakfit Version 4.12 軟件譜圖擬合處理，根據(jù)其峰面積計(jì)算蛋白質(zhì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.6 分子質(zhì)量分布測(cè)定 采用體積排阻-凝膠色譜（SEC-HPLC）對(duì)蛋白樣品的分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定[15]。使用Agilent 高效液相系統(tǒng)和HiLoad 16/60 Superdex 200 制備級(jí)預(yù)裝層析柱。將樣品溶于蒸餾水中配成10 mg/mL 的溶液，10 000×g 離心10 min，采用0.22 μm 濾膜過(guò)濾后上樣，上樣量為1 mL。設(shè)置柱體積為120 mL，柱溫25 ℃。Superdex 200 凝膠柱的流動(dòng)相為50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），洗脫速率為1 mL/min。SephadexG-75 凝膠柱的流動(dòng)相為0.03 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0），洗脫速率為0.5 mL/min。洗脫后于280 nm 處檢測(cè)洗脫液的吸光度。建立相對(duì)分子質(zhì)量與保留時(shí)間的回歸方程，根據(jù)保留時(shí)間估算出蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，采用SPSS V17.0 軟件進(jìn)行ANOVA 差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。采用Origin8.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度分析

在溫度為70，85，100 ℃條件下對(duì)SPI 熱處理不同時(shí)間，然后進(jìn)行體外模擬消化1 h。圖1顯示不同熱處理?xiàng)l件對(duì)SPI 水解度（DH）的影響。熱處理使SPI 消化產(chǎn)物的DH 增加，這說(shuō)明不同熱處理?xiàng)l件SPI 的消化降解有一定促進(jìn)作用，這是由于熱處理使蛋白質(zhì)變性、結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露分子內(nèi)部的活性基團(tuán)及酶結(jié)合位點(diǎn)，增加了對(duì)蛋白酶的敏感性，因此易被胃蛋白酶消化降解，導(dǎo)致DH 增加[16]。熱處理溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)均使DH 先升高后降低，且熱處理溫度對(duì)DH 的影響更顯著。在85 ℃熱處理20 min 時(shí)，DH 達(dá)到最大值。然而，100 ℃的熱處理會(huì)顯著降低DH，且低于70 ℃熱處理的樣品。這可能是由于過(guò)高的熱處理溫度使SPI嚴(yán)重變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生熱聚集，使暴露出來(lái)的酶解位點(diǎn)重新包埋，同時(shí)蛋白質(zhì)球狀分子發(fā)生變形，不易與酶分子結(jié)合，導(dǎo)致酶對(duì)蛋白質(zhì)的消化降解作用減弱。該結(jié)果與Sorgentini 等[17]的研究結(jié)果相似。

圖1 不同熱處理?xiàng)l件對(duì)SPI 水解度的影響Fig.1 Effect of different heat treatment conditions on degree of hydrolysis of SPI

2.2 SDS-PAGE 分析

不同熱處理?xiàng)l件下SPI 消化產(chǎn)物的SDSPAGE 圖譜見(jiàn)圖2。SPI 主要由具有酸性亞基（A1～4）及堿性亞基（B）的大豆球蛋白（11S）與具有α、α′及β 亞基的β-伴大豆球蛋白（7S）組成，這與Cucu 等[18]對(duì)大豆蛋白電泳分析得到的特征譜帶相似。未經(jīng)熱處理的SPI 消化產(chǎn)物11S 亞基組分幾乎被完消化降解，而7S 亞基組分并沒(méi)有被降解。Zhao 等[19]研究發(fā)現(xiàn)大豆7S 蛋白較難被胃蛋白酶消化，這與本研究結(jié)果一致。熱處理對(duì)消化產(chǎn)物的亞基組成具有顯著影響，使SPI 體外消化模式發(fā)生改變，不易消化降解的7S 亞基組分被消化降解。70 ℃熱處理20 min 和85 ℃熱處理10～30 min均會(huì)使SPI 的7S 亞基組分被完全消化（c-f 泳道），而經(jīng)100 ℃熱處理20 min 的消化產(chǎn)物電泳條帶中還可看到殘留有少量的7S 亞基組分（g 泳道），這表明影響SPI 消化性的主要因素為熱處理溫度。Peng 等[20]研究發(fā)現(xiàn)大豆多肽的緊密結(jié)構(gòu)對(duì)胃蛋白酶的水解作用具有抗性，經(jīng)熱處理使大豆蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出酶解位點(diǎn)，提高蛋白質(zhì)消化性，使原本不易酶解的7S 亞基被降解。當(dāng)熱處理溫度過(guò)高，使7S 球蛋白嚴(yán)重變性而形成熱聚集體，不易于酶與蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致部分7S 亞基組分沒(méi)有被消化，這也與本文的水解度的變化規(guī)律相符。此外，熱處理會(huì)使SPI 的11S 亞基消化程度降低，其中A 亞基只有部分被消化降解，而B(niǎo) 亞基幾乎完全被降解，形成分子質(zhì)量低于17 ku 或更低分子質(zhì)量的組分。與未經(jīng)熱處理的SPI 消化產(chǎn)物相比，經(jīng)熱處理的SPI 在消化過(guò)程中被胃蛋白酶降解成更多的低分子質(zhì)量組分。

圖2 不同熱處理?xiàng)l件下SPI 消化產(chǎn)物的SDS-PAGE 圖譜Fig.2 SDS-PAGE pattern of SPI digestion products at different heat treatment conditions

2.3 紅外光譜分析

因蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與其紅外光譜的酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）吸收密切相關(guān)，故可采用此方法分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[21]。圖3為不同熱處理?xiàng)l件下SPI 消化產(chǎn)物的紅外光譜，所有SPI 消化產(chǎn)物在酰胺I 帶（Amide I）1 600～1 700 cm-1處具有強(qiáng)吸收峰。根據(jù)Carbonaro 等[22]的方法對(duì)酰胺I帶進(jìn)行擬合，建立各二級(jí)結(jié)構(gòu)與掃描波數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系：1 650～1 660 cm-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 610～1 640 cm-1為β-折疊結(jié)構(gòu)，1 660～1 700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1640～1649 cm-1為無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，根據(jù)對(duì)應(yīng)的峰面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

不同熱處理?xiàng)l件下SPI 消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量如圖4所示。未經(jīng)熱處理的SPI 消化后，α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲含量增加，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量降低，說(shuō)明胃蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的消化主要破壞其β-結(jié)構(gòu)。熱處理能夠使消化產(chǎn)物的α-螺旋含量增加，β-折疊含量降低，而β-轉(zhuǎn)角與無(wú)規(guī)卷曲含量變化不顯著。李楊等[23]研究指出完全變性的7S 球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)也具有類似的變化趨勢(shì)。此外，相比于熱處理時(shí)間，熱處理溫度對(duì)SPI 消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響更大，導(dǎo)致α-螺旋含量先增加后降低，β-折疊含量先降低后增加。適當(dāng)?shù)募訜崾勾蠖沟鞍鬃冃?，結(jié)構(gòu)展開(kāi)，包埋在分子內(nèi)部的作用位點(diǎn)暴露出來(lái)，使蛋白質(zhì)發(fā)生解折疊，導(dǎo)致α-螺旋含量增加，β-折疊含量降低；而過(guò)高的加熱溫度使蛋白質(zhì)發(fā)生熱聚集，部分酶解位點(diǎn)重新包埋，同時(shí)變形的球狀分子不利于酶的水解，導(dǎo)致α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加[24]。這也表明高溫可能會(huì)導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)解旋，進(jìn)而通過(guò)分子間相互作用轉(zhuǎn)化為β-折疊結(jié)構(gòu)，與Carbonaro 等[25]在豆科蛋白的溶解消化關(guān)系的研究結(jié)果相似。

2.4 分子質(zhì)量分布分析

圖3 不同熱處理?xiàng)l件下SPI 消化產(chǎn)物的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of SPI digestion products at different heat treatment conditions

圖4 不同熱處理?xiàng)l件下SPI 消化產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Fig.4 Secondary structure contents of SPI digestion products at different heat treatment conditions

體積排阻-凝膠色譜（SEC-HPLC）主要是根據(jù)多孔凝膠對(duì)不同分子大小蛋白質(zhì)的不同排阻效應(yīng)進(jìn)行分離，從而測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量[26]。天然SPI 的Superdex 200 凝膠洗脫圖譜和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。其標(biāo)樣曲線的回歸方程為y=-0.0796x+6.5721，R2=0.9891。根據(jù)該回歸方程的保留時(shí)間估算出蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量[27]。表1為不同熱處理?xiàng)l件下SPI 消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布。與天然SPI 相比，未經(jīng)熱處理的SPI消化產(chǎn)物中大分子質(zhì)量肽（＞100 ku）的含量顯著降低（P＜0.05），中等分子質(zhì)量肽（10～100 ku）和小分子質(zhì)量肽（＜3 ku）的含量顯著增加（P＜0.05），而中小分子質(zhì)量肽（3～10 ku）的含量變化不顯著（P＞0.05），這說(shuō)明胃蛋白酶能夠?qū)⒋蠓肿覵PI 消化降解成小分子肽。與未經(jīng)熱處理的SPI 消化產(chǎn)物相比，升高熱處理溫度或延長(zhǎng)熱處理時(shí)間雖會(huì)增加大分子質(zhì)量肽（＞100 ku）和中小分子質(zhì)量肽（3～10 ku）的含量，但會(huì)降低中等分子質(zhì)量肽（10～100 ku）和小分子質(zhì)量肽（＜3 ku）的含量，這說(shuō)明熱處理改變SPI 消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布。這可能是由于熱變性導(dǎo)致SPI 結(jié)構(gòu)伸展，促進(jìn)了可溶性和不溶性聚集體的形成[28]。胃蛋白酶消化降解這些變性蛋白形成的聚集體時(shí)，主要生成大分子質(zhì)量肽，而小分子質(zhì)量肽及氨基酸釋放較少。Iung 等[29]在對(duì)β-乳球蛋白的消化性研究中發(fā)現(xiàn)，采用胰蛋白酶水解β-乳球蛋白會(huì)產(chǎn)生較多小分子質(zhì)量肽，而消化熱處理的β-乳球蛋白則會(huì)產(chǎn)生較多大分子質(zhì)量肽，這與本研究結(jié)果相似。

圖5 天然SPI 的Superdex 200 凝膠洗脫圖譜（a）和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線（b）Fig.5 Superdex 200 gel elution spectrum of native SPI（a）and the molecular weight distribution curve of standard samples（b）

表1 不同熱處理?xiàng)l件下SPI 消化產(chǎn)物中蛋白分子質(zhì)量分布Table1 Protein molecular weight distribution of SPI digestion products at different heat treatment conditions

3 結(jié)論

采用胃蛋白酶對(duì)熱處理后的大豆分離蛋白（SPI）進(jìn)行體外模擬消化。熱處理會(huì)使SPI 消化產(chǎn)物的水解度增加，85 ℃熱處理20 min 時(shí)，DH 達(dá)到最大值。凝膠電泳分析表明熱處理使SPI 體外消化模式發(fā)生了改變，11S 亞基消化程度降低，同時(shí)不易消化降解的7S 亞基組分被消化降解，產(chǎn)生更多低分子質(zhì)量的組分。紅外光譜分析表明熱處理的SPI 經(jīng)消化后α-螺旋含量增加，β-折疊含量降低。相比于熱處理時(shí)間，熱處理溫度對(duì)SPI 消化產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響更大。分子質(zhì)量分布分析表明：熱處理會(huì)改變SPI 消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，隨著熱處理溫度和時(shí)間的增加，大分子質(zhì)量肽（＞100 ku）和中小分子質(zhì)量肽（3～10 ku）的含量升高，而中等分子質(zhì)量肽（10～100 ku）和小分子質(zhì)量肽（＜3 ku）的含量呈下降趨勢(shì)。