魏天予，牛永武，陳啟和

(1.浙江大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)系,浙江 杭州 310058；2.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450000)

長期以來，研究人員一直認(rèn)為細(xì)胞間的信息交流僅存在于多細(xì)胞生物體內(nèi)。20世紀(jì)70年代 Eberhard[1]發(fā)現(xiàn)環(huán)境中費(fèi)氏弧菌(Vibriofisheri)菌群濃度達(dá)到一定閾值時即產(chǎn)生生物發(fā)光現(xiàn)象，引起研究者的關(guān)注。后來，研究人員在黃色粘液球菌(Myxococcusxanthus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、鏈霉菌屬(Streptomycesspp)等多種細(xì)菌中均發(fā)現(xiàn)存在細(xì)胞間交流現(xiàn)象[2]。1994年，F(xiàn)uqua等[3]首次提出了細(xì)菌群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)概念，是指微生物群體在其生長過程中，由于群體密度的增加，導(dǎo)致其生理和生化特性發(fā)生變化，顯示出少量菌體或單個菌體所不具備的特征。即通過分泌群體感應(yīng)信號分子(QSM)或自誘導(dǎo)調(diào)節(jié)分子(AI)作為小擴(kuò)散信號分子，與轉(zhuǎn)錄激活蛋白相互作用，將基因表達(dá)與細(xì)胞密度耦聯(lián)在一起。

群體感應(yīng)研究初期主要以細(xì)菌為研究對象，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)通常由自誘導(dǎo)分子、感應(yīng)分子及下游調(diào)控蛋白組成，對菌體形態(tài)、生物被膜形成、毒素分泌、生物發(fā)光等多種生理行為都具有調(diào)控作用[4]。目前，研究確定具有代表性的細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)有LuxI-LuxR型革蘭氏陰性菌系統(tǒng)和寡肽介導(dǎo)的革蘭氏陽性菌系統(tǒng)[5-6]。與細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)相比，對真菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究起步稍晚。近年研究發(fā)現(xiàn)，真菌可通過群體感應(yīng)信號分子(QSM)介導(dǎo)菌相轉(zhuǎn)化、毒素產(chǎn)生、孢子形成等生理行為。目前，已發(fā)現(xiàn)存在群體感應(yīng)現(xiàn)象的真菌主要有白色念珠菌(Canidiaalbicans)[7]、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[8]、莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)[9]、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)[10]、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)[11]、腐榆角藻菌(Ceratocystisulmi)[12]和輻射松白化菌(Ophiostomafloccosum)[13]等。在這些菌株中，圍繞白色念珠菌的群體感應(yīng)現(xiàn)象及機(jī)制研究報道較多，發(fā)現(xiàn)了其主要的QSM及其調(diào)控作用機(jī)制。

1 白色念珠菌(Canidia albicans)群體感應(yīng)研究

白色念珠菌(又稱白念珠菌，Canidiaalbicans)是一種多態(tài)性機(jī)會致病真菌，通常存在于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道，一般不引起疾病，當(dāng)機(jī)體免疫功能或防御力下降或正常菌群相互制約作用失調(diào)，該菌開始大量繁殖并改變生長形態(tài)(芽生菌絲相)侵入細(xì)胞引起疾病[14]。因此，白色念珠菌是較早被報道具有群體感應(yīng)系統(tǒng)的真菌之一，關(guān)于真菌群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制及作用靶標(biāo)等研究主要圍繞該菌展開。

1.1 白色念珠菌的群體感應(yīng)分子挖掘

20世紀(jì)70年代，研究人員發(fā)現(xiàn)白色念珠菌隨時間和環(huán)境變化呈現(xiàn)出酵母、假菌絲、菌絲等多種形態(tài)，隨后圍繞不同培養(yǎng)基組分對其形態(tài)變化的影響展開研究，以芽管形成比例為指標(biāo)，先后對羊血清、胰酶解酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基、乙酰葡糖胺、硫酸鎂、氯化錳、脯氨酸和生物素等物質(zhì)進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)：羊血清、胰蛋白酶大豆肉湯、脯氨酸、谷氨酸鹽、天冬氨酸等有利于白色念珠菌芽管的形成，而L-半胱氨酸、D-脯氨酸和一些脯氨酸結(jié)構(gòu)類似物對芽管的萌發(fā)具有抑制效果[15-17]。Warnock等[18]研究白色念珠菌的接種濃度對芽管的形成作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌體細(xì)胞密度低于106個/mL時，白色念珠菌主要為絲狀生長，絲狀菌體隨細(xì)胞生長和密度升高逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍笐B(tài)生長。后期Brown等[19]研究發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌菌體形態(tài)變化與人體致病感染具有密切關(guān)聯(lián)：白色念珠菌感染人體初期細(xì)胞密度較低，以絲狀形態(tài)生長，有利于其附著在機(jī)體表面，隨著菌體生長和細(xì)胞密度升高逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍笐B(tài)，釋放出毒力因子，從而引起人體感染。白色念珠菌的不同形態(tài)之間轉(zhuǎn)變受到多種QSM的調(diào)控，已知的白色念珠菌群體感應(yīng)分子主要有法尼醇(farnesol)、法尼酸(farnesoic acid)和酪醇(tyrosol)。

1.1.1 法尼酸和法尼醇

20世紀(jì)末，Bard等[20]和Cho等[21]通過多項研究確定白色念珠菌形成芽管的條件，揭示了抑制白色念珠菌芽管形成的群體感應(yīng)分子部分理化性質(zhì)，排除了茉莉酸酯作為白念珠菌QSM的可能性。2001年，Hornby等[22]通過總結(jié)前期工作，以6株白色念珠菌為研究對象展開群體感應(yīng)現(xiàn)象研究，通過分離純化、高效液相色譜、氣相質(zhì)譜聯(lián)用、薄層色譜等系列方法鑒定并驗證白色念珠菌中第一個群體感應(yīng)分子——法尼醇(farnesol)，主要作用是抑制白念珠菌向芽管和絲狀形態(tài)轉(zhuǎn)變。

此外，在研究中總結(jié)出法尼醇作為群體感應(yīng)分子的主要特點：①分泌到胞外并可在培養(yǎng)基中擴(kuò)散，通過洗滌可以從細(xì)胞表面去除；②在菌體生長期間，其生成量與細(xì)胞干質(zhì)量大致成正比；③實驗中6個白色念珠菌菌株均可合成；④可以抑制3種不同化學(xué)因素(L-脯氨酸、N-乙酰葡糖和血清)介導(dǎo)的發(fā)芽管形成；⑤合成取決于細(xì)胞生長而不依賴于特定的碳源或氮源；⑥可以改變細(xì)胞形態(tài)，但不改變細(xì)胞的生長速率；⑦在細(xì)胞所有生長溫度下均能產(chǎn)生，具有熱穩(wěn)定性[22]。同年，Oh等[23]通過正相和反相高效液相制備色譜提取和純化白色念珠菌調(diào)控群體感應(yīng)的物質(zhì)，利用核磁共振和質(zhì)譜法鑒定該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其為3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯酸(法尼酸)；基于對菌體生長的影響驗證研究發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)不抑制酵母細(xì)胞生長，但能抑制絲狀生長。

1.1.2 酪醇

Finkel等[24]研究發(fā)現(xiàn)白色念珠菌中另一個群體感應(yīng)信號分子是對羥苯基乙醇(又稱酪醇，tyrosol),主要作用是促進(jìn)白色念珠菌從酵母狀態(tài)到菌絲相的轉(zhuǎn)變。研究發(fā)現(xiàn)，新接種白色念珠菌細(xì)胞密度低于107個/mL 時，出現(xiàn)一個明顯的生長停滯期，初始菌體密度越低，其生長停滯期越長，主要是因為菌體細(xì)胞在被稀釋后需要進(jìn)行DNA 復(fù)制、染色體分離、細(xì)胞周期調(diào)整等，所以啟動菌體細(xì)胞的重新生長需要有較長的停滯期，但向培養(yǎng)基中加入適量酪醇可明顯縮短該停滯期。Martins等[25]通過比較基因組學(xué)方法研究酪氨醇處理對高密度培養(yǎng)白色念珠菌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的影響,發(fā)現(xiàn)低密度培養(yǎng)時，不加酪氨醇某些基因的表達(dá)量顯著降低,但添加酪氨醇后這些基因表達(dá)量并未降低，分析發(fā)現(xiàn)這些基因所編碼的蛋白主要參與了DNA合成、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等，這說明酪醇對于調(diào)整周期相關(guān)的基因表達(dá)有促進(jìn)作用[26]。

1.2 白色念珠菌QSMs的其他生理效應(yīng)

法尼醇、酪醇等白色念珠菌的QSMs被發(fā)現(xiàn)之后，一直作為病原真菌的研究熱點受到持續(xù)關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌QSMs不僅調(diào)節(jié)自身芽管、菌絲態(tài)、酵母態(tài)等多種形態(tài)之間轉(zhuǎn)變[27]，還具有多種生理學(xué)效應(yīng)，如對生物膜的形成[28]、生物體的氧化應(yīng)激[29-32]及其他微生物的生長代謝均具有調(diào)控作用[33-45]。

1.2.1 對生物被膜形成的影響

生物被膜是指細(xì)菌或真菌附著于宿主腔道或生物材料表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白或脂蛋白等，將自身包繞其中而形成的膜樣多細(xì)胞復(fù)合體。許多研究發(fā)現(xiàn)，各種真菌耐藥程度與生物被膜形成過程有關(guān),而且由生物膜引起的人體疾病感染難以根除，因為其特殊結(jié)構(gòu)對抗生素和宿主免疫因子有抗性[46]。白色念珠菌形成生物被膜過程中，細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變具有重要意義，因此白色念珠菌的QSMs對其生物被膜形成具有調(diào)控作用(圖1)。

圖1 白色念珠菌生物被膜的形成過程[27]Fig.1 Formation of Candida albicans biofilms[27]

Nickerson等[47]探究了法尼醇對生物膜發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)法尼醇不僅抑制白色念珠菌向絲狀轉(zhuǎn)變而且抑制生物膜的形成，抑制效果與法尼醇加入時間有關(guān)。當(dāng)白色念珠菌細(xì)胞開始向菌絲相轉(zhuǎn)變后，添加法尼醇對生物膜形成沒有影響，但成熟生物膜上的細(xì)胞對類異戊二烯有反應(yīng)，這種效應(yīng)可能對生物被膜的分散產(chǎn)生影響[28]。通過基因芯片方法檢測白色念珠菌調(diào)控生物被膜基因表達(dá)信息發(fā)現(xiàn)，在處理條件下，法尼醇不僅與菌絲形成相關(guān)，使得基因發(fā)生顯著變化，而且與耐藥性、細(xì)胞壁形成、細(xì)胞表面親水性、鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)和熱休克蛋白相關(guān)的基因表達(dá)也發(fā)生明顯變化。將法尼醇與環(huán)孢菌素A(cyclosporin A，CSA)聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)其對白色念珠菌生物被膜具有明顯抑制作用，與菌絲形成的相關(guān)基因(如CEK1、CPH1、EFG1、ERG11、GPR1、HAT1、HWP1、ALS3和TUP1)表達(dá)量均顯著降低。法尼醇、氟康唑、兩性霉素B或米卡芬凈對白色念珠菌生物被膜形成均有抑制作用，將它們聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)抑制生物被膜效果增強(qiáng)，其中法尼醇和米卡芬凈達(dá)到最大的協(xié)同作用[48]。

Alem等[48]發(fā)現(xiàn)白色念珠菌在37 ℃培養(yǎng)時，其生物被膜細(xì)胞也可以合成酪醇，合成量與生物被膜干質(zhì)量相關(guān)，掃描電鏡結(jié)果顯示白色念珠菌生物膜形成的早期階段加入酪醇可以刺激菌絲生長。同時加入法尼醇和酪醇，發(fā)現(xiàn)兩者對生物被膜形成具有拮抗作用，50 μmol/L法尼醇的調(diào)節(jié)效果可以被高濃度酪醇(>100 μmol/L)所抵消；當(dāng)法尼醇濃度增加到100 μmol/L時，只有1 000 μmol/L 濃度的酪醇可抵消其作用效果，但生物被膜中細(xì)胞多數(shù)為酵母狀態(tài)，說明法尼醇在菌相轉(zhuǎn)換方面的作用效果優(yōu)于酪醇。迄今為止，法尼醇抑制白色念珠菌生物膜形成和酪醇對生物被膜的影響機(jī)制尚未完全闡明，所以其仍是白色念珠菌群體感應(yīng)研究的熱點之一。

1.2.2 對生物體氧化應(yīng)激的影響

1.2.3 與其他微生物的相互作用

白色念珠菌的QSMs不僅介導(dǎo)種內(nèi)群體生理行為變化，也介導(dǎo)種間甚至不同物種間的相互作用[33]。白色念珠菌通過法尼醇對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)和多種曲霉等微生物的不同生理效應(yīng)產(chǎn)生影響，從而在多物種競爭生長中獲得優(yōu)勢。

白色念珠菌和銅綠假單胞菌通常在臨床感染中同時出現(xiàn)，兩種微生物的QS系統(tǒng)相互作用，對各自的生長繁殖、毒力因子合成等產(chǎn)生影響[34]。Hogan等[35]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)中高絲氨酸內(nèi)酯可以抑制白色念珠菌中絲狀形成但不影響其生長，還發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌能夠在絲狀白色念珠菌上形成生物膜并殺死細(xì)胞，但對酵母態(tài)細(xì)胞無此作用，這表明白色念珠菌可通過形態(tài)轉(zhuǎn)變調(diào)控與銅綠假單胞菌的生長競爭關(guān)系。相應(yīng)地，法尼醇可抑制銅綠假單胞菌的喹諾酮信號(Pseudomonasquinolone signal,PQS)合成，進(jìn)而影響毒力因子綠膿菌素的合成[36-37]。Morita等[38-39]研究發(fā)現(xiàn)25 μmol/L的法尼醇可抑制釀酒酵母生長而不影響細(xì)胞活力，這種效應(yīng)與G1細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞內(nèi)二酰基甘油(DAG)水平的顯著降低有關(guān)。此外，低濃度法尼醇可抑制Paracoccidioidesbrasiliensis由酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變[40]，高濃度法尼醇(25～300 μmol/L)能強(qiáng)烈抑制其生長繁殖。法尼醇也可以抑制Mycobacteriumsmegmatis多藥物外排泵，降低溴化乙錠和利福平的最小抑菌濃度[41]。

白念珠菌QSMs對多種霉菌生長代謝產(chǎn)生影響。加入法尼醇對構(gòu)巢曲霉芽管形成無影響，但誘導(dǎo)其凋亡[38]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉自噬體相關(guān)基因ATG8敲除菌對法尼醇更敏感，而蛋白激酶C基因敲除菌的抗性增強(qiáng)，說明法尼醇誘導(dǎo)構(gòu)巢曲霉細(xì)胞凋亡可能依賴于自噬和蛋白激酶C(PkcA)的功能[42]。與構(gòu)巢曲霉不同，法尼醇對黑曲霉的生長無明顯影響，而對其形態(tài)轉(zhuǎn)變產(chǎn)生顯著影響[43]。法尼醇也能抑制人類病原菌如煙曲霉細(xì)胞的生長[44]，可誘導(dǎo)Fusariumgraminearum細(xì)胞凋亡并對其分生孢子的形成、發(fā)育、萌發(fā)及存活產(chǎn)生影響，是潛在的新型抗真菌劑。此外，法尼醇可以抑制Candidadubliniensis菌絲和假菌絲的形成，但對其生長無抑制作用[25]。法尼醇可引起Candidaparapsilosis短暫性生長停滯，生長停滯不限于細(xì)胞周期中特定階段[50]。同時，法尼醇還能抑制C.parapsilosis生物膜的形成，主要通過影響氧化還原酶和甾醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[45]。

2 其他真菌的群體感應(yīng)現(xiàn)象和群體感應(yīng)分子

除白色念珠菌之外，近些年對其他真菌群體感應(yīng)現(xiàn)象的研究不斷展開，不同真菌中群體感應(yīng)分子種類和生理效應(yīng)各有不同。

2.1 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

同白色念珠菌一樣，釀酒酵母也可以利用群體感應(yīng)分子進(jìn)行菌體形態(tài)的轉(zhuǎn)變。Chen等[49]研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期的釀酒酵母培養(yǎng)物可以誘導(dǎo)釀酒酵母絲狀生長，提取純化鑒定后發(fā)現(xiàn)起作用的群體感應(yīng)分子是苯乙醇(phenethyl alcohol)和色氨醇(tryptosol)，這兩種芳香醇的產(chǎn)生受培養(yǎng)基氮源含量的影響，氮源豐富條件下被抑制，氮源不足時被激活。另外，Severin等[50]研究后提出釀酒酵母凋亡與其群體感應(yīng)現(xiàn)象有關(guān)，釀酒酵母菌體密度會使其基因損傷到達(dá)一定的臨界值，到達(dá)該臨界值后，通訊因子交配信息素和氨會誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

2.2 新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)

Lee等[51]在研究基因TUP1對新型隱球菌影響時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種ΔTUP1的接種量小于103時，平板上不能正常形成菌落，而接入ΔTUP1的培養(yǎng)上清液后即使接種量小于103，此菌株也可以生長，他們從該上清液中分離出活性分子QSP1。由于接種量很小，不能生長為菌落即不能稱為“群體”，由于該現(xiàn)象與細(xì)菌中的群體感應(yīng)不完全相同，因此把該分子命名為群體效應(yīng)分子。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)這是條分子量為1 136.23的11肽。這種群體感應(yīng)現(xiàn)象目前只發(fā)現(xiàn)在TUP1基因敲除菌中。

2.3 部分真菌的群體感應(yīng)分子及作用

除上述真菌外，其他一些真菌的群體感應(yīng)分子及作用如表1所示。如釀酒酵母QSMs已鑒定為苯乙醇、色氨醇，可以調(diào)節(jié)菌相。類似的還有腐榆角藻菌、輻射松白化菌、黃曲霉等真菌,其QSMs種類雖然不同，但都可以調(diào)節(jié)菌相。

表1 真菌群體感應(yīng)分子及作用Table 1 Quorum sensing molecules and effects of in different fungi

3 結(jié)論與展望

目前，真菌群體感應(yīng)系統(tǒng)研究時間不長，其開展的工作主要集中于動植物致病真菌如白色念珠菌、莢膜組織胞漿菌、新型隱球菌、粗糙脈孢菌等，發(fā)掘了部分真菌的群體感應(yīng)分子如白色念珠菌的群體感應(yīng)分子法尼酸、法尼醇和酪醇，其生理作用有調(diào)節(jié)自身芽管、菌絲態(tài)、酵母態(tài)等多種形態(tài)之間轉(zhuǎn)變，對生物膜的形成、生物體的氧化應(yīng)激及其他微生物的生長代謝均具有調(diào)控作用。本課題組對能夠造成人中心靜脈導(dǎo)管(CVC)感染，引起植物的非乙烯依賴性抗性的蚜蟲莫氏黑粉菌(Moesziomycesaphidis)進(jìn)行研究，推測其致病性與群體感應(yīng)有關(guān)，結(jié)合其分子性質(zhì)、細(xì)胞胞內(nèi)代謝特征及其結(jié)構(gòu)式推測該菌的群體感應(yīng)物質(zhì)為多元醇類，具體的準(zhǔn)確化學(xué)結(jié)構(gòu)仍有待后續(xù)深入研究。

真菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的分子受體、轉(zhuǎn)錄因子、信號傳導(dǎo)途徑及調(diào)控機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究?？衫闷涮攸c開發(fā)新型靶向抗菌藥物和針對性技術(shù)方法：近年來，在使用抗生素條件下感染多耐藥性病原微生物(MDR)的幾率增加，不僅嚴(yán)重威脅免疫受損的患者，也變成一個全球性的公共健康危機(jī)。由于病原體普遍存在耐藥性并且常規(guī)藥物開發(fā)中仍存在缺陷，根除真菌感染非常困難，因此，除了使用現(xiàn)有抗生素，借助新的聯(lián)合佐劑方法，尋求有效的抗感染治療策略。在這種情況下，群體感應(yīng)(QS)在針對高度復(fù)雜和進(jìn)化的真菌細(xì)胞間通信現(xiàn)象方面將具有巨大優(yōu)勢。除法尼醇和酪醇外，關(guān)于真菌中QSM的信息很少。除QSM以外，真菌還產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物(QSI)，可作為抗微生物劑，可用作特定疾病的廣譜抗生素。