閻 俊，趙 勇,3，謝 晶,3,4

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.上海海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；4.上海海洋大學(xué) 上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 201306)

水產(chǎn)品作為優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白的重要來源，因具有低熱量、低脂肪和高蛋白特點(diǎn)而深受廣大消費(fèi)者的青睞，是人類食譜中重要組成部分。截至2016年底，全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)6 901.25萬t，其中海水產(chǎn)品產(chǎn)量達(dá)3 490.15萬t，占總產(chǎn)量的50.57%[1]。由于水產(chǎn)品中肌肉組織所具有的水份含量、不飽和脂肪酸及可溶性蛋白質(zhì)含量較高，其在貯藏過程中極易發(fā)生腐敗變質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年因腐敗變質(zhì)而損失的海產(chǎn)品數(shù)量約占總產(chǎn)量的1/3[2]。水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)原因較為復(fù)雜，微生物的活動(dòng)是導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)的主要原因。通過對水產(chǎn)品的腐敗現(xiàn)象進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn):微生物的致腐能力存在明顯差異。隨著貯藏時(shí)間的延長，大量繁殖并導(dǎo)致腐敗的微生物被稱為優(yōu)勢腐敗菌[3]。

希瓦氏菌(Shewanellaspp)屬于革蘭氏陰性菌，作為低溫貯藏條件下常見的腐敗微生物[4]，具有較強(qiáng)的致腐活性[5-6]，能產(chǎn)生硫化氨、氨以及胺類化合物等，同時(shí)還能夠還原氧化三甲胺變成三甲胺，從而產(chǎn)生腐敗和腥臭味兒；且易黏附于食品及容器表面，形成生物被膜[7]，使食品腐敗加劇。希瓦氏菌是冷藏海產(chǎn)品中的優(yōu)勢腐敗菌，其數(shù)量已經(jīng)成為評價(jià)冷藏海產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)[8]。

目前研究發(fā)現(xiàn):從腐敗海產(chǎn)品中分離的希瓦氏菌腐敗特性受到群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)現(xiàn)象的影響[9-10]，因此研究有關(guān)QS對水產(chǎn)品的保鮮作用有著重要意義。本文中，筆者聚焦希瓦氏菌QS，較為系統(tǒng)地綜述了希瓦氏菌QS與其致腐性之間的關(guān)系，擬從QS角度出發(fā),以期為水產(chǎn)品保鮮提供新的思路。

1 群體感應(yīng)系統(tǒng)

群體感應(yīng)(QS)現(xiàn)象被首次發(fā)現(xiàn)于海洋中的費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)中[11]，經(jīng)長期研究發(fā)現(xiàn):這種現(xiàn)象普遍存在于各種細(xì)菌中，細(xì)菌間通過化學(xué)信號(hào)分子進(jìn)行信息傳遞。群體感應(yīng)系統(tǒng)由信號(hào)分子、感應(yīng)分子以及下游調(diào)控蛋白組成。當(dāng)細(xì)菌感受到自身或周圍菌體密度或環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，細(xì)菌會(huì)分泌一種被稱為自誘導(dǎo)物(autoinducers，AIs)的信號(hào)分子，當(dāng)信號(hào)分子達(dá)到一定閾值后，會(huì)激活靶基因表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)某些生理功能，這一過程被稱為QS[12]。

1.1 基于信號(hào)分子AHLs的群體感應(yīng)系統(tǒng)

高絲氨酸內(nèi)酯類化合物(AHLs)作為革蘭氏陰性菌中最常見的一類自誘導(dǎo)物，被首次發(fā)現(xiàn)于海洋微生物費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)中[13-14]。其群體感應(yīng)系統(tǒng)主要由自誘導(dǎo)物N-3-oxohexanoylhomoserine lactone (OHHL)及LuxI、LuxR蛋白組成(圖1)。OHHL由LuxI 編碼的酶合成,并且可以自由擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞。隨著細(xì)胞密度的增加，OHHL的濃度也隨之上升，OHHL在微生物的生長過程中處于較低的基礎(chǔ)濃度，但隨著細(xì)胞密度上升就會(huì)達(dá)到一個(gè)足夠的配體濃度,并與受體蛋白LuxR發(fā)生有效結(jié)合[15]。如果沒有足夠的OHHL配體，LuxR蛋白不穩(wěn)定,且會(huì)快速降解。LuxR-OHHL蛋白質(zhì)復(fù)合物作為轉(zhuǎn)錄激活因子，能誘導(dǎo)細(xì)菌發(fā)光基因LuxI的表達(dá)[16]。因此，當(dāng)自誘導(dǎo)物開始產(chǎn)生，周圍環(huán)境的信號(hào)分子就會(huì)導(dǎo)致自誘導(dǎo)物的產(chǎn)量增加，從而誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)。

圖1 費(fèi)氏弧菌LuxI/LuxR群體感應(yīng)系統(tǒng)模式圖[17]Fig.1 Schematic of the LuxI/LuxR quorum sensing system in V.fischeri[17]

事實(shí)上，在一些革蘭氏陰性細(xì)菌中發(fā)生的群體感應(yīng)信號(hào)傳遞過程通常比圖1所示的更為復(fù)雜。已經(jīng)證實(shí)了一些細(xì)菌物種可以通過使用更為復(fù)雜的信號(hào)傳輸網(wǎng)絡(luò)來進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)傳遞，其包含2個(gè)或者多個(gè)AHL信號(hào)分子，甚至涉及其他類型的群體感應(yīng)通路[18-20]。例如:銅綠假單胞菌使用了至少3種群體感應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)，其中2種AHL分子，分別為N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (OdDHL)和N-butanoyl-L-homoserine lactone (BHL)。它們是由2個(gè)獨(dú)立的信號(hào)系統(tǒng)產(chǎn)生和感知的，每個(gè)信號(hào)系統(tǒng)都涉及一個(gè)LuxI型合成酶和一個(gè)LuxR型受體。OdDHL是由LasI產(chǎn)生的，LasR是其同源受體。BHL是由RhlI合成酶產(chǎn)生，被RhlR蛋白檢測。這些依賴AHL的信號(hào)系統(tǒng)與第3個(gè)以2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolone(稱為喹諾酮假單胞菌信號(hào)或PQS)為信號(hào)分子的群體感應(yīng)系統(tǒng)集成。假單胞菌中存在著群體感應(yīng)調(diào)節(jié)的層級(jí)結(jié)構(gòu)，通過LasR觸發(fā)RhlR和PQS系統(tǒng)而被連續(xù)激活[18-20]。

1.2 基于信號(hào)分子AI-2的群體感應(yīng)系統(tǒng)

AI-2是調(diào)控革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌種內(nèi)和種間交流的一種非特異性自誘導(dǎo)物?；贏I-2的群體感應(yīng)現(xiàn)象，是19世紀(jì)90年代在革蘭氏陰性菌哈氏弧菌(V.harveyi)中被首次發(fā)現(xiàn)的[21]。在天然自誘導(dǎo)物缺乏的條件下，基于AHL群體感應(yīng)系統(tǒng)的微生物菌株仍具有生物發(fā)光的能力[22]，這就表明:還有其他群體感應(yīng)通路利用了獨(dú)特的信號(hào)分子行使了相同的功能，而這個(gè)獨(dú)特的信號(hào)分子就是AI-2。隨后Bassler等[21]證明:來自多種細(xì)菌的無細(xì)胞培養(yǎng)液能夠刺激哈氏弧菌(V.harveyi)報(bào)告菌株的活性[21]。近年來,對AI-2的群體感應(yīng)研究逐漸增多[22-27]。研究發(fā)現(xiàn):由哈氏弧菌、大腸桿菌和傷寒鏈球菌中的同一基因luxS負(fù)責(zé)AI-2的合成[23]。LuxS合成4,5-二羥基-2,3-戊二酮(DPD)，然后自發(fā)重排形成各種DPD衍生物，相互轉(zhuǎn)化，平衡存在，形成AI-2信號(hào)分子庫。DPD的環(huán)化產(chǎn)生了化合物S-DHMF和R-DHMF，但如果溶液中存在足夠的硼酸鹽，DPD就會(huì)生成硼酸酯[28]。不同的微生物菌株識(shí)別不同的DPD衍生物。AI-2庫內(nèi)分子的相互轉(zhuǎn)化就可以使細(xì)菌識(shí)別自身的AI-2以及其他細(xì)菌產(chǎn)生的AI-2。因此，AI-2可以作為種間細(xì)胞-細(xì)胞通信的通用信號(hào)[29]。已經(jīng)在70多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了這種被稱為luxS的基因[24]，luxS基因的產(chǎn)物L(fēng)uxS酶，除了負(fù)責(zé)AI-2的生物合成，在細(xì)胞中還具有代謝作用[24]，這可能為luxS的廣泛存在提供了另一種解釋[26]。

1.3 其他群體感應(yīng)系統(tǒng)

二酮哌嗪類化合物DKPs(diketopiperazine)是一種新型的QS信號(hào)分子，可同時(shí)對種間和種內(nèi)QS調(diào)節(jié)起作用[30-31]。DKPs信號(hào)分子是Stierle等[32]在1988年，于海綿共棲細(xì)菌微球菌(Micrococcusspp.)中首次發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)時(shí)共發(fā)現(xiàn)cyclo-(L-Pro-L-Ala)、cyclo-(L-Pro-L-Val)及cyclo-(L-Pro-L-Leu)3種DKPs信號(hào)分子。此后，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種具有活性的DKPs。DKPs是由2個(gè)氨基酸縮合而成的環(huán)二肽(DKP)，環(huán)二肽具有六元環(huán)骨架結(jié)構(gòu)，并且有2個(gè)氫鍵給體、2個(gè)氫鍵受體，使得DKPs非常穩(wěn)定且具有一定的功能[33]。DKPs可以作為一種交流語言,而用于革蘭氏陰性菌中細(xì)胞之間的交流，例如:DKPs可與大腸桿菌(E.coli)和紫色素桿菌的LuxR系統(tǒng)結(jié)合，繼而促進(jìn)或猝滅群體感應(yīng)。Cyclo-(D-Ala-L-Val)、cyclo-(L-Pro-L-Tyr)及cyclo-(L-Pro-L-Leu)具有激活或拮抗LuxR介導(dǎo)的細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的作用[34-35]，E.coli產(chǎn)生的cyclo-(L-Pro-L-Met)能夠有效地刺激SwrI類蛋白的突變，促進(jìn)群聚運(yùn)動(dòng)的產(chǎn)生和生物被膜的形成[33]；相反，S.liquefaciensSwrI突變株的群聚現(xiàn)象被cyclo-(L-Pro-L-Tyr)競爭性抑制[34]，抑制了LuxR系統(tǒng)的群體感應(yīng)現(xiàn)象的發(fā)生。

2 QS對希瓦氏菌致腐性的影響

希瓦氏菌是低溫儲(chǔ)藏條件下水產(chǎn)品主要的特異性腐敗菌[36-37]。水產(chǎn)品的腐敗過程復(fù)雜，微生物作用是導(dǎo)致食品腐敗的重要原因，當(dāng)腐敗達(dá)到一定程度時(shí)，可以檢測出群體感應(yīng)信號(hào)分子，因此可以通過加強(qiáng)對群體感應(yīng)的相關(guān)研究,進(jìn)而防控腐敗的發(fā)生。Zhang 等[38]研究發(fā)現(xiàn):真空冷藏條件貯存的大菱鲆貨架期終點(diǎn)的主要腐敗菌為希瓦氏菌，同時(shí)，群體感應(yīng)信號(hào)活性在貯藏期間明顯增加；并且發(fā)現(xiàn)外源群體感應(yīng)信號(hào)分子C4-HSL和C6-HSL的添加，明顯加速了冷凍大菱鲆的腐敗過程；因此，推測QS與冷藏大菱鲆的腐敗相關(guān)。

感應(yīng)現(xiàn)象不僅促進(jìn)希瓦氏菌單菌的腐敗特性,還有利于希瓦氏菌種間合作，提升腐敗能力。Zhu 等[36]利用從低溫條件下腐敗的凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)中分離出的腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)和波羅的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)進(jìn)行混菌和單菌條件下的致腐實(shí)驗(yàn)。根據(jù)細(xì)菌計(jì)數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮、三甲胺、揮發(fā)性有機(jī)化合物和感觀評定的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):凡納濱對蝦的貨架期縮短；在腐敗過程中，與希瓦氏菌種間有著一種合作關(guān)系，加強(qiáng)了相互的腐敗特性；并且發(fā)現(xiàn):添加了外源的群體感應(yīng)信號(hào)分子cyclo-(L-Pro-L-Leu)不僅促進(jìn)了微生物生長、胞外蛋白酶和膠原酶活性，也促進(jìn)了腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)和波羅的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)生物被膜的生長，增強(qiáng)了其致腐性能。這表明:依賴于cyclo-(L-Pro-L-Leu)的群體感應(yīng)有助于希瓦氏菌種間的合作。

很多學(xué)者對QS現(xiàn)象如何影響水產(chǎn)品的腐敗進(jìn)行了更深層次的研究，也給如何通過調(diào)控QS去防治腐敗提供了新的方向。Zhang 等[37]從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度去評估不同AHLs信號(hào)分子對從冷藏大菱鲆中分離出的腐敗希瓦氏菌ShewanellaputrefaciensZ4的作用。采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)對添加AHLs后的23個(gè)不同表達(dá)位點(diǎn)進(jìn)行了篩選和鑒定。通過研究發(fā)現(xiàn):在3種群體感應(yīng)信號(hào)分子AHLs(C4-HSL、C6-HSL和O-C6-HSL)存在的條件下，涉及生長和新陳代謝、環(huán)境適應(yīng)和調(diào)控的蛋白均出現(xiàn)了下調(diào)現(xiàn)象，而應(yīng)激反應(yīng)蛋白質(zhì)的豐度和DNA連接酶活性上升，外源性C6-HSL和O-C6-HSL的作用顯著。結(jié)果顯示:基于AHL的QS信號(hào)分子對腐敗希瓦氏菌的一些重要代謝特性產(chǎn)生了影響。

劉娜娜[39]發(fā)現(xiàn):通過添加4種信號(hào)分子DKPs，即cyclo-(L-Leu-L-Leu)、cyclo-(L-Pro-L-Gly)、cyclo-(L-Pro-L-Leu)和cyclo-(L-Pro-L-Phe)對致腐能力不同的希瓦氏菌株的生長和生物被膜的形成均有正調(diào)控作用,且調(diào)控強(qiáng)度不一；對致腐能力差異明顯的菌株中與腐敗相關(guān)的基因表達(dá)量的調(diào)控作用也不相同，對于氧化三甲胺還原酶基因、硫氧還原蛋白還原酶基因具有正調(diào)控作用，而對于半脫氨酸合成酶B基因具有負(fù)調(diào)控作用[9]。張笑笑[40]研究發(fā)現(xiàn):DKP-LuxR型QS系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控S.baltica73的致腐能力以及菌膜形成能力;并明確了其調(diào)控通路，通過調(diào)控torS的表達(dá)來促進(jìn)S.baltica73產(chǎn)三甲胺(TMA)和腐胺的能力；通過調(diào)控pomA的表達(dá)來促進(jìn)S.baltica73菌膜形成能力。

3 群體感應(yīng)抑制劑

群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitors，QSIs)是指可以阻斷細(xì)菌種內(nèi)或種間信息交流，干擾和抑制細(xì)菌群體感應(yīng)現(xiàn)象，且不影響細(xì)菌正常生命活動(dòng)的物質(zhì)。理想的QSIs應(yīng)該具備幾個(gè)特點(diǎn)：①低分子量；②對QS系統(tǒng)具有高特異性；③對宿主水解酶表現(xiàn)出穩(wěn)定性；④對宿主無副作用[42]。水產(chǎn)品的腐敗與腐敗菌的QS相關(guān)，因此,對腐敗菌的QS進(jìn)行調(diào)控為水產(chǎn)品的保鮮提供了新的思路。

QSI的調(diào)控機(jī)制主要有以下3種類型：①抑制信號(hào)分子的合成，Burt 等[42]利用牛至精油提取物，通過影響AHL合成酶活性及受體的基因表達(dá)，抑制紫色色桿菌的紫色素產(chǎn)生及生物被膜形成能力；②降解信號(hào)分子，阻斷QS信號(hào)通路，從而調(diào)控QS反應(yīng)。阮志勇等[43]以pET32a為載體，在大腸桿菌中表達(dá)AHL lactonase的同源酶AiiK，降解AHL，從而治療P.aeruginosa感染；③產(chǎn)生與信號(hào)分子結(jié)構(gòu)類似物，與受體蛋白發(fā)生競爭性結(jié)合，進(jìn)而抑制QS。汪洋等[44]設(shè)計(jì)了一個(gè)序列為HSIRTGSKKPVPIIY的多肽，可以與LuxS/AI-2系統(tǒng)的假定受體發(fā)生結(jié)合，從而阻止AI-2進(jìn)入細(xì)胞。該多肽對Streptococcussuis、Staphylococcusaureus、E.coli、Salmonella、Listeriamonocytogenes和P.aeruginosa的生長均有抑制作用，此外，其他小鼠脾臟細(xì)胞幾乎沒有溶血活性和細(xì)胞毒性。

對能夠阻斷群體感應(yīng)信號(hào)分子發(fā)揮作用或受體識(shí)別信號(hào)分子的識(shí)別過程，而不干擾細(xì)菌正常生理活動(dòng)QS抑制劑的研究，尤其是天然抑制劑方面的研究受到了較多的關(guān)注[45]。天然抑制劑可以避免耐藥性和其他副作用的產(chǎn)生，因而相對于其他抑制劑來說更為安全。葉曉峰等[46]通過研究發(fā)現(xiàn):亞抑菌濃度的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)能顯著抑制波羅的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)生物被膜形成、泳動(dòng)能力和蛋白酶活性(P<0.05)，呈現(xiàn)濃度依賴性。因此，EGCG 在亞抑菌濃度下能夠干擾S.baltica的QS 系統(tǒng)，有效抑制生物被膜形成，減弱致腐能力。Zhu 等[47]通過研究發(fā)現(xiàn)：綠茶多酚能夠有效地抑制AI-2 和DKPs活性，且不抑制細(xì)胞生長和促進(jìn)AI-2的降解，并以一種濃度依賴的方式抑制希瓦氏菌被膜形成、胞外多糖產(chǎn)量及細(xì)胞泳動(dòng)性；此外，還能降低胞外酶活性和三甲胺的產(chǎn)量。通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn):茶多酚抑制了希瓦氏菌中l(wèi)uxS和torA基因的表達(dá)，與其QS活性及致腐能力的下降相符合。由于QS調(diào)控希瓦氏菌致腐能力的廣泛性，因此，通過對希瓦氏菌QS的調(diào)控在水產(chǎn)品保鮮領(lǐng)域中的應(yīng)用具有廣泛前景。

4 結(jié)論與展望

綜上所述，希瓦氏菌在海產(chǎn)品低溫貯藏條件下的腐敗過程中扮演著重要角色，QS對其致腐性能及被膜的形成能力有著重要的調(diào)控作用，因此，對QS的深入研究對做好低溫條件下水產(chǎn)品的保鮮和保證其質(zhì)量安全具有現(xiàn)實(shí)意義。目前針對希瓦氏菌QS的研究已經(jīng)達(dá)到一定的水平和高度，也取得了一些成果，并且已經(jīng)在一定程度上闡明了群體感應(yīng)調(diào)控腐敗特性的機(jī)制，但由于現(xiàn)實(shí)環(huán)境的多樣性和不確定性，仍有很多關(guān)于QS的基礎(chǔ)科學(xué)問題須要闡明，這些科學(xué)問題的揭示將有助于今后更有針對性地研發(fā)QS的抑制劑，對控制希瓦氏菌造成的食品腐敗具有重要的意義。