李 點(diǎn)，董明盛，張秋勤

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

腸桿菌科細(xì)菌屬革蘭氏陰性桿菌，大多數(shù)寄生在人和動(dòng)物的腸道中，可隨排泄物分布于水、土壤和腐敗的物質(zhì)中[1-2]。其包含大腸菌群、沙門氏菌、痢疾桿菌和致病性大腸埃希菌等食源性致病菌，也包含歐文氏菌和果膠桿菌等食品腐敗菌[3-6]，與人類關(guān)系密切。

群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)是微生物之間的一種信號(hào)交流機(jī)制，微生物通過分泌、釋放一些被稱作自誘導(dǎo)素(autoinducer，AI)的信號(hào)分子，感知其濃度變化，進(jìn)而檢測菌群密度、調(diào)控菌群生理功能，以此達(dá)到適應(yīng)環(huán)境的最終目的[7]。QS普遍存在于微生物之間，腸桿菌也不例外。有研究證明，腸桿菌科細(xì)菌中的大腸桿菌毒力因子的表達(dá)、與宿主之間的相互作用、抗生素耐藥性及細(xì)菌素合成等方面的調(diào)控均與QS密切相關(guān)[8]；QS還可調(diào)控沙門氏菌的基因表達(dá)，這些基因表達(dá)的變化通常涉及毒力基因調(diào)控，從而增強(qiáng)沙門氏菌的致病性[9]；此外，沙雷氏菌屬、泛生菌屬和耶爾森氏菌屬細(xì)菌成員中也發(fā)現(xiàn)了QS的信號(hào)分子。

圖1 EHEC的SdiA系統(tǒng)Fig.1 SdiA system of EHEC

由于腸桿菌科細(xì)菌大多是食源性致病菌或食品腐敗菌，且研究證明毒力因子的調(diào)控表達(dá)和食品的腐敗變質(zhì)均與QS密切相關(guān)。當(dāng)致病菌或腐敗菌的數(shù)量大時(shí)，信號(hào)分子的濃度也在一個(gè)很高的水平上，達(dá)到一定閾值后，就會(huì)發(fā)生感染或引起食品的腐敗變質(zhì)，這對(duì)人體健康具有潛在危害。因此，分析腸桿菌科細(xì)菌QS系統(tǒng)在調(diào)控病原菌毒力因子的表達(dá)、降低病原菌毒力方面具有重要意義，此外還可以避免因?yàn)槭称犯瘮∽冑|(zhì)造成的食品浪費(fèi)，為食品防腐保鮮提供一個(gè)新的研究維度。本文中，筆者介紹了腸桿菌科細(xì)菌成員中涉及的QS系統(tǒng)類型、腸桿菌科細(xì)菌QS對(duì)于毒力基因和食品腐敗變質(zhì)調(diào)控的研究。

1 腸桿菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)類型

1.1 AHLs介導(dǎo)的Ⅰ型群體感應(yīng)系統(tǒng)

LuxI/LuxR雙組分構(gòu)成的QS系統(tǒng)在革蘭氏陰性菌中分布廣泛，這類QS系統(tǒng)中的信號(hào)分子是N-?；呓z氨酸內(nèi)酯[10](N-acyl-homoserine lactones，AHLs)。AHLs是由一個(gè)高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和?；鶄?cè)鏈組成，其活性的特異性取決于側(cè)鏈中碳原子的數(shù)量和一些特異性基團(tuán)的存在。腸桿菌科的QS系統(tǒng)在不同的AHLs參與下發(fā)揮作用，歐文氏菌屬多產(chǎn)生3-oxo-C6-HSL，而在沙雷氏菌屬、泛生菌屬和耶爾森氏菌屬中發(fā)現(xiàn)最多的則是C6-HSL、3-oxo-C6-HL和C4-HSL[11]。

AHLs介導(dǎo)的Ⅰ型群體感應(yīng)系統(tǒng)中，信號(hào)分子由LuxI同源基因控制合成，LuxR同源物是信號(hào)分子的受體，與信號(hào)分子結(jié)合后被激活，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。然而有研究發(fā)現(xiàn)Gammaproteobacteria(γ變形菌)變形菌門的一個(gè)分支，包括Escherichia、Salmonella、Klebsiella和Enterobacter[12]，它們的基因組中沒有LuxI類似功能的基因，因此無法自身合成AHLs，但卻存在一個(gè)可以編碼LuxR的同源物的基因(sdiA基因)。以大腸桿菌為例，雖然細(xì)菌本身不產(chǎn)生AHLs，但是它們卻能感應(yīng)并對(duì)其他細(xì)菌產(chǎn)生的異種的AHLs應(yīng)答。圖1為腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicE.coli，EHEC)中的SdiA系統(tǒng)，EHEC通過感應(yīng)異種AHLs，并與SdiA結(jié)合，促進(jìn)了耐酸系統(tǒng)的gad基因表達(dá)并誘導(dǎo)噬菌體的產(chǎn)生[13-15]。SdiA還能抑制腸出血性大腸桿菌的鞭毛(flagella)的基因和致病性島(LEE)的基因[14,16]。沙門氏菌的sdiA可以感應(yīng)到多種結(jié)構(gòu)的AHLs，與之結(jié)合的同時(shí)激活2個(gè)srg基因座——rck(resistance to complement killing)操作子基因座和srgE(sdiA-regulaed gene E)基因座。前者參與沙門氏菌Pef(plasmid-encodes fimbriae)菌毛的生物合成，還具有侵襲宿主細(xì)胞并抵御補(bǔ)體殺傷的功能，后者編碼了沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)效應(yīng)子并通過T3SS2輸入至宿主細(xì)胞[17]。

1.2 AI-2介導(dǎo)的Ⅱ型QS系統(tǒng)

在Vibrioharveyi中發(fā)現(xiàn)了第2種QS系統(tǒng)[18]，由自誘導(dǎo)物2(AI-2)介導(dǎo)，目前，在腸桿菌科中也發(fā)現(xiàn)了這種信號(hào)分子。luxS基因編碼的LuxS酶以S-核糖基高半胱氨酸為催化底物合成4,5-二羥基-2,3戊二酮(DPD)，DPD是一種高度反應(yīng)性的共聚合體，它很容易重新排列并進(jìn)入其他反應(yīng)，此化合物可以形成被不同菌種識(shí)別為AI-2的信號(hào)分子。該QS系統(tǒng)在腸桿菌科成員中研究最多的是大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌[19-20]，如圖2所示，LsrB蛋白是 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的受體[21]，可與環(huán)境中的AI-2結(jié)合，之后通過LsrC和LsrD蛋白形成的異二聚膜通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，AI-2信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)所需的能量由LsrA提供。細(xì)胞內(nèi)lsrACDBFEG操縱子的表達(dá)是受AI-2激酶LsrK和抑制因子LsrR共同調(diào)控的。lsrK和lsrR位于lsr操縱子的上游，其轉(zhuǎn)錄受lsrRK操縱子的調(diào)控。AI-2信號(hào)分子進(jìn)入到胞內(nèi)后，被激酶LsrK磷酸化后，與抑制因子LsrR結(jié)合，會(huì)使LsrR成為無活性的阻遏蛋白，使得其從lsr操縱子中釋放出來，lsr和lsrRK的轉(zhuǎn)錄就會(huì)被激活。若沒有AI-2磷酸后的物質(zhì)存在，LsrR抑制因子就可特異性地結(jié)合在lsrRK和lsr之間的基因區(qū)，從而抑制lsr和lsrRK的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)調(diào)控自身和LsrK的表達(dá)。

在腸桿菌科成員中，此型QS系統(tǒng)研究最多的是大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌。在致病性大腸桿菌中，LuxS酶參與了EHEC和 腸致病性大腸桿菌 (EnteropathogenicE.coli，EPEC)毒力因子的表達(dá)調(diào)控[22]。而在鼠傷寒沙門氏菌中[23]，LsrR會(huì)抑制沙門氏菌致病性-1(Salmonellapathogenicity island-1，SPI-1)和鞭毛基因表達(dá)，而外源性的AI-2可與LsrR結(jié)合使其失活。很多研究證明由于luxS基因的突變導(dǎo)致了細(xì)胞中AI-2的缺乏，比如對(duì)腸桿菌科細(xì)菌成員中粘質(zhì)沙雷氏菌屬[24]、沙雷氏菌屬[25]、歐文氏菌屬[26]和梨火疫病病原菌[27]的細(xì)胞活動(dòng)均有一定影響。

圖2 AI-2介導(dǎo)的Ⅱ型QS系統(tǒng)機(jī)制示意Fig.2 Mechanism diagram of AI-2-mediated type Ⅱ QS system

1.3 AI-3/腎上腺素/去甲腎上腺素介導(dǎo)的 Ⅲ型QS系統(tǒng)

這個(gè)新發(fā)現(xiàn)的QS系統(tǒng)可能是迄今為止發(fā)現(xiàn)的所有信號(hào)通路中最復(fù)雜的，此型QS系統(tǒng)中信號(hào)分子AI-3的完整結(jié)構(gòu)和合成機(jī)制尚不明確。Ⅲ型QS系統(tǒng)具有Ⅱ型QS系統(tǒng)的許多特征，因?yàn)樗彩褂靡环N雙組分調(diào)控系統(tǒng)，但是，與Ⅱ型QS系統(tǒng)不同的是，它除了可以感應(yīng)AI-3這種新型信號(hào)分子，還可以利用人類應(yīng)激激素腎上腺素(Epinephrine，Epi)或去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)向系統(tǒng)發(fā)出信號(hào)[28-31]，故由此可推測該型信號(hào)分子很大可能是具有Epi或NE類似結(jié)構(gòu)的衍生物 。

如圖3所示，EHEC進(jìn)入結(jié)腸后通過結(jié)腸細(xì)胞膜上的組氨酸傳感器激酶(HKs)感應(yīng)AI-3和宿主產(chǎn)生的Epi和NE，在EHEC中鑒定到的HKs有2種，分別為QseC和QseE，它們對(duì)應(yīng)的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白分別為QseB和QseF，組成了雙組分系統(tǒng)QseCB和QseEF。QseC被AI-3激活后，啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)，磷酸化的QseB結(jié)合并激活flhDC操縱子的轉(zhuǎn)錄，該操縱子是編碼鞭毛調(diào)控子的flhDC主調(diào)節(jié)子，并與自身的啟動(dòng)子結(jié)合[32-33]，進(jìn)而導(dǎo)致泳動(dòng)性發(fā)生變化，有利于EHEC對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附和毒力作用。雙組分系統(tǒng)QseEF與之不同的是：QseE不能感應(yīng)細(xì)菌信號(hào)AI-3且其不參與鞭毛和泳動(dòng)性的調(diào)控。AI-3介導(dǎo)的QS信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)存在于所有腸桿菌科細(xì)菌中(大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌和鼠疫耶爾森氏桿菌)，在這些細(xì)菌中，這種級(jí)聯(lián)的基因編碼轉(zhuǎn)錄因子的染色體具有高度相似性且發(fā)揮著相同的作用，說明AI-3介導(dǎo)的QS系統(tǒng)在腸桿菌科細(xì)菌中具有功能守恒的特點(diǎn)[34]。

圖3 AI-3/腎上腺素/去甲腎上腺素介導(dǎo)的 Ⅲ型QS系統(tǒng)機(jī)制示意Fig.3 Schematic diagram of type Ⅲ quorum sensing system mechanism mediated by AI-3/Epi/NE

1.4 EDF短肽介導(dǎo)的QS系統(tǒng)

寡肽-自誘導(dǎo)肽(autoinducing peptides，AIPs)通常是革蘭氏陽性菌QS中的自誘導(dǎo)物，但是腸桿菌科中的大腸桿菌中同樣發(fā)現(xiàn)了一種線型五肽(NNWNN)[35]QS因子EDF(extracellular death factor)。該系統(tǒng)參與了大腸桿菌細(xì)胞凋亡的調(diào)控。細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞的程序性死亡(programmed cell death，PCD)，是多細(xì)胞真核細(xì)胞中由基因決定的細(xì)胞死亡的過程。大腸桿菌的mazEF體系是研究較多的細(xì)菌染色體上的毒素-抗毒素系統(tǒng)(toxin-antitoxin system，TA系統(tǒng))之一，由QS因子EDF調(diào)控[35-36]。mazF基因負(fù)責(zé)編碼一種穩(wěn)定的細(xì)胞毒蛋白，mazE基因負(fù)責(zé)編碼不穩(wěn)定的可被ClpPA復(fù)合體降解的抗毒素[37]。MazF毒素是一種核糖核酸內(nèi)切酶，可被形成特殊構(gòu)象的MazE識(shí)別，聚合為六聚體模式，蛋白毒性被抑制，當(dāng)環(huán)境壓力抑制蛋白表達(dá)，MazE被ClpPA降解，MazF含量就會(huì)相對(duì)增加，從而啟動(dòng)細(xì)胞的死亡程序[38-39]。

mazEF可介導(dǎo)大腸桿菌的類凋亡死亡(apoptotic-like death，ALD)，此過程是一種QS現(xiàn)象，需要EDF的參與。EDF中的線型五肽 是Asn-Asn-Trp-Asn-Asn，這5種氨基酸的每一種對(duì)其活性都是必不可少的[40]。參與調(diào)控MazF、mRNA干擾毒素和1個(gè)同源毒素ChpBK的內(nèi)切活性[41]。EDF可發(fā)揮3種作用：一是在體外可增強(qiáng)MazF和ChpBK的內(nèi)切活性；二是克服抗毒素MazE抗MazF毒素的抑制活性；三是克服抗毒素ChpBI抗ChpBK毒素的抑制活性。此外，它還可以與MazF直接作用。因此，EDF作為一類QS系統(tǒng)，在肽自誘導(dǎo)物水平上對(duì)細(xì)菌進(jìn)行調(diào)控。

1.5 吲哚介導(dǎo)的QS系統(tǒng)

許多革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌可產(chǎn)生大量吲哚作為細(xì)胞間信號(hào)，在腸桿菌科中，吲哚是由大腸桿菌和一些變形菌族的成員，如Proteusvulgaris、Providenciaspp.和Morganellaspp.[42]產(chǎn)生。吲哚由色氨酸生成，色氨酸酶由tnaA[43]編碼 。

Hirakawa等[44]研究表明，吲哚可作為大腸桿菌細(xì)胞外的信號(hào)分子，可以誘導(dǎo)內(nèi)源異型生物質(zhì)輸出基因acrD的表達(dá)，來增加細(xì)菌耐藥性。具體誘導(dǎo)過程是由BaeSR和CpxAR這兩種雙組分體系介導(dǎo)的[44]，吲哚先作用于傳感器激酶 BaeSR和CpxAP，信號(hào)分子經(jīng)傳遞至同源應(yīng)答調(diào)控子，調(diào)控子可直接結(jié)合到輸出基因啟動(dòng)子區(qū)不同位點(diǎn)，從而上調(diào)其表達(dá)。此外，吲哚還可以調(diào)控生物被膜的形成[45]，調(diào)控LEE基因在腸致病性大腸桿菌中的表達(dá)[46]，并參與抑制細(xì)胞分裂，從而為質(zhì)粒多聚體在細(xì)胞內(nèi)的分解和穩(wěn)定維持提供依據(jù)[47]。

與大腸桿菌不同，沙門氏菌不能產(chǎn)生吲哚[48]，Nikaido等[49]用吲哚處理沙門氏菌，證明了吲哚可以誘導(dǎo)與耐藥相關(guān)的基因表達(dá)，包括ramA和acrAB，并且可以抑制SPI-1編碼的宿主細(xì)胞入侵和鞭毛產(chǎn)生相關(guān)的基因表達(dá)。

2 腸桿菌QS系統(tǒng)研究的應(yīng)用

2.1 腸桿菌QS對(duì)于毒力基因的調(diào)控

腸桿菌科的細(xì)菌毒力基因的表達(dá)依賴于QS系統(tǒng)的調(diào)控。腸桿菌科細(xì)菌的毒力主要包括毒素、水解酶、脂多糖(LPS)、胞外多糖(EPS)、O抗原、不同類型的鞭毛、細(xì)胞表面遷移能力、生物膜形成等。QS在腸桿菌許多動(dòng)植物病原菌毒力中起著重要作用。

QS在沙門氏菌的毒力表型中起重要作用。Campos-Galv?o等[50]研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌雖然不能合成與革蘭氏陰性菌相同的AI-1，卻有一個(gè)受體SdiA蛋白。在厭氧條件下，SdiA蛋白通過增強(qiáng)生物膜的形成和毒力基因的表達(dá)來影響沙門氏菌的腸溶性腸病行為。人工添加外源的AHLs后，特別是C12-HSL時(shí)，促進(jìn)了沙門氏菌生物膜形成基因(lpfA、fimF、fliF、glgC)和毒力基因(hilA、invA、invF)的表達(dá)，增強(qiáng)了菌形成生物膜的能力。此外，近年來，一種涉及外膜蛋白R(shí)ck的新進(jìn)入系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)，且有研究證明含rck的pefl-srgC位點(diǎn)受沙門氏菌群體感應(yīng)的溫度和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SdiA的調(diào)控[51]，Abed等[52]通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄融合發(fā)現(xiàn)pefl上游預(yù)測的遠(yuǎn)端啟動(dòng)子，即PdflP2表現(xiàn)出依賴于SdiA和AHLs的活性，此外還發(fā)現(xiàn)在25和37 ℃時(shí)Rck表達(dá)可負(fù)面調(diào)控?cái)M核相關(guān)的H-NS蛋白，這項(xiàng)研究有助于描述這種入侵蛋白在體內(nèi)的作用，提供一個(gè)有效預(yù)防沙門氏菌致病的途徑。

QS參與調(diào)控歐文菌屬植物病原中毒力因子的表達(dá)，在這方面研究最深入的是胡蘿卜軟腐菌的AHL介導(dǎo)的QS系統(tǒng)。腸桿菌科細(xì)菌植物病原細(xì)菌產(chǎn)生多種降解植物細(xì)胞壁的水解酶(PCWDEs)。這些酶包括果膠裂解酶、纖維素酶、果膠甲基酯酶、聚半乳糖醛酸酶和蛋白酶[53]。胡蘿卜軟腐菌侵染植物后，引起多氯聯(lián)苯類化合物的合成，引起植物組織的浸漬和軟腐菌的發(fā)生。結(jié)果表明，QS參與了胡蘿卜軟腐菌毒力調(diào)控。E.carotovorassp.Carotovora(Ecc)在其某些菌株中可控制水解胞外酶的合成。在突變體中，AHL合成缺失，外酶合成減少，結(jié)果病毒活性下降[54-55]。此外，在沒有AHL的情況下，Ecc SCC3193中，ExpR1和ExpR2這2個(gè)LuxR同源基因能夠抑制胞外酶合成[56]。Cui等[57]發(fā)現(xiàn)，來自Ecc71菌株的ExpR參與了rsmA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，編碼了RNA結(jié)合蛋白R(shí)smA前體，這是一種抑制PCWDEs產(chǎn)生的全球性調(diào)控蛋白。在AHL缺失的情況下，ExpR與rsmA啟動(dòng)子結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄。AHL抑制rsmA轉(zhuǎn)錄的激活和ExpR與rsmADNA的結(jié)合。

2.2 腸桿菌QS對(duì)于食品腐敗變質(zhì)的影響

腸桿菌科細(xì)菌QS還可造成食品的腐敗變質(zhì)。QS參與了鮮肉產(chǎn)品在需氧冷藏條件下的變質(zhì)過程[58]。Blana等[59]研究發(fā)現(xiàn)牛至揮發(fā)油中存在的揮發(fā)性化合物對(duì)產(chǎn)AHL腸桿菌科的細(xì)菌生長有抑制作用，同時(shí)也抑制了肉腐敗過程中的QS現(xiàn)象；真空包裝的魚子醬中腸桿菌科與乳桿菌、肉桿菌屬及乳桿菌屬某些種共同作用造成產(chǎn)品變質(zhì)，且這些細(xì)菌在低濃度下也能產(chǎn)生AHL[60]。Martins等[61]對(duì)從冷鮮奶中分離的6株嗜冷腸桿菌進(jìn)行16S rDNA測序，在其中4株中發(fā)現(xiàn)了在Hafniaalvei編碼AHL合成酶的halI基因。且該基因在大腸桿菌中通過異源合成N-己二酰- DL-同聚絲氨酸內(nèi)酯和N-3-己二酰- L-同聚絲氨酸內(nèi)酯而顯示其功能，這一功能也在實(shí)驗(yàn)菌株中得到了證明，此外在研究這些菌株對(duì)于牛奶品質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)某些菌株可以造成牛奶的腐敗變質(zhì)。

3 結(jié)論與展望

腸桿菌科細(xì)菌具有多種類型的QS系統(tǒng)，在某些情況下，在調(diào)節(jié)細(xì)胞過程中發(fā)揮著尤為重要的作用，許多研究證明腸桿菌中QS系統(tǒng)可參與細(xì)菌毒素、生物膜、細(xì)菌特性和許多生理活動(dòng)，造成食品的腐敗變質(zhì)，對(duì)食品質(zhì)量與安全有很大影響。但是人們對(duì)于腸桿菌QS的研究還處于初級(jí)階段，現(xiàn)有的研究多為信號(hào)分子的檢測，在食品中的作用機(jī)制研究還未深入，還有許多方面的問題需要解決探索。