周 幸，阿熱愛·巴合提，李平蘭

(1.中國農業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083;2.新疆維吾爾自治區(qū)產品質量監(jiān)督檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830013)

微生物利用食品中的營養(yǎng)物質促進自身生長繁殖，會引起食品腐敗變質。世界糧農組織(FAO)在2019年估計，全球每年約有三分之一的食品損失，其中微生物引起的食品腐敗是損失的主要原因[1]。

群體感應(QS)是一種微生物在菌體密度產生變化時，通過特定信號分子——自誘導劑(AI)的分泌與接收調控微生物群體的信息交流現(xiàn)象[2]，它參與了微生物中許多重要的生物學過程，如孢子形成、毒性物質合成、生物被膜形成等[3]。QS系統(tǒng)有3種主要類型和1種特殊類型：第一類為以費氏弧菌(Vibriofischeri)發(fā)光現(xiàn)象為代表的革蘭氏陰性菌為主的LuxI/LuxR型群體感應，通過自動誘導劑合酶LuxI與轉錄激活蛋白LuxR調控信號分子N-?；呓z氨酸內酯(AHLs)(又稱AI-1)的合成與作用[2,4](圖1(a))；第二類為革蘭氏陽性菌為主的肽介導型群體感應，常利用修飾后的特異性寡肽(AIP)作為信號分子進行QS調控，其中AIP不具有直接跨膜的能力，需通過ABC轉運系統(tǒng)(ATP-binding cassette)實現(xiàn)胞外轉移并在環(huán)境中發(fā)揮作用(圖1(b))；第三類為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌共有的種間LuxS/AI-2型群體感應，利用信號分子AI-2進行信息交流[5](圖1(c))；第四類是在黃色粘球菌(Myxococcusxanthus)中發(fā)現(xiàn)的一種特殊類型群體感應[6-7]。

當前，國內外大量研究發(fā)現(xiàn)能在變質食品中檢測到QS信號分子，證實了QS系統(tǒng)通過調控微生物生理代謝與酶系活性參與了食品腐敗過程[8-11]。因此，探究QS系統(tǒng)與食品腐敗之間的關系并揭示其作用機制對開發(fā)食品防腐保鮮新方法具有重要意義。

圖1 3種主要QS系統(tǒng)類型調控機制[12-13]Fig.1 Control mechanisms of three miantypes of QS system[12-13]

1 食品腐敗中的QS現(xiàn)象

微生物因素是導致食品腐敗變質的重要因素。生鮮乳、肉、水產、果蔬等食品，因其營養(yǎng)豐富更易受微生物污染從而腐敗變質。在食品腐敗變質的過程中，少部分被稱為特定腐敗微生物(SSO)的群體暫時控制食品基質內的微生物演替[14]。多數(shù)引起食品腐敗的微生物為革蘭氏陰性菌，因此食品腐敗變質中檢測到的QS系統(tǒng)多為LuxI/LuxR型(表1)。

嗜冷菌是低溫保藏條件下乳及乳制品中的SSO，它們可產生具有熱穩(wěn)定性的胞外蛋白酶、脂酶、糖苷酶，使乳制品經過工業(yè)處理后的保質期變短、品質下降[17-18]。Li等[19]的研究表明AHLs可在由嗜冷菌引起變質的食品中廣泛檢測到，且AHLs濃度隨食品變質程度加深而增加。Yuan等[20]證明了外源添加AHLs會促進乳中生氮假單胞菌(P.azotoformans)和液化沙雷氏菌(S.liquefaciens)蛋白酶、脂肪氧化酶生產；研究顯示，AHLs的添加上調了rpsR、rpsE、rplK、rplA等20個核糖體編碼基因及調節(jié)蛋白EF-G、EF-Tu、EF-P編碼基因，說明QS系統(tǒng)可能會通過信號分子調節(jié)細菌生長代謝和產物生成從而引起食品變質。

表1 受QS系統(tǒng)影響的食品腐敗示例[15-16]Table 1 Examples of food spoilage affected by the QS system[15-16]

微生物在肉中生長繁殖，其代謝產物包括胺類化合物、硫化物，小分子醛、酮和有機酸等，微生物胞外蛋白酶是引起肉類食品腐敗的重要成分，其分泌會受到QS系統(tǒng)的調控[21]，例如肉制品中的腸桿菌(Enterobacteriaceae)受QS系統(tǒng)調控產生的AHLs會促進蛋白酶分泌，加速產品腐敗變質[22]。Mellor等[23]發(fā)現(xiàn)雞肉中的熒光假單胞菌(P.fluorescens)等可產生表面活性物質，幫助其分解肉中脂肪，且物質分泌與初始菌數(shù)相關，這一過程可能受到了QS系統(tǒng)的調節(jié)。

由于水產品水分含量高，優(yōu)質蛋白與脂肪酸豐富，且通常運輸距離遠，腐敗變質現(xiàn)象十分普遍，故QS相關研究較多。Li等[24]利用QS信號分子C6-HSL對分離自腐敗大菱鲆的1株蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)ATCC13337進行處理，發(fā)現(xiàn)該菌株鞭毛依賴性運動受到QS系統(tǒng)調節(jié)，信號分子增加能顯著提高菌株運動性，增強其黏附性與定植性。Fu等[25]從大黃魚中分離出希瓦氏菌025和003(Shewanella025 &003)，研究發(fā)現(xiàn)希瓦氏菌內存在3個潛在受QS系統(tǒng)影響的基因torT、cysM和trxB，它們分別編碼氧化三甲胺還原酶系統(tǒng)周質蛋白(TorT)、半胱氨酸合酶B和硫氧還蛋白還原酶，影響氧化三甲胺(TMAO)及其他呈味物質代謝加劇魚肉腐敗變質。Jie等[26]從變質的凡納濱對蝦中分離出野生型希瓦氏菌SAO3(ShewanellaSAO3)并構建ΔluxRSA03突變體，研究發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變型菌株喪失了對AHLs的敏感性，不再因AHLs濃度變化而產生種群數(shù)量變化，證明了希瓦氏菌在腐敗變質產品中的群體密度受QS系統(tǒng)調控。

由于QS系統(tǒng)參與調控，微生物會產生大量果膠裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基酯酶，導致果蔬腐敗變質，常見的腐敗菌有歐文氏菌屬(Erwiniaspp)和假單胞菌屬(Pseudomonasspp)，其果膠酶的產生依賴于3-oxo-C6-HSL、C6-HSL兩類AHL信號分子[27]。軟腐的豆芽中可檢測到AHLs，Rasch等[9]分離得到了AHLs的產生菌，并構建出AHLs生產缺陷的突變型菌株接種到豆芽上，結果顯示實驗豆芽在細菌總數(shù)與普通豆芽相似的情況下不產生軟腐現(xiàn)象。Zhang等[28]發(fā)現(xiàn)白菜中分離的胡蘿卜軟腐歐文氏菌(E.carotovora)和生菜中分離的熒光假單胞菌(P.fluorescens)運動性、毒性及胞外聚合物(EPS)生成均受到QS系統(tǒng)調控。

2 QS系統(tǒng)調控生物被膜形成

在食品腐敗變質中，QS系統(tǒng)不僅直接參與微生物生理活動代謝調節(jié)，還會在宏觀角度促進生物被膜(bacterial biofilm)形成(圖2)。生物被膜是由微生物及一種或多種細胞外基質組成，具有復雜生態(tài)系統(tǒng)的膜狀物，是細菌自我保護的一種形式，通過微生物表面吸附、附著表面分解、細胞增殖、被膜形成與成熟、分離分散5個部分形成和傳播(圖3)[27,29]。生物被膜能附著在各種食品工業(yè)設備表面和包裝材料上，如不銹鋼、玻璃、聚乙烯、聚丙烯等[29]。通過這種方式，微生物可大幅度避免環(huán)境對生長繁殖造成的不利影響，比如食品工業(yè)中常見的干燥處理、高溫處理和化學消毒劑處理等，故生物被膜是造成產品污染的重要因素之一[30]。

圖2 QS系統(tǒng)調控生物被膜形成機制[27]Fig.2 QS system sensing mechanism of bacterial biofilm[27]

圖3 生物被膜的形成過程[27]Fig.3 Development of bacterial biofilm[27]

2.1 食品中的生物被膜

Hou等[31]在腐敗的海參中分離得到1株受AHLs調控的蜂房哈夫尼菌H4(HafniaalveiH4)，研究顯示信號分子3-oxo-C8-HSL和低濃度C4-HSL抑制菌株生物被膜形成，而低濃度信號分子C6-HSL促進其形成，這說明QS系統(tǒng)會根據(jù)環(huán)境情況促進或抑制生物被膜形成，幫助菌株定殖，使其更難從食品體系中去除。Vergara等[32]研究了22株分離自食品的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，發(fā)現(xiàn)其中5株可在常見食品包裝材料聚苯乙烯上成膜，1株可在不銹鋼上成膜，它們大多攜帶Iva型葡萄球菌染色體mec基因盒(SCCmec)，說明Iva型SCCmec可能與生物被膜形成相關。涂春田等[33]在270份冷藏雞翅中分離出38株單增李斯特菌(L.monocytogenes)，發(fā)現(xiàn)其中僅2株菌呈現(xiàn)弱生物被膜形成能力，生物被膜的形成會增強食源性病原菌及腐敗菌的競爭力，因此其他腐敗菌中很可能也廣泛具備這項能力。

Gauvry等[34]提出，生物被膜中可共存的細胞類型主要有活的微生物細胞、基質產生細胞和微生物孢子三類，其中孢子具有黏附特性，可附著在食品工業(yè)管線上形成生物被膜。這些研究顯示，多種微生物可通過生物被膜形成復雜的共生關系，QS系統(tǒng)作為微生物間信息交流的“橋梁”協(xié)調了各類菌株功能與密度的變化，提升了細胞本身抗性和適應性，此外，孢子的存在還增強了微生物的擴散性。對食品工業(yè)而言，清除生物被膜易存在死角，但QS系統(tǒng)的研究能為生物被膜的控制與清除提供新方向。

2.2 QS系統(tǒng)調控生物被膜生成

2.2.1 QS系統(tǒng)調節(jié)革蘭氏陰性菌生物被膜形成

銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)是一類在乳、肉等基質中常見的革蘭氏陰性腐敗菌，也是一類主要的生物被膜侵染菌。銅綠假單胞菌中包含las、rhl兩類由AHLs調控的QS系統(tǒng)和一類不受AHLs調控的pqs系統(tǒng)：las系統(tǒng)中，調節(jié)蛋白LasI負責生產信號分子N-(3-氧十二烷?；?-L-高絲氨酸內酯(3-oxo-C12-HSL)，調節(jié)蛋白LasR負責接收并識別信號分子；在rhl系統(tǒng)中，調節(jié)蛋白RhlI負責生產信號分子N-丁?；?L-高絲氨酸內酯(C4-HSL)，調節(jié)蛋白RhlR負責接收并識別信號，rhl系統(tǒng)還會通過LuxR調節(jié)器QscR受到來自las系統(tǒng)的影響；pqs系統(tǒng)由pqsABCDE操縱子及pqsR、pqsH、pqsL3個轉錄單位組成，以2-烷基-4-喹諾酮類物質(AQ)為信號分子，與AHLs調控的QS系統(tǒng)類似，pqs系統(tǒng)也可通過轉錄調節(jié)因子PqsR進行自我調節(jié)[35-36]。

在銅綠假單胞菌中，3-oxo-C12-HSL可通過調控被膜分化調節(jié)其結構；此外，3-oxo-C12-HSL還與細胞運動性相關[37-38]。通過rhl系統(tǒng)調控合成的鼠李糖脂具有生物表面活性劑功能，在生物被膜結構形成過程中發(fā)揮了重要作用，同時它還具有毒性因子的作用[37,39]。pqs系統(tǒng)會參與調解細胞外DNA(eDNA)的成產，進而調節(jié)細胞外基質、生物被膜成熟過程及凝集素LecA和LecB的產生，影響被膜形成與定殖[40]。綜上可知，QS系統(tǒng)在銅綠假單胞菌的被膜形成中起關鍵作用(圖4)。

圖4 QS系統(tǒng)調控銅綠假單胞菌生物被膜形成示意[47]Fig.4 Overview of biofilm QS regulation in Pseudomonas aeruginosa[47]

2.2.2 QS系統(tǒng)調節(jié)革蘭氏陽性菌生物被膜形成

金黃色葡萄球菌(S.aureus)普遍存在于環(huán)境中，是一類重要的食源性致病菌，在速凍食品、鮮乳、肉、蛋中均可分離得到，其生物被膜形成受到由小分子肽AIP介導的Agr型QS調控：前體肽AgrD經調控蛋白AgrB和蛋白酶加工成為信號分子AIP后，與跨膜結合受體AgrC結合，使AgrC將磷酸基團轉移至應答調節(jié)器AgrA上，磷酸化AgrA可激活agrP3啟動子，從而驅動RNAIII的轉錄(圖5)[41-42]。RNAIII是編碼δ-毒素的mRNA，同時還參與調節(jié)毒素分泌與生物被膜分解過程。金黃色葡萄球菌中，AIP濃度與agr系統(tǒng)間有正反饋關系，即AIP濃度增加會進一步促進AIP生成，進而導致QS響應擴大[43]。這說明金黃色葡萄球菌中QS調控能促進生物被膜快速發(fā)展。

圖5 金黃色葡萄球菌中的QS系統(tǒng)示意[44]Fig.5 QS system in Staphylococcus aureus[44]

3 QS與防腐保鮮

食品防腐保鮮中，微生物控制是一個關鍵問題。從殺滅腐敗微生物的角度出發(fā)，添加食品防腐劑是當前應用最廣泛的方式。常見的食品級微生物乳酸菌具有生產天然防腐劑細菌素的能力，且這一過程受QS系統(tǒng)調控[45]。因此QS系統(tǒng)的研究有利于增進乳酸菌細菌素生產。

從抑制微生物生長繁殖的角度出發(fā)，當前的研究集中在添加群體感應抑制劑(QSI)上。QSI能“混淆”微生物信息接收，使其通過自身調節(jié)達到停止生長或停止代謝的目的。

3.1 QS系統(tǒng)調控乳酸菌細菌素生成

乳酸菌細菌素是乳酸菌經核糖體機制產生的具有抗菌活性的多肽或蛋白質，根據(jù)其結構與理化性質特征分為四類：I類羊毛硫細菌素(lantibiotics)、II類非修飾多肽(unmodified peptides)和III類熱敏感大分子蛋白、IV類大分子復合物[46-47]，已商業(yè)應用于食品中的乳酸鏈球菌素Nisin屬于I類細菌素、片球菌素PA-1屬于II類細菌素，還有部分地區(qū)將II類細菌素腸球菌素AS-48用于果蔬汁的保鮮[48]。根據(jù)細菌素特點和當前應用情況，I類和II類細菌素是研究的主要方向。

Nisin是I類細菌素的代表，其合成受到QS系統(tǒng)調控(圖6)。前體肽NisA在細胞內經修飾酶NisB和NisC加工后脫水環(huán)化，并通過跨膜轉運蛋白NisT和NisC運輸至細胞外，經切割前導肽蛋白酶NisP作用后形成Nisin。當其濃度達到閾值時，識別系統(tǒng)NisK結構域受到激活后使NisR磷酸化，從而回饋細菌素合成的基因表達，對細菌素合成進行調節(jié)[49]?；赒S系統(tǒng)對Nisin合成的調控，要促進細菌素不斷產生，除了為其提供適宜的生產環(huán)境，還應使生產菌接收不到產物濃度增加的關鍵信息，因此NisK和NisR有潛力成為研究的關鍵靶點。

圖6 Nisin的合成機制[50]Fig.6 Synthesis mechanism of Nisin[50]

多數(shù)植物乳桿菌素屬于II類細菌素，其合成同樣受QS系統(tǒng)調控(圖7)。植物乳桿菌C11(L.plantarumC11)中，由操縱子plnABCD編碼的植物乳桿菌素PlnA與組氨酸激酶PlnB相互作用，使調節(jié)蛋白PlnC、PlnD呈現(xiàn)磷酸化，磷酸化的PlnC能誘導特定基因表達，激活細菌素前體肽的轉錄，而當PlnD達到閾值濃度時，會對細菌素前體肽轉錄產生抑制作用[51]。植物乳桿菌素plnA不作為直接信號阻遏其產生，但其產量與專門的信號PlnD相關聯(lián)，與Nisin相比機制更為復雜。在植物乳桿菌中，提高細菌素產量的關鍵是控制PlnD的胞內含量，因此可能需要采取定向進化或基因編輯降低PlnD的產生。

圖7 植物乳桿菌素合成機制[51]Fig.7 synthesis mechanism of plnA[51]

3.2 QSI與食品防腐保鮮

理論上可以將QS系統(tǒng)作為靶點調控微生物生長繁殖與代謝，當前也已有大量研究驗證了這一方法的可行性(表2)。干擾QS系統(tǒng)主要有以下3種方式：①抑制信號分子合成，使其數(shù)量減少，進而影響細胞正常生理代謝；②加速信號分子淬滅，同理可使其數(shù)量減少；③干擾信號分子與受體結合，使實際信息無法傳遞至細胞內部[52]。這3種方式在本質上都是切斷微生物的信息傳遞與反饋，利用菌體本身的機制停止相應的生理活動，因此不存在抗性的產生。

作用于食品的QSI同理防腐劑，需要較高的安全性，因此當前著重在天然QSI的開發(fā)和研究上。

表2 部分天然來源QSI示例[15]Table 2 Parts of natural sources QSI[15]

當前的研究熱點顯示，植物提取物有巨大的QSI潛力，這可能是由于植物組織和組織液中數(shù)量龐大且結構復雜的天然化學產物本身就是長期進化而來直接或間接保護自身、對抗病害的成分。Husain等[53]研究表明，當前芒果葉中鑒別出的化合物已超過14種，并且其甲醇提取物顯示出光譜抑制QS活性，這說明提取物可能針對多個靶點發(fā)揮作用。但在這類研究中，由于多數(shù)天然化學產物的穩(wěn)定性不佳，且還存在大量類似物質，在分離提純的過程中易發(fā)生變化，因此具體活性成分的確定與分析受到一定限制，還需要更精確的分析方法幫助研究。

食品工業(yè)研究者已開始嘗試將天然植物精油作為防腐劑投入生產，并且天然植物精油能很好地抑制生物被膜形成[54]。如，檸檬草精油顯著降低了食源性病原菌阪崎腸桿菌(C.sakazakii)的運動能力，限制了其生物被膜生成[55]；Husain等[56]提取的薄荷油通過干擾AHLs作用限制了銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)和嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)的被膜形成能力。但天然植物精油也存在成分復雜且不穩(wěn)定的問題，食品基質本身的成分含有蛋白、碳水化合物、脂質，較易與精油中的活性成分發(fā)生反應，影響食品品質；此外，植物精油多有芳香氣味，應用于食品中可能會給產品帶來異味。因此，植物精油在食品中的應用可能需要包埋技術作為基礎。

除了植物，微生物也可能是QSI的良好來源。微生物種類眾多，且在一定環(huán)境下的微生物之間天然存在拮抗現(xiàn)象，同理細菌素的研究，微生物也有可能因種間或種內競爭產生具有QSI特性的產物。如枯草芽孢桿菌蛋白酶A，作為一種天然的蛋白酶，不僅可直接作用于生物被膜成分，還能影響信號分子AI-2的傳遞進而影響QS系統(tǒng)的正常功能[57]。當前，相關研究還較缺乏，但值得廣泛探究。

4 展望

食物是人獲取能量的唯一來源，食品腐敗變質不僅僅會導致食物損失，更重要的是其可能會引發(fā)食源性疾病，甚至危及生命。QS是微生物生長繁殖過程中重要的生理現(xiàn)象，能幫助微生物更好地適應環(huán)境，但對于食品和食品工業(yè)而言，QS調控的生物被膜形成和各類產色素、產毒現(xiàn)象會導致巨大的經濟損失。因此，了解微生物QS現(xiàn)象能更好地控制和利用它并應用于食品防腐保鮮領域。

綜上，現(xiàn)有研究不斷揭示腐敗微生物和食源性病原菌QS原理，同時也在控制其發(fā)展上取得了一定成果，但在微生物QS機制研究中，由于系統(tǒng)本身錯綜復雜，不同QS之間的相互影響還需進一步明確；由于微生物種類豐富，不同微生物中的QS現(xiàn)象和機制也存在一定差異，因此還需要對更多微生物模型進行探究，尋找其中存在的規(guī)律。在細菌素與QSI的開發(fā)利用中，當前研究大多只針對某一個腐敗微生物模型進行實驗，且實驗條件較為單一，不能模擬食品腐敗或工業(yè)條件下的真實情況，因此還需要在多因素條件下做更深的探究；此外，細菌素與QSI毒理學研究也相對較少，需要加深對其安全性的探索，為其在食品及食品工業(yè)應用提供支持。