徐振波，劉子奇，謝金紅，劉君彥

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.馬里蘭大學(xué) 微生物病理系，美國 巴爾的摩 21201)

群感效應(yīng)(quorum sensing，QS)是微生物通過感知自體誘導(dǎo)物(autoinducer，AI)的濃度來調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達的一種作用機制，也是微生物間進行相互交流的一種通訊方式[1-2]。1979年，人們在對海洋生物發(fā)光系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)了費氏弧菌(Vibriofischeri)和哈氏弧菌(Vibrioharveyi)中的QS[3-4]。1994年，F(xiàn)uqua等[5]報道了LuxI/LuxR系統(tǒng)在不同細菌物種群感效應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用，人們對QS在細胞間通信的調(diào)控原理和過程逐漸明晰。近年來，我國對食品行業(yè)的安全性要求越來越高，由食源性致病微生物引起的食物中毒事件時有發(fā)生。金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性菌，廣泛存在于空氣、土壤、水源、人和動物體內(nèi)，在我國，約有20%～25%的食物中毒由金黃色葡萄球菌引起，僅次于沙門氏菌和副溶血性弧菌。銅綠假單胞菌屬于非發(fā)酵革蘭氏陰性菌，廣泛存在于濕潤環(huán)境，盡管銅綠假單胞菌不作為食品微生物檢測的常規(guī)指標項目，但已經(jīng)被確認為食源性和水源性致病微生物。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌已被證實可以共同污染水源以及肉制品、乳制品等食品行業(yè)，多微生物相互作用成為食品行業(yè)的巨大隱患。QS不僅有助于細菌間相互交流和種群密度調(diào)控，而且在維持細菌對人類等其他宿主的致病性方面也發(fā)揮著重要作用[6]。為了治理金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌引起的混合污染，必須先了解兩者的群體增殖特性和相互作用機制。

1 金黃色葡萄球菌群感效應(yīng)系統(tǒng)

在金黃色葡萄球菌中至少有兩個QS系統(tǒng)，分別為agr(the accessory gene regulator，agr)系統(tǒng)(圖1)和LuxS/AI-2系統(tǒng)[7]。agr系統(tǒng)是革蘭氏陽性菌中典型的QS系統(tǒng)，也是金黃色葡萄球菌中起到主導(dǎo)地位的QS系統(tǒng)，而LuxS/AI-2系統(tǒng)在革蘭氏陰性菌和陽性菌中均廣泛存在，在金黃色葡萄球菌中和主要的群體感應(yīng)系統(tǒng)一起共同參與基因的調(diào)控。

圖1 金黃色葡萄球菌QS agr系統(tǒng)示意[8]Fig.1 S.aureus quorum sensing agr system model[8]

通常在指數(shù)期后期，隨著種群密度增加，金黃色葡萄球菌中信號分子自體誘導(dǎo)肽(AIP)不斷積累，agr系統(tǒng)被誘導(dǎo)[7]。根據(jù)AIP不同，agr主要分為Ⅰ～Ⅳ基因型。AIP與位于細胞膜上的受體蛋白結(jié)合后，通過受體蛋白與其他蛋白作用調(diào)控種群密度、胞外物質(zhì)和毒素分泌等相關(guān)基因的表達。P2和P3是agr系統(tǒng)中的兩個反向啟動子[9]，分別調(diào)控RNA II和RNA III的轉(zhuǎn)錄。RNA II編碼區(qū)由agrA、B、C和D4個基因組成[10-11]。agrD與AIP前體的合成有關(guān)，而后由agrB編碼細胞膜上的跨膜肽鏈內(nèi)切酶對AIP前體進行誘導(dǎo)、修飾和轉(zhuǎn)運。agrC和agrA編碼的AgrC(轉(zhuǎn)膜受體組氨酸激酶)和AgrA(細胞質(zhì)調(diào)控子)組成二元傳導(dǎo)系統(tǒng)，AIP結(jié)合到傳感器AgrC，促使AgrA磷酸化后，與P2和P3啟動子結(jié)合調(diào)節(jié)RNA II和RNA III表達[12-13]。

RNA III是調(diào)控靶基因表達的重要分子[14]，目前RNA III已被證實不僅可以抑制多種表面蛋白的表達，如葡萄球菌表面蛋白A(SpA)、纖維連結(jié)蛋白A和蛋白B(FnBPA和FnBPB)，同時也可以促進多種毒力蛋白的表達，如δ-溶血素(Hld)、α-溶血素(Hla)、殺白細胞素(PVL)等[12-13,15]。RNAIII的結(jié)構(gòu)模型可被劃分為3個主要的結(jié)構(gòu)域：5′端結(jié)構(gòu)域、中央結(jié)構(gòu)域和3′端結(jié)構(gòu)域。中央結(jié)構(gòu)域可能會經(jīng)歷特異的構(gòu)象變化，而5′端結(jié)構(gòu)域和3′端結(jié)構(gòu)域分別與RNAIII的穩(wěn)定性和調(diào)控蛋白A的表達密切相關(guān)。沒有重疊的5′端結(jié)構(gòu)域和3′端結(jié)構(gòu)域可以與α-溶血素mRNA折疊成非編碼的構(gòu)象前端互補，獨立地促進α-溶血素的表達[11]。

2 銅綠假單胞菌群感效應(yīng)系統(tǒng)

在銅綠假單胞菌中主要有4個QS系統(tǒng)，分別是LasI/LasR系統(tǒng)、RhlI/RhlR系統(tǒng)[16]、喹諾酮類信號(PQS)系統(tǒng)[17]和集成群體感應(yīng)信號(IQS)系統(tǒng)。LasI/LasR系統(tǒng)和RhlI/RhlR系統(tǒng)屬于革蘭氏陰性菌中的LuxI/LuxR系統(tǒng)[18]，其信號分子是高絲氨酸內(nèi)脂(AHL)。lasI和lasR分別編碼高絲氨酸內(nèi)脂同系物OdDHL(N-(3-oxododecanoyl)-homoserine lactone)及其轉(zhuǎn)錄激活因子，rhlI和rhlR則負責編碼BHL(N-butyrylhomoserine lactone)合成酶及其轉(zhuǎn)錄激活因子。當信號分子隨菌群數(shù)量累積到閾值時，LasR-OdDHL和RhlR-BHL二聚體結(jié)合到保守的las-rhl區(qū)域從而啟動下游毒素蛋白表達[12,18-20]。

目前已知有蛋白酶(lasB、lasA、aprA)[21-22]、外毒素A(toxA)[23]、綠膿菌素(phzABCDEFG)[24]、鼠李糖脂(rhlAB)[25]、凝集素(lecA)[26]和氫氰酸(hcnABC)[27]等毒素因子受LasI/LasR系統(tǒng)和RhlI/RhlR系統(tǒng)調(diào)控。RNA-seq分析表明，在銅綠假單胞菌中，LasI/LasR系統(tǒng)和RhlI/RhlR系統(tǒng)同時或單獨控制了約10%的基因表達[28]，與QS有關(guān)的毒素因子大部分受RhlI/RhlR系統(tǒng)激活[12]。

PQS系統(tǒng)的信號分子是2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮(PQS)，Pesci等[29]發(fā)現(xiàn)野生型銅綠假單胞菌PAO1的上清液能誘導(dǎo)lasR缺陷株中l(wèi)asB表達，這證明了PQS系統(tǒng)的存在。pqs操縱子(pqsABCD)、phnAB和pqsH共同參與了PQS的合成[30-31]。首先PqsA活化鄰氨基苯甲酸形成鄰氨基苯酰-輔酶A，隨后鄰氨基苯甲酸在PqsBCD作用下轉(zhuǎn)化為PQS的前體2-庚基-4-喹諾酮(HHQ)[32]。HHQ可以在PqsH作用下轉(zhuǎn)化為PQS，也可以在PqsL作用下轉(zhuǎn)化為N-氧化物，以4-羥基-2-庚喹諾酮-N-氧化物(HQNO)最為常見(圖2)。pqs操縱子啟動區(qū)域的表達受LasI/LasR系統(tǒng)調(diào)控[2,32-33]，也能被PqsR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的直接結(jié)合而控制。目前已知綠膿菌素(PhzABCDEFG)、彈性蛋白酶(LasB)、PA-IL凝集素(LecA)和鼠李糖脂(RhlAB)、氫氰酸[34-36]等毒素的生成與PQS系統(tǒng)的控制有關(guān)。在囊性纖維化病人的痰液、支氣管肺泡液和膿液中，常檢出PQS和其前體物質(zhì)HHQ和衍生物HQNO，因此推測三者具有相似的致毒和感染功能。

圖2 喹諾酮類QS系統(tǒng)信號分子合成示意圖Fig.2 The signal molecules in quinolone signals system

2013年，Lee等[37]報道了一個新的QS系統(tǒng)——IQS系統(tǒng)。abmBCDE基因簇編碼信號分子IQS的產(chǎn)生，當IQS與對應(yīng)的受體IqsR結(jié)合時，啟動IQS系統(tǒng)。他們還發(fā)現(xiàn)，抗代謝物L(fēng)-2-氨基-4-甲氧基-反式-3-丁烯酸(AMB)的合成與IQS系統(tǒng)有關(guān)，通過敲除ambB、PQS合酶基因pqsA或C4HSL合酶基因rhlI后，只能分別通過添加PQS和C4HSL來恢復(fù)ΔpqsA和ΔrhlI中的AMB的合成，而不能通過添加IQS來恢復(fù)。這些發(fā)現(xiàn)表明，AMB的生物合成受IQS通過RhlI/RhlR系統(tǒng)和PQS系統(tǒng)的調(diào)控，這與其他毒力特性(如產(chǎn)黃素)相似[37]。該系統(tǒng)不僅可以監(jiān)測細菌種群密度，而且還可以承載磷酸鹽限制的脅迫。

銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)相互作用，形成了復(fù)雜而精細的級聯(lián)調(diào)控關(guān)系(圖3)。LasI/LasR系統(tǒng)位于級聯(lián)調(diào)控系統(tǒng)的頂端，在銅綠假單胞菌種群數(shù)量達到閾值時[18,38]，形成的LasR-OdDHL復(fù)合物能激發(fā)RhlI/RhlR系統(tǒng)和PQS系統(tǒng)，從而顯現(xiàn)出逐步激活層級系統(tǒng)的特點[39]。RhlI/RhlR系統(tǒng)和PQS系統(tǒng)受LasI/LasR系統(tǒng)調(diào)控的同時，也存在相互調(diào)控，PQS系統(tǒng)促進RhlI/RhlR系統(tǒng)表達，但PQS的合成受RhlI/RhlR系統(tǒng)抑制。RhlR-BHL復(fù)合物不僅能正調(diào)控其本身，同時能反過來正調(diào)控LasI/LasR系統(tǒng)[20]。PQS系統(tǒng)對LasI/LasR系統(tǒng)的表達也有促進作用。IQS系統(tǒng)上連LasI/LasR系統(tǒng)，下接RhlI/RhlR及PQS系統(tǒng)。正常狀態(tài)下，IQS系統(tǒng)受LasI/LasR系統(tǒng)緊密調(diào)控，但當細菌處于磷酸鹽缺乏的環(huán)境中時，IQS系統(tǒng)被激活，部分代替LasI/LasR系統(tǒng)的功能來調(diào)節(jié)毒力因子的產(chǎn)生。IQS系統(tǒng)生物合成的中斷會使RhlI/RhlR及PQS系統(tǒng)麻痹，并減弱細菌的毒力。

圖3 銅綠假單胞菌層級QS系統(tǒng)[6]Fig.3 Schematic representation of the four QS signaling networks in P.aeruginosa[6]

3 金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌群體增殖中的群感效應(yīng)

金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的混合感染易引起食源性疾病的爆發(fā)，同時也是引起囊性纖維化患者感染肺炎、慢性肺炎或造成慢性傷口感染的主要原因[40-41]，兩種微生物之間的相互作用會影響抗菌治療的功效，故受到人們的廣泛關(guān)注。從囊性纖維化患者的年齡來看，體內(nèi)優(yōu)勢菌的檢出率隨年齡增長而變化，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別是患者幼年和中青年時期的優(yōu)勢病原菌。從菌群在慢性傷口的分布來看，傷口表面感染的主要是金黃色葡萄球菌，傷口深層感染的主要是銅綠假單胞菌，兩者并無直接接觸[42]。

近年來，隨著對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌群體增殖研究的逐漸深入，推翻了它們之間只存在競爭關(guān)系的觀點，表明由同一感染部位分離出的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌在毒素分泌、耐藥性以及對抗宿主防御系統(tǒng)等方面存在協(xié)同關(guān)系[41-43]。因此，基于金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌群體增殖中QS的研究對于我們更好地了解很多疾病的發(fā)病機制是很重要的，也有助于我們了解宿主-病原體的相互作用，進而希望能夠通過阻斷或者干涉這些通訊網(wǎng)絡(luò)找到有效的抗菌藥物靶點。

3.1 群感效應(yīng)在群體增殖中的競爭作用

在競爭關(guān)系中，銅綠假單胞菌喹諾酮類信號系統(tǒng)的信號分子HQNO與喹諾酮抗生素有類似的結(jié)構(gòu)，能抑制電子傳遞，對金黃色葡萄球菌的有氧呼吸有抑制作用，因此HQNO也稱為抗葡萄球菌素[44]。HQNO在抑制金黃色葡萄球菌有氧呼吸的同時，誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌發(fā)酵代謝產(chǎn)生乳酸[45]，而銅綠假單胞菌可以利用金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的乳酸[46]。通過RNA-seq分析可以發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌混合培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌無氧呼吸相關(guān)基因上調(diào)表達10～1 000倍[46]。有學(xué)者認為HQNO抑制金黃色葡萄球菌生長的原因是抑制了其有氧呼吸，而HQNO并不能裂解細胞[45]。綠膿菌素是銅綠假單胞菌在生長平臺期和被膜形成過程中大量產(chǎn)生的一種藍綠色的吩嗪類色素[47]，是另一種銅綠假單胞菌對抗金黃色葡萄球菌的重要次級代謝產(chǎn)物，同樣具有抑制金黃色葡萄球菌的有氧呼吸和抑制其生長的作用。在混合培養(yǎng)過程中，金黃色葡萄球菌通過產(chǎn)生小菌落突變株(SCVs)來增加自身生存的可能性[48]。SCV菌落小且光滑，用肉眼難以觀察，在普通平板上生長緩慢。SCV對抗生素有一定抗性，Radlinski等[49]研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌在HQNO作用下會形成SCV狀態(tài)，對萬古霉素具有一定抗性，所以純化的HQNO能保護金黃色葡萄球菌免受萬古霉素的抗菌作用。

銅綠假單胞菌的另一競爭機制是裂解金黃色葡萄球菌，同時銅綠假單胞菌很可能把裂解的金黃色葡萄球菌細胞釋放的含鐵蛋白質(zhì)作為鐵的來源[50]。金黃色葡萄球菌細胞壁的重要成分五甘氨酸可被銅綠假單胞菌分泌的LasA蛋白酶降解。研究表明，LasA存在時，萬古霉素和妥布霉素對金黃色葡萄球菌的抗菌作用增強[49-51]，而LasA缺陷株和經(jīng)熱處理的上清液則無此增強作用。盡管HQNO和LasA均存在于銅綠假單胞菌上清液中，但大多數(shù)實驗結(jié)果表明銅綠假單胞菌在體外能增強抗生素對金黃色葡萄球菌的作用，這可能是因為LasA的增強作用強于HQNO的保護作用[12]。

金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的競爭作用還體現(xiàn)在生物被膜的形成過程中。生物被膜是由大量彼此黏附的微生物細胞以及分泌的胞外聚合物(EPS)所形成的群體,EPS的主要組成成分包括胞外多糖(PIA)和黏附蛋白(adhesive proteins)[52]。微生物依靠形成生物被膜來對抗環(huán)境脅迫，同時也是引起醫(yī)院內(nèi)感染、食品腐敗和水源污染的重要污染源。Mitchell等[53]通過基因表達分析發(fā)現(xiàn)，當金黃色葡萄球菌暴露于HQNO時會激活SigB，從而導(dǎo)致纖連蛋白結(jié)合蛋白A的合成和與生物被膜形成相關(guān)的sarA基因表達增加，相反，金黃色葡萄球菌的agr系統(tǒng)和α-溶血素基因被HQNO抑制。

2014年，Pernet等[54]研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌能操縱宿主以根除金黃色葡萄球菌。當病原菌入侵宿主時，會誘導(dǎo)宿主分泌一種磷酸酯酶sPLA2-IIA以對抗病原菌的入侵，sPLA2-IIA可以選擇性地殺死革蘭氏陽性菌，動物模型已證實了這一現(xiàn)象[54-55]。這種選擇性殺傷主要是由于帶有高負電荷的硫辛酸(LTA)存在于金黃色葡萄球菌的細胞壁上，由于sPLA 2-IIA是一種陽離子酶，在sPLA 2-IIA與LTA的緊密結(jié)合中，促進了sPLA 2-IIA對細胞壁的滲透，從而加速了金黃色葡萄球菌膜磷脂的最終水解[56]。隨著囊性纖維化患者年齡的增長，支氣管上皮細胞分泌磷酸酯酶量增加，最終達到能殺死金黃色葡萄球菌卻對銅綠假單胞菌無影響的水平。這個結(jié)果也解釋了囊性纖維化患者在幼年時期以金黃色葡萄球菌為優(yōu)勢病原菌，在中青年時期轉(zhuǎn)變?yōu)殂~綠假單胞菌的現(xiàn)象[12]。

3.2 群感效應(yīng)在群體增殖中的協(xié)同作用

銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌混合培養(yǎng)過程中，在毒素分泌、耐藥性和對抗宿主免疫系統(tǒng)等方面存在協(xié)同作用。二者共同侵染囊性纖維化患者所引起的肺部炎癥和肺部損傷比單一微生物感染更為嚴重且更難治療[57]，由于治療中頻繁使用抗生素，囊性纖維化患者更有可能攜帶耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，進而引起更嚴重的肺部感染。另外，有實驗表明，KGF1愈合因子在混合感染的豬傷口中的分泌受到抑制；在兔子耳部傷口中，炎癥細胞因子IL-1β和TNF-α表達增加，炎癥反應(yīng)加重[58]。這說明由多微生物感染的慢性傷口更難愈合。

乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine)大量存在于革蘭氏陽性菌細胞壁中，能誘導(dǎo)銅綠假單胞菌PQS系統(tǒng)產(chǎn)生綠膿菌素、彈性蛋白酶、鼠李糖脂和HQNO等相關(guān)毒素[2,45,59]。肽聚糖是構(gòu)成革蘭氏陽性菌細胞壁的主要成分，在果蠅和大蠟蛾感染模型中，可以誘導(dǎo)銅綠假單胞菌產(chǎn)生相關(guān)的毒素因子[60-61]。AI-2是革蘭氏陽性菌廣泛分泌的QS因子，由AI-2介導(dǎo)的QS在不同物種間具有較高的保守性，因此被認為是一種廣泛存在的種間交流系統(tǒng)，能夠完成對多種毒素和被膜基因表達的調(diào)控。銅綠假單胞菌分泌的蛋白酶、鼠李糖脂、外毒素和吩嗪類物質(zhì)已被證實與金黃色葡萄球菌分泌AI-2有關(guān)，此種誘導(dǎo)效應(yīng)在果蠅和大蠟蛾感染模型的體外和體內(nèi)實驗均被觀察到[62]。因此，抑制金黃色葡萄球菌分泌AI-2為我們提供了一種治療金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌混合感染的新思路。Wang等[63]發(fā)現(xiàn)，D-核糖通過干擾AI-2信號影響銅綠假單胞菌的行為，從而顯著降低混合生物被膜中生物總量和大鼠的死亡率，由此說明銅綠假單胞菌毒素表達、生物被膜形成等抑制作用可通過利用AI-2的同系物如D-核糖阻斷AI-2通路實現(xiàn)。綜上，金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的乙酰葡萄糖胺和AI-2對銅綠假單胞菌毒素因子的分泌有誘導(dǎo)作用，這類毒素因子不僅能使銅綠假單胞菌在混合感染中更具優(yōu)勢，還對宿主產(chǎn)生更大的毒害作用[12]。

金黃色葡萄球菌的活性在銅綠假單胞菌的上清液中受到抑制，但同時有實驗表明，將銅綠假單胞菌上清液滴加到生長在上皮細胞或塑料薄片上的金黃色葡萄球菌生物被膜上，可顯著降低金黃色葡萄球菌對萬古霉素的敏感性[64]，這與銅綠假單胞PQS系統(tǒng)的信號分子HQNO有關(guān)。通過構(gòu)建突變株表明，HQNO和綠膿菌素能保護金黃色葡萄球菌免受細胞壁和蛋白質(zhì)的抗生素抑制作用，從而增加金黃色葡萄球菌對萬古霉素的耐藥性[64]。因此，微生物的種間交流作用對生物被膜的耐藥性存在廣泛影響。由于金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌之間的協(xié)同作用，為其混合感染的治理提出了難題，了解QS在微生物群體增殖中的協(xié)同作用，或許為多微生物的治理提供有效的解決思路。

4 總結(jié)與展望

QS系統(tǒng)與食源性致病微生物的毒素分泌、耐藥性、對抗宿主免疫系統(tǒng)及被膜形成等特性的表達密切相關(guān)，已經(jīng)有大量研究者致力于細菌QS的研究。與單一微生物相比，生活中更為常見的是由多微生物共同引起的食品污染，給人類健康和食品安全帶來極大隱患。本文中，筆者以金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌群體作為研究對象，概述了二者的QS系統(tǒng)并總結(jié)了QS在群體增殖中的競爭和協(xié)同作用，有別于前人僅側(cè)重于某一微生物在群體中受到QS調(diào)控的影響。深入了解QS在兩種微生物群體增殖中的作用是治理金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌混合污染的關(guān)鍵，但由于多種微生物種間關(guān)系調(diào)控和交流機制較為復(fù)雜，對群體增殖特性和相互作用機制有待進一步研究，為治理多微生物混合污染提供有力的理論支持。