吳 磊，譚光輝，李杰章，覃媛鈺，張依裕，田 琴

(1.貴州大學 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

蛋殼品質(zhì)是影響家禽生產(chǎn)力的重要性狀，直接影響蛋的保存、運輸和孵化，其優(yōu)劣性受到蛋殼形成過程中礦化作用機制的影響[1-2]。殼體在蛋殼腺體(子宮)中形成，約由95%的碳酸鈣(方解石形式)組成，蛋殼基質(zhì)蛋白是禽蛋殼的重要組成部分，約占蛋殼質(zhì)量的2%[3-4]。蛋殼基質(zhì)在蛋殼形成中起關鍵作用，這些基質(zhì)蛋白由可溶性和不溶性蛋白，糖蛋白和磷酸化蛋白以及蛋白多糖組成[5]?；|(zhì)蛋白作為禽類蛋殼最主要的有機成分，其合成的速度與數(shù)量可能成為影響蛋殼質(zhì)量的重要因素。目前，已鑒定的蛋殼基質(zhì)蛋白達1 000余種，OC-116蛋白是鵪鶉和火雞蛋殼中含量最豐富的蛋殼基質(zhì)成分之一，OC-116基因可能是影響蛋殼性能的關鍵控制基因[6-8]。OC-116基因的編碼區(qū)定位在雞的4號染色體[9]，開放閱讀框(ORF)長為2 411 bp，由5個外顯子組成，外顯子5序列較長，其他外顯子均較短。OC-116蛋白的氨基酸序列中載有2個N糖基化位點和2個二硫化物結(jié)合物，在控制蛋殼鈣化過程中起主要作用[10-12]。在雞個體發(fā)育早期，一旦成骨開始，OC-116就參與了骨的形成，其功能在進一步礦化過程中得以保持，在成年之后參與蛋殼的形成。此外，OC-116能夠顯著影響蛋殼表面有機層的沉積，是雞蛋殼中重要的基質(zhì)組分[13]。楊凌霄等[14]研究證實,OC-116基因能夠調(diào)控方解石晶體的生長與形態(tài)，從而對蛋殼的形成、質(zhì)地以及強度有重要影響。為進一步探索OC-116基因第1外顯子對蛋殼品質(zhì)的遺傳效應，以產(chǎn)蛋高峰期的長順綠殼蛋雞為試驗材料，采用直接測序方法篩選其單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，獲得單倍型與雙倍型，并與蛋殼品質(zhì)進行關聯(lián)性分析，旨在為長順綠殼蛋雞的保種選育和開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

血液/組織/細胞基因組提取試劑盒(DP304)購于天根生化科技有限公司，2×TaqPCR Master Mix 試劑和瓊脂糖購自北京康為世紀生物科技有限公司，DM2000 Marker購自重慶擎科生物科技有限公司。

主要儀器：電泳儀(DYY-2C，北京市六一儀器廠)，化學發(fā)光熒光全自動分析成像儀(Biosens SC710，上海山富科學儀器有限公司)，梯度PCR儀(PTC200，美國Bio-rad公司)，蛋殼強度測定儀(EFR-01)、蛋品質(zhì)分析儀(EA-01)均由北京天翔飛域儀器設備有限公司生產(chǎn)，NANODROP 2000 DNA濃度測定儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 試驗材料

隨機選擇飼養(yǎng)于貴州大學動物科學學院實驗農(nóng)場的同日出雛、健康無病、同等管理條件下的45周齡長順綠殼蛋雞150只，逐只記錄收集產(chǎn)蛋，根據(jù)《家禽生產(chǎn)學》[15]中的方法測定蛋質(zhì)量、蛋形指數(shù)、蛋殼厚度、蛋殼強度、蛋殼質(zhì)量等5個指標。每只雞翅靜脈采血0.2～0.5 mL，參照血液/組織/細胞基因組提取試劑盒(DP304)操作說明書提取基因組DNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳和質(zhì)量濃度測定聯(lián)合評估提取質(zhì)量，稀釋成100 ng/μL進行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物合成及目的片段擴增

根據(jù)雞OC-116基因序列(GenBank登錄號：NC_006091.5)，利用Primer Premier 5.0軟件設計1對引物，F(xiàn):5′-AACCTCACAACATTGCACCC-3′，R：5′-GTTACCTGTGCTGCTTGGAG-3′，擴增區(qū)域位于基因組g.45667542—g.45667966，為第1外顯子區(qū)，引物由上海生工生物公司合成。PCR反應體系：1 μL基因組 DNA，上游引物和下游引物各1 μL，10 μL 2×TaqPCR Master Mix，7 μL RNase-free H2O，總體積為20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性6 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。反應結(jié)束后，135 V電壓下1.5%的瓊脂糖凝膠電泳20 min，凝膠成像儀檢測拍照。

1.4 OC-116基因mRNA二級結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件RNAfold (http：//nibiru.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)對OC-116基因編碼區(qū)序列mRNA二級結(jié)構(gòu)進行預測。

1.5 SNPs篩查和統(tǒng)計分析

應用在線軟件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/)計算SNPs的基因型頻率、等位基因頻率、單倍型頻率、基因型分布卡方值(χ2)、連鎖不平衡的D′值和r2值；采用PopGen32 V1.31軟件計算觀察雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)。參照文獻[16-17]的方法，采用SPSS 19.0軟件中的一般線性模型分析SNPs基因型、雙倍型與蛋殼品質(zhì)的相關性。分析模型：Y=μ+G+e，Y為性狀觀測值，G為基因型效應或雙倍型效應，μ為群體均值，e為隨機殘差。采用最小顯著性差異法進行多重比較，結(jié)果用平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 OC-116基因第1外顯子PCR擴增結(jié)果

利用設計的引物對長順綠殼蛋雞OC-116基因第1外顯子進行擴增，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，經(jīng)過PCR擴增所獲得的目的片段呈現(xiàn)單一明亮的條帶，且PCR擴增產(chǎn)物與預設片段大小相符，擴增產(chǎn)物可用于切膠回收純化測序。

2.2 OC-116基因第1外顯子SNPs鑒定

通過生物信息學軟件DNAStar中的MegAlign和EditSeq程序進行序列比對，結(jié)合測序峰圖鑒定SNPs，在長順綠殼蛋雞OC-116基因第1外顯子上共檢測到2個新的SNPs。g.45667632 T>C突變產(chǎn)生3種基因型TT、CT和CC，g.45667671 G>A突變產(chǎn)生3種基因型GG、AG和AA(圖2)。

圖2 OC-116基因第1外顯子SNPs序列比對

2.3 OC-116基因第1外顯子多態(tài)位點遺傳多樣性分析

由表1可知，長順綠殼蛋雞OC-116基因第1外顯子g.45667632 T>C位點的CT和T為優(yōu)勢基因型和優(yōu)勢等位基因，g.45667671 G>A位點的AG和G分別為優(yōu)勢基因型和優(yōu)勢等位基因，頻率均為0.54和0.61。2個SNPs多態(tài)信息含量(PIC)均為中度多態(tài)，雜合度(He)均較高。通過卡方(χ2)檢驗發(fā)現(xiàn)，2個SNPs基因型分布均未偏離Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.4 OC-116基因第1外顯子連鎖不平衡、單倍型和雙倍型分析

對長順綠殼蛋雞OC-116基因第1外顯子2個SNPs g.45667632 T>C和g.45667671 G>A進行連鎖不平衡分析，D′和r2值均為1，2個SNPs完全連鎖。對長順綠殼蛋雞OC-116基因第1外顯子2個SNPs進行單倍型和雙倍型分析，結(jié)果見表2。由表2可知，在檢測的長順綠殼蛋雞OC-116基因第1外顯子中g.45667632 T>C和g.45667671 G>A位點存在2種單倍型H1和H2，頻率分別為0.61和0.39。共檢測到3種雙倍型，雙倍型H1H2頻率最高，為0.54；其次是雙倍型H1H1，頻率為0.34；雙倍型H2H2頻率最低，為0.12。

表1 OC-116基因第1外顯子多態(tài)位點的遺傳特性

表2 OC-116基因第1外顯子2個SNPs的單倍型和雙倍型Tab.2 Haplotypes and diplotypes of the two SNPs in exon 1 of OC-116 gene

2.5 OC-116基因第1外顯子mRNA序列二級結(jié)構(gòu)分析

對長順綠殼蛋雞OC-116基因的mRNA序列進行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見圖3。CA組合的mRNA序列結(jié)構(gòu)的自由能為-1 351.40 kcal/mol，TG組合的自由能為-1 350.10 kcal/mol，突變引起自由能升高，穩(wěn)定性降低。

2.6 OC-116基因第1外顯子SNPs與長順綠蛋雞蛋殼品質(zhì)的關聯(lián)性分析

圖3 OC-116基因mRNA序列的二級結(jié)構(gòu)

對OC-116基因第1外顯子2個SNPs g.45667632 T>C和g.45667671 G>A與長順綠殼蛋雞蛋殼品質(zhì)進行關聯(lián)性分析，結(jié)果見表3。由表3可知，基因型CC和AA在蛋質(zhì)量上顯著高于基因型TT和GG(P<0.05)，雙倍型H2H2在蛋質(zhì)量上顯著高于雙倍型H1H1(P<0.05)；基因型TT和GG在蛋形指數(shù)上顯著高于基因型CT和AG(P<0.05)，雙倍型H1H1在蛋形指數(shù)上顯著高于雙倍型H1H2(P<0.05)；基因型CT和AG在蛋殼強度上顯著高于基因型TT和GG(P<0.05)，雙倍型H1H2在蛋殼強度上顯著高于雙倍型H1H1(P<0.05)。各基因型和雙倍型的蛋殼厚度、蛋殼質(zhì)量均無明顯差異。

表3 OC-116基因第1外顯子SNPs與長順綠殼蛋雞蛋殼品質(zhì)的關聯(lián)性分析

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

雖然雞蛋殼僅占蛋總質(zhì)量的約10%，但它具有為蛋提供微生物和物理保護的重要功能，在確保食品安全和更好的孵化率方面發(fā)揮著關鍵作用。蛋殼損壞是一個嚴重的問題，是養(yǎng)禽業(yè)的重大經(jīng)濟損失，據(jù)估計，因蛋殼質(zhì)量問題損失的雞蛋占產(chǎn)蛋總量的8%～11%[17]。OC-116蛋白首先在蛋殼中鑒定到，是雞蛋殼基質(zhì)的主要成分，參與蛋殼鈣化，對蛋殼品質(zhì)有重要的影響[18]。AHMED等[19]證明，老齡母雞強制換羽后蛋殼強度顯著變好，而蛋殼基質(zhì)中的OC-116含量也顯著增加，發(fā)現(xiàn)OC-116與蛋殼表面有機層的沉積密切相關。本研究對長順綠殼蛋雞OC-116基因第1外顯子區(qū)進行SNPs檢測，共篩選到2個為中度多態(tài)且完全連鎖的SNPs，為g.45667632 T>C和g.45667671 G>A，2個SNPs均產(chǎn)生3種基因型?；蛟谂渥又械碾S機分離和在合子里的隨機重組都會導致一定的誤差，引起基因頻率的變化，即隨機漂變引起基因頻率偏離Hardy-Weinberg平衡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)的2個SNPs均未偏離Hardy-Weinberg平衡，說明未受到突變、選擇、遺傳漂變等的影響，或者是受到影響而由于長期的人工選擇并進行大規(guī)模擴群后又重新處于一種新的平衡狀態(tài)。2個突變位點聯(lián)合產(chǎn)生2種單倍型和3種雙倍型，理論上應該有4種單倍型(缺少H3/CG和H4/TA)和10種雙倍型，實際觀察值與理論值存在差異，可能是由于長期人工選育導致或者根本不存在H3和H4單倍型。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，基因變異使mRNA二級結(jié)構(gòu)自由能升高，穩(wěn)定性降低，且有可能對蛋白質(zhì)的翻譯造成影響[21]。

OC-116在骨骼和蛋殼礦化中發(fā)揮作用，為蛋殼基質(zhì)的主要蛋白質(zhì)之一，決定了蛋殼強度、蛋殼厚度，最終確定了蛋的形狀[2]。作為蛋殼基質(zhì)蛋白之一，OC-116已被鑒定是雞蛋殼蛋白質(zhì)組中最豐富的蛋白質(zhì)[22-24]。HINCKE等[25]和SOCHA等[26]均報道，OC-116作為最豐富的蛋殼基質(zhì)蛋白，與蛋形指數(shù)、蛋殼厚度和蛋殼強度有關。張璐[27]報道，OC-116基因多態(tài)性對蛋殼厚度和蛋殼強度有極顯著影響。蛋形指數(shù)衡量蛋的形狀是否正常，正常蛋形指數(shù)是1.30～1.35，高于或低于此值則為不正常，影響種蛋孵化率；蛋殼厚度、蛋殼質(zhì)量受品種、氣候、飼料、生產(chǎn)日齡以及產(chǎn)蛋雞內(nèi)分泌功能的影響，蛋殼強度是蛋殼耐壓程度的大小。本研究對長順綠殼蛋雞OC-116基因第1外顯子SNPs與蛋殼品質(zhì)進行關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，基因型CC、AA和雙倍型H2H2在蛋質(zhì)量上顯著高于基因型TT、GG和雙倍型H1H1(P<0.05)，基因型TT、GG和雙倍型H1H1在蛋形指數(shù)上顯著高于基因型CT、AG和雙倍型H1H2(P<0.05)，基因型CT、AG和雙倍型H1H2在蛋殼強度上顯著高于基因型TT、GG和雙倍型H1H1(P<0.05)。綜合考慮，基因型CC、AA是改善蛋殼品質(zhì)的有利基因型，雙倍型H2H2是改善蛋殼品質(zhì)的有利雙倍型。