胡 嫻，彭 濤，王 逗，侯海軍，秦紅靈，陳香碧，陳春蘭

(1.中國科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410000； 2.湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

土壤微生物是重要的生物類群，在物質(zhì)循環(huán)和能量流動中起著重要的作用[1-2]，與土壤肥力及土壤健康關(guān)系密切，也是反映生態(tài)環(huán)境健康的重要指標(biāo)之一[3]。近年來，宏基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，如土壤微生物DNA/RNA的高通量測序、基因芯片技術(shù)等,可以直接在基因水平上研究土壤微生物的特性和功能，為探索土壤微生物群落功能開啟了新途徑[4]，而從土壤環(huán)境中提取高質(zhì)量的微生物DNA是關(guān)鍵步驟。探尋快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、高效的土壤微生物DNA提取方法是土壤微生物研究和利用的基礎(chǔ)[5]，已成為國內(nèi)外研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，關(guān)于土壤微生物DNA的提取方法較多[6-11]。ZHOU等[9]提出的土壤微生物DNA提取方法應(yīng)用較廣泛，但土壤樣品及試劑用量較大，耗時較長，不利于大量樣品的處理。陳春蘭等[10]改進(jìn)的SDS-GITC-PEG土壤微生物DNA提取方法在樣品與試劑用量上取得一定優(yōu)勢，耗時也有一定縮短，試驗(yàn)操作更為簡便。QIN等[11]對土壤微生物DNA提取方法進(jìn)一步優(yōu)化，將土壤樣品用量減少到0.3 g，同時加入玻璃珠破碎使提取效率更高，此法對水稻土中微生物DNA的提取效果良好，但對旱地土壤DNA的提取效果很差(前期研究)。為此，本研究對QIN等[11]的方法(簡稱QIN法)進(jìn)行了改良，旨在建立一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、高效并適用于旱地土壤微生物DNA的提取方法，為后續(xù)的微生物分子生態(tài)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤 供試稻田土為多年種植雙季稻土壤，采自湖南省益陽市水稻豐產(chǎn)節(jié)水節(jié)肥試驗(yàn)田(29°08′N、112°27′E)，土壤母質(zhì)為湖積物，質(zhì)地為粉(砂)壤土，其理化性質(zhì)[12]：土壤pH值為6.16，銨態(tài)氮含量60.91 mg/kg，硝態(tài)氮含量3.38 mg/kg，可溶性有機(jī)碳含量417.74 mg/kg。旱地土來自湖南省桃源縣寶洞峪試驗(yàn)站(111°26′E、28°55′N)，母質(zhì)為第四紀(jì)紅壤，其土壤黏粒含量較高，結(jié)構(gòu)差，持水性能差；土壤pH值為4.55、銨態(tài)氮含量65.30 mg/kg、硝態(tài)氮含量0.28 mg/kg、可溶性有機(jī)碳含量512.54 mg/kg、有機(jī)質(zhì)含量13.81 g/kg、全氮含量0.84 g/kg、全磷含量0.38 g/kg、全鉀含量12.33 g/kg、堿解氮含量77.81 mg/kg、速效磷含量6.05 mg/kg、速效鉀含量103.40 mg/kg。

1.1.2 主要試劑 0.5 mm玻璃珠；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液(5% CTAB、 0.7 mol/L氯化鈉和0.12 mol/L磷酸鉀緩沖液)；20%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液；酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)混合液，pH值8.0；氯仿-異戊醇(24∶1)混合液；PEG 溶液(V50% PEG 6000∶V4 mol/L NaCl=3∶2)；75%乙醇溶液；DNA Marker DL 2000；Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒(MP BIO)。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺、臺式高速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf)、FastPrep-24快速核酸提取儀(MP BIO)、G:BOX F3凝膠成像系統(tǒng)、溫度梯度變溫PCR儀(德國Eppendorf)、NanoDrop One超微量分光光度計(Thermo Scientific)、 -80 ℃低溫冰柜(美國REVCO)、水平瓊脂糖電泳裝置(美國BioRad)。

1.2 土壤微生物DNA的提取方法

1.2.1 QIN法 土壤微生物DNA的提取參照QIN等[11]的方法。

1.2.2 改良的QIN法 土壤微生物DNA的提取參照QIN法并進(jìn)行改良。主要進(jìn)行了2個步驟的修改：(1)稱0.3 g干土加入300 μL無菌水，于-80 ℃過夜；(2)研究加入CTAB和SDS的最適配比，設(shè)置加入CTAB、SDS的總體積為500 μL。設(shè)2組不同梯度CTAB、SDS溶液的體積(μL)比，第一組(加玻璃珠)：500∶0、400∶100、300∶200、200∶300、100∶400、0∶500；第二組(不加玻璃珠)：125∶375、100∶400、75∶425、50∶450、25∶475、0∶500。具體步驟如下：

1)稱0.3 g玻璃珠和0.3 g干土于1.5 mL EP管中，加入300 μL無菌水，于-80 ℃過夜。

2)加入100 μL CTAB、400 μL SDS、500 μL酚-氯仿-異戊醇溶液，混勻。

3)Fast-Prep-24快速核酸提取儀5.5 m/s裂解細(xì)胞30 s，4 ℃ 20 000×g離心10 min。

4)取出上清于另一新EP管中，加等體積氯仿-異戊醇溶液，混勻，4℃ 20 000×g離心5 min。

5)取出上清于另一新EP管中，加2倍體積PEG 溶液，混勻，室溫放置1～2 h 或者 4 ℃過液。

6)4 ℃ 20 000×g離心10 min，棄上清，加200 μL預(yù)冷75%乙醇洗滌沉淀3次,離心1 min，棄上清，干燥20 min。

7)加30 μL無菌水溶解， -80 ℃保存，備用。

1.2.3 試劑盒法 采用MP BIO公司的土壤提取試劑盒FastDNA Spin Kit for Soil進(jìn)行土壤微生物DNA提取，方法見使用說明書。

1.3 DNA含量和純度檢測

使用Thermo Scientific公司的NanoDrop One超微量分光光度計測定DNA的含量、A260/A280以及A260/A230。用1%瓊脂糖凝膠對土壤微生物DNA質(zhì)量進(jìn)行電泳檢測。

1.4 16S rDNA序列PCR擴(kuò)增

以土壤DNA樣品為模板，擴(kuò)增16S rDNA序列以檢測DNA質(zhì)量是否滿足PCR擴(kuò)增要求。用16S rDNA的通用引物1369F、1492R進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列分別為5′-CGGTGAATACGTTCYCGG-3′，5′-GGWTACCTTGTTACGACT-3′。PCR擴(kuò)增體系為25 μL：引物各1 μL，Taq酶混合液12.5 μL，模板 (土壤DNA)1 μL，加ddH2O至總體積達(dá)到25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，共設(shè)35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 QIN法提取稻田土和旱地土微生物DNA效果的比較

用QIN法提取稻田土和旱地土微生物DNA(表1、圖1)發(fā)現(xiàn)，對稻田土微生物DNA的提取效果較好，但對旱地土微生物的DNA提取效果不佳，含量低，僅為1.11 μg/g，無法用瓊脂糖凝膠電泳檢測到。因此，此法適合于稻田土微生物DNA的提取，而不適用于旱地土微生物DNA的提取。

表1 QIN法提取稻田土和旱地土微生物DNA的含量和純度Tab.1 Content and purity of microbial DNA extracted from paddy soil and dryland soil by the QIN’s method

M: DNA Marker DL 2000，下同；1—6：提取的土壤DNAM: DNA Marker DL 2000，the same below; 1—6:Microbial DNA extracted from soil圖1 QIN法提取稻田土(A)和旱地土(B)微生物DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis detection of microbial DNA extracted from paddy soil (A) and dryland soil(B)

2.2 旱地土DNA提取方法的改良

2.2.1 CTAB/SDS體積比對DNA提取效果的影響 在QIN法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，對細(xì)胞裂解劑CTAB/SDS加入比例進(jìn)行試驗(yàn)。由表2可知，在加入CTAB、SDS體積比為100∶400、0∶500時，得到的DNA含量分別為2.70、440.13 μg/g,但由圖2可見，后者所提取的DNA已降解。通過對所提取DNA純度進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，CTAB、SDS體積比為100∶400時，A260/280和A260/230均較高，說明該配比下所提取DNA純度較高，蛋白質(zhì)和腐植酸等雜質(zhì)的污染較小。且通過凝膠電泳也能檢測出完整DNA條帶，其他體積配比均未見DNA條帶(圖2)。因此，在添加玻璃珠情況下，CTAB、SDS體積比為100∶400時，所提取旱地土微生物DNA濃度及純度最好。

表2 不同CTAB/SDS配比提取旱地土微生物DNA的含量和純度Tab.2 Content and purity of microbial DNA extracted from dryland soil with different ratios of CTAB to SDS

1: CTAB 500 μL,SDS 0 μL; 2: CTAB 400 μL,SDS 100 μL; 3: CTAB 300 μL,SDS 200 μL; 4: CTAB 200 μL,SDS 300 μL; 5: CTAB 100 μL,SDS 400 μL; 6: CTAB 0 μL,SDS 500 μL圖2 不同CTAB/SDS配比提取旱地土微生物DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis detection of microbial DNA extracted from dryland soil with different ratios of CTAB to SDS

2.2.2 玻璃珠對DNA提取效果的影響 添加玻璃珠有助于微生物細(xì)胞的裂解，同時也可能促使DNA降解成小片段，或者提取效果不明顯而增加步驟和成本，所以在調(diào)節(jié)CTAB/SDS配比基礎(chǔ)上，對是否添加玻璃珠進(jìn)行試驗(yàn)。從表3可以看出，不添加玻璃珠，CTAB/SDS的配比為100∶400時DNA濃度和質(zhì)量較好，25∶475和0∶500時雖然DNA含量很高，但純度不夠，可能是蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染造成。通過凝膠電泳結(jié)果(圖3)也發(fā)現(xiàn)，不添加玻璃珠，CTAB/SDS的配比為100∶400和75∶425時有條帶，而前者的條帶較亮，25∶475和0∶500 時的DNA已降解，說明不添加玻璃珠時，旱地土微生物DNA提取的CTAB/SDS最適配比為100∶400。通過表2(添加玻璃珠)和表3(不添加玻璃珠)可知，在CTAB/SDS最適配比下，添加玻璃珠對旱地土微生物DNA提取的含量及純度均高于不添加玻璃珠。因此，在QIN法基礎(chǔ)上確定改良法為：添加玻璃珠，CTAB/SDS的體積配比為100∶400。

表3 不添加玻璃珠提取旱地土微生物DNA的含量和純度Tab.3 Content and purity of microbial DNA extracted from dryland soil without glass beads

1: CTAB 125 μL,SDS 375 μL; 2: CTAB 100 μL,SDS 400 μL; 3: CTAB 75 μL,SDS 425 μL; 4: CTAB 50 μL,SDS 450 μL; 5: CTAB 25 μL,SDS 475 μL; 6: CTAB 0 μL,SDS 500 μL圖3 不添加玻璃珠提取旱地土微生物DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis detection of microbial DNA extracted from dryland soil without glass beads

2.3 改良QIN法和試劑盒法提取旱地土微生物DNA效果的比較

利用改良QIN法和試劑盒法提取旱地土壤微生物DNA，結(jié)果見表4。從表4可以看出，改良QIN法得到的DNA含量比試劑盒法低，而質(zhì)量比試劑盒法好。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖4)發(fā)現(xiàn)，2種方法均得到比較完整的DNA片段。因此，綜合分析DNA含量、純度以及成本，選取改良QIN法作為本試驗(yàn)的DNA提取方法。

2.4 16S rDNA序列PCR擴(kuò)增

用上述改良QIN法所提取的旱地土壤DNA 為模板進(jìn)行16S rDNA PCR 擴(kuò)增，均可擴(kuò)增出明亮的150 bp的目標(biāo)條帶(圖5)，表明提取的DNA質(zhì)量良好，不需純化即可用于PCR 擴(kuò)增。

表4 改良QIN法和試劑盒法提取旱地土壤微生物DNA的含量和純度比較Tab.4 Content and purity of microbial DNA extracted from dryland soil by modified QIN’s method and reagent box method

續(xù)表4 改良QIN法和試劑盒法提取旱地土壤微生物DNA的含量和純度比較Tab.4(Continued) Content and purity of microbial DNA extracted from dryland soil by modified QIN’s method and reagent box method

3 結(jié)論與討論

利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)研究土壤微生物的前提條件是提取高質(zhì)量的土壤微生物DNA，而土壤類型、肥力及質(zhì)量存在差異，導(dǎo)致一種土壤DNA提取法無法滿足某些土壤DNA提取要求,因此，選取適合某種土壤類型的有效的DNA提取方法至關(guān)重要。前人[11,13]對水稻土土壤微生物DNA的提取方法已有比較成熟的研究，而此水稻土微生物DNA提取法對旱地土壤中微生物DNA的提取效果較差，無法滿足后續(xù)分子技術(shù)試驗(yàn)要求。因此，一種簡便高效經(jīng)濟(jì)的旱地土壤微生物DNA提取法的探索迫在眉睫。

QIN等[11]的方法可以高效提取第四紀(jì)紅壤發(fā)育的水稻土中微生物DNA，而紅壤旱地土壤中腐植酸、重金屬離子、多糖類物質(zhì)等成分與水稻土存在差別，這些因素影響了DNA的提取效果及后續(xù)的PCR擴(kuò)增[14-19]。因此，在QIN法基礎(chǔ)上對土壤微生物DNA提取法進(jìn)行改進(jìn)。在改良方法試驗(yàn)中，對土壤樣品進(jìn)行預(yù)處理，稱0.3 g干土加入300 μL無菌水，于-80 ℃過夜，是因?yàn)楹档赝寥浪趾枯^低，增加水分可以使土壤微生物得到活化，有利于土壤微生物DNA的提取，同時，在-80 ℃過夜，控制了土壤微生物活化溫度及時間，能更好地維持土壤微生物原有豐度。研究表明，在28 ℃加水培養(yǎng)28 d后的風(fēng)干土中，氨氧化古菌和細(xì)菌的種群數(shù)量大多出現(xiàn)增加趨勢，但其物種組成未發(fā)現(xiàn)顯著變化[20]。改良QIN法通過對細(xì)胞裂解液CTAB與SDS溶液的加入體積配比，以及是否添加玻璃珠裂解微生物細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，選擇出可適用于紅壤旱地土壤微生物DNA提取的方法。與ZHOU等[9]的傳統(tǒng)方法相比，此改良方法所需土壤樣品量極少，約是ZHOU等[9]方法(需樣5.0 g)的6%，且過程更簡便、快速，每次可進(jìn)行更多樣品的處理，更能滿足于當(dāng)前對大批量樣品的研究需求。改良QIN法與試劑盒法相比，土壤微生物DNA提取效率略低，但純度較高，且更加經(jīng)濟(jì)，同時能滿足后續(xù)PCR等試驗(yàn)的要求。因此，該改良法是一種適合紅壤旱地土的既經(jīng)濟(jì)又高效的土壤微生物DNA提取方法。