孟 昂，王 萌，趙曉燕，朱運(yùn)平，張曉偉，劉紅開，朱海濤

營養(yǎng)品質(zhì)

超聲波聯(lián)合研磨破壁法提取雨生紅球藻中蝦青素的工藝研究

孟 昂1，王 萌1，趙曉燕1，朱運(yùn)平2，張曉偉1，劉紅開1，朱海濤1

（1. 濟(jì)南大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)系，山東 濟(jì)南 250022；2. 北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048）

在比較研究并確定破壁方法與溶解試劑的基礎(chǔ)上，利用超聲輔助提取方法探索不同條件下從雨生紅球藻中提取蝦青素的效果，并通過響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明，采用液氮研磨破壁處理，以乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）作為提取溶劑在超聲時間18 mins、超聲溫度39 ℃、液料比9∶50（mL/mg）、超聲功率200 W條件下進(jìn)行震蕩超聲處理，最后于40 ℃水浴振蕩20 mins，蝦青素提取率可達(dá)85.1%。

雨生紅球藻；蝦青素；液氮研磨破壁；溶解試劑；超聲輔助提取

蝦青素（Astaxanthin，AXT）是一種橙紅色色素，主要存在于藻類（如雨生紅球藻）和海洋生物（如撒蒙魚）中。其生物合成途徑可分為兩個階段，一部分是先經(jīng)MEP途徑及MVA途徑合成β-胡蘿卜素，然后由β-胡蘿卜素經(jīng)β-隱黃素→金盞花黃質(zhì)→玉米質(zhì)途徑或經(jīng)β-胡蘿卜素-4-酮→斑蝥黃質(zhì)→金盞花紅素途徑合成AXT[1]。由于AXT分子中含有親脂性主體長鏈和親水性端部，可使其較好的嵌入細(xì)胞膜內(nèi)且不對膜造成損傷，從而有效發(fā)揮抗氧化等生物活性。

從天然材料中提取AXT的常規(guī)技術(shù)通常依賴于使用有機(jī)溶劑的固液萃取而無較多輔助因素的參與，導(dǎo)致提取率較低[2]。目前發(fā)展的一些高效提取方法如超分子溶劑提取、磁輔助提取、離子液體介導(dǎo)，由于成本太高而無法普遍應(yīng)用[3]。超聲輔助提?。║AE）是一種聲波輔助分離系統(tǒng)，即在常規(guī)提取方法的基礎(chǔ)上，利用超聲機(jī)械作用，使溶劑最大程度地滲透到材料組織中，從而增加固相和液相之間的接觸表面積，使溶質(zhì)迅速從固相擴(kuò)散到溶劑中，提高提取率[4]。本實(shí)驗(yàn)以雨生紅球藻為原料，先進(jìn)行破壁條件與浸提溶劑的篩選，在此基礎(chǔ)上利用UAE探索不同條件下從雨生紅球藻中提取AXT的效果，并通過進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出最佳提取工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AXT標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；雨生紅球藻：云南時光印記生物科技有限公司；乙醇、乙酸乙酯：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SHZ-C恒溫水浴震蕩鍋：常州市國旺儀器制造有限公司；V-5000可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；KQ3200DB數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LCJ-IIB低速大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；電子分析天平：上海佑科儀器儀表有限公司；TGL16M臺式高速冷凍離心機(jī)：鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AXT標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取5 mgAXT標(biāo)品，用乙酸乙酯：乙醇（v/v：1∶2）溶液溶解并定容至50 mL，即得到100 μg/mL的AXT標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后稀釋至10 μg/mL，經(jīng)紫外可見光譜掃描[5-6]，如圖1所示，可得到最大吸收波長（480 nm）。在測定標(biāo)準(zhǔn)曲線時用10 μg/mL的溶液分別稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4 μg/mL，然后在480 nm處測定吸光度。

1.2.2 破壁方法的確定

玻璃珠振蕩破壁[7]：稱取200 mg藻粉置于棕色帶蓋錐形瓶，沿瓶壁依次放入10個玻璃球，加入10 mL乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）混合試劑，蓋蓋并用封口膜密封，將樣品瓶置于恒溫水浴振蕩器，40 ℃、180 r/min振蕩提取60 min，經(jīng)10 000 r/min離心并過濾，收集濾液然后進(jìn)行定容、稀釋、比色測定。以不加玻璃球作對照。

圖1 AXT標(biāo)準(zhǔn)品全波長掃描圖譜

低溫研磨法破壁[8]：稱取適量藻粉經(jīng)液氮研磨兩次，每次0.5 min，準(zhǔn)確稱200 mg藻粉置于棕色錐形瓶，加入10 mL乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）混合試劑，將樣品瓶置于恒溫水浴振蕩器，40 ℃、180 r/min振蕩提取60 min，經(jīng)10 000 r/min離心并過濾，收集濾液然后進(jìn)行定容、稀釋、比色測定。以不用液氮研磨作對照。

1.2.3 提取溶劑的確定

有文獻(xiàn)已表明乙酸乙酯-乙醇混合試劑對AXT的提取效果明顯優(yōu)于乙酸乙酯[9]，故本文選擇乙酸乙酯-乙醇混合試劑作為提取試劑，研究不同混合比例對提取效果的影響。分別稱取200 mg經(jīng)低溫研磨處理后的藻粉放入棕色三角瓶，各加入10 mL乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶1；1∶2；1∶3）混合試劑，將樣品瓶置于恒溫水浴振蕩器，40 ℃、180 r/min振蕩提取60 min，經(jīng)10 000 r/min離心并過濾，收集濾液然后進(jìn)行定容、稀釋、比色測定。

1.2.4 超聲輔助提取雨生紅球藻中AXT及AXT含量的測算

提取步驟：稱取100 mg處理后的藻粉→加入適量乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）混合試劑→超聲處理→40 ℃水浴振蕩20 min→4 800 r/min離心20 min→收集上清液→稀釋100倍→480 nm下測吸光度。

取0.1 mLAXT提取液置于10 mL容量瓶中，并用乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）混合試劑定容至刻度線，在480 nm處測定吸光值。根據(jù)公式（1）計算AXT提取率[9]：

：AXT提取率；：AXT濃度；：稀釋倍數(shù)；：提取液定容體積；M：藻粉質(zhì)量。

1.2.5 紫外吸收光譜的檢測

取適量AXT提取液，以乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）混合試劑作空白對照，在200~1 000 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外可見分光光度掃描，檢測提取液性質(zhì)[10]。

1.2.6 超聲處理單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 超聲時間對提取率的影響 選擇超聲時間為0、5、10、15、20、25、30、40 min，在超聲功率為200 W，超聲溫度40 ℃，添加試劑20 mL（100 mg藻粉）的條件下進(jìn)行震蕩超聲處理，以提取率作為衡量指標(biāo)，確定最佳超聲時間。

1.2.6.2 超聲溫度對提取率的影響 選擇超聲溫度為0、30、35、40、45、50 ℃，在超聲功率為200 W，超聲時間15 min，添加試劑20 mL（100 mg藻粉）的條件下進(jìn)行震蕩超聲處理，以提取率作為衡量指標(biāo)，確定最佳超聲溫度。

1.2.6.3 超聲功率對提取率的影響 選擇超聲功率為80、120、160、200 W，在超聲溫度40 ℃，超聲時間15 min，添加試劑20 mL（100 mg藻粉）的條件下進(jìn)行震蕩超聲處理，以提取率作為衡量指標(biāo)，確定最佳超聲功率。

1.2.6.4 液料比對提取率的影響 選擇添加試劑為5、10、15、20、25、30、40 mL（100 mg藻粉），在超聲溫度40 ℃，超聲時間15 min，超聲功率200 W的條件下進(jìn)行震蕩超聲處理，以提取率作為衡量指標(biāo)，確定最佳液料比。

1.2.6.5 震蕩超聲對提取率的影響 在超聲溫度40 ℃，超聲時間15 min，超聲功率200 W，添加試劑20 mL（100 mg藻粉）的條件下，一份選擇震蕩超聲處理，一份選擇則靜置超聲處理，以提取率作為衡量指標(biāo)，確定震蕩超聲處理效果。

1.2.7 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert.V8. 0.6軟件[11]，以AXT提取率為響應(yīng)值（），選擇液料比（100 mg藻粉）、超聲時間、超聲溫度為變量進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計。實(shí)驗(yàn)參數(shù)安排如表1。

表1 因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 AXT標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)方法1.2.1得出AXT濃度與吸光值的關(guān)系并繪制AXT標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2?？傻没貧w方程= 0.281 8+ 0.028 4，2 = 0.998 7，其中為AXT濃度，為吸光值。

圖2 AXT標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 破壁方法的確定

以不經(jīng)任何處理樣品作為對照，選擇不同破壁方法處理藻粉結(jié)果如圖3。以吸光值作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，可以看出，與對照組（0.767）相比，藻粉經(jīng)液氮研磨破壁處理后，AXT的提取效果（0.778）增強(qiáng)，而加入玻璃球震蕩輔助提?。?.768）的作用效果無變化。故該實(shí)驗(yàn)選擇破壁方法為液氮研磨破壁。

圖3 不同破壁方法對AXT提取效果的影響

2.3 提取溶劑的確定

選擇被批準(zhǔn)用于食品加工工藝的有機(jī)溶劑[12]：乙醇和乙酸乙酯，并進(jìn)行提取試劑的篩選，結(jié)果如圖4。以吸光值作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，從圖中可以看出，混合試劑的提取效果順序?yàn)橐宜嵋阴?乙醇混合試劑v/v：1∶2>v/v：1∶1>v/v：1∶3，且v/v：1∶1與v/v：1∶3，提取效果無明顯變化。本實(shí)驗(yàn)選擇提取試劑為乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）混合試劑。

圖4 不同提取溶劑對AXT提取效果的影響

2.4 紫外吸收光譜的檢測

圖5為AXT提取液全波長掃描圖譜，可以看出，AXT提取液在波長為480 nm處有最大吸收峰，其測定結(jié)果與AXT標(biāo)準(zhǔn)品一致，可以說明提取液中AXT作為主要成分存在。

圖5 AXT提取液全波長掃描圖譜

2.5 超聲處理單因素實(shí)驗(yàn)

2.5.1 超聲時間對提取率的影響

以提取率及提取量作為比較參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。可以看出，AXT提取率的變化趨勢隨超聲時間的延長先升后降，且在超聲時間為20 min時達(dá)到最大，提取效果可達(dá)85.8%，AXT含量為17.16 μg/mg。而在超聲20 min之后，AXT的提取效果呈明顯下降，其原因是超聲的穿透作用導(dǎo)致AXT的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[13]，體現(xiàn)在吸光值的降低。本實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取時間為20 min。

圖6 超聲時間對AXT提取效果的影響

2.5.2 超聲溫度對提取率的影響

以提取率及提取量作為比較參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。在40 ℃之前，AXT提取率隨溫度的升高而升高，達(dá)到40 ℃時，提取率達(dá)到最大82.6%，AXT含量為16.52 μg/mg。繼續(xù)升高溫度，提取率不增反降，其原因可能是在于AXT經(jīng)超聲波作用后，其結(jié)構(gòu)中C==C、—OH、—CHO等基團(tuán)更易受到熱力作用而降解[14]，從而影響提取量?？紤]到AXT本身是一種不耐熱分子，本實(shí)驗(yàn)避免出現(xiàn)40 ℃以上的溫度。

圖7 超聲溫度對AXT提取效果的影響

2.5.3 超聲功率對提取率的影響

以提取率及提取量作為比較參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。AXT提取率隨超聲功率的增強(qiáng)而上升，當(dāng)超聲功率達(dá)到最大時，AXT提取率可達(dá)80.9%，此時AXT含量為16.17 μg/mg。從提升效果角度可以看出，在超聲功率160 W以后，AXT的提取效果趨于平緩，其原因是在超聲波機(jī)械力的作用下，固液兩相接觸接近飽和[15]，所以提取趨勢增幅減緩。本實(shí)驗(yàn)選擇超聲功率200 W。

圖8 超聲功率對AXT提取效果的影響

2.5.4 液料比對提取率的影響

以提取率及提取量作為比較參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。從總體變化趨勢可以看出，隨著提取試劑的加入，AXT提取率呈先升高后下降趨勢，AXT最大提取率在料液比為1∶5時，此時AXT提取量可達(dá)16.86 μg/mg。在液料比1∶20至1∶5之間，AXT提取率的變化平緩，而當(dāng)液料比大于1∶5后，AXT的提取呈明顯降低趨勢，其原因是由于溶劑量的增大，超聲波帶來的空化作用增強(qiáng)[16]，即進(jìn)入溶液中氣泡的數(shù)量增多而帶入過多的氧氣，AXT與氧氣的接觸導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的破壞呈現(xiàn)提取率的下降。本實(shí)驗(yàn)選擇超聲料液比為1∶5。

圖9 料液比對AXT提取效果的影響

2.5.5 震蕩超聲對提取率的影響

以提取率及提取量作為比較參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖10所示。與靜置超聲處理藻粉相比，在震蕩超聲條件下，AXT提取效果有明顯上升的趨勢，提取量可從14 μg/mg增加到16.4 μg/mg。在震蕩條件下，AXT分子可以從粉體細(xì)胞中快速游離出來而充分溶解于提取溶劑，本實(shí)驗(yàn)選擇震蕩超聲。

圖10 震蕩超聲對AXT提取效果的影響

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.6.1 回歸模型的建立

通過方法1.2.7得出響應(yīng)值如表2所示，利用表2響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)一步做出方差分析如表3，得到液料比、超聲溫度、超聲時間對提取率的影響模型（%）=85.00–2.25–3.14–1.89– 1.45–1.75–0.075–2.512–9.592–4.392，2=0.993 7。由表3可知，<0.000 1，顯著水平極其明顯，且失擬相=0.110 9，則該模型成立。通過值可知，除項(xiàng)交互作用對的影響不顯著外，、、、、、2、2、2各項(xiàng)對均有顯著影響。該模型2adj=0.985 5，表明AXT提取效果的變化有98.55%來自于本實(shí)驗(yàn)設(shè)定 因素，可利用該模型對AXT的提取條件進(jìn)行優(yōu)化選擇。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果

表3 回歸方程方差分析表

注：**代表極顯著水平<0.01。

2.6.2 各因素的交互作用

設(shè)定因素交互作用對AXT提取率的影響如圖11~13所示。通過曲面弧度及等高線陡度反應(yīng)設(shè)定因素交互作用強(qiáng)度，可以看出，、項(xiàng)等高線圖均呈現(xiàn)橢圓形，且3D響應(yīng)曲面弧度呈現(xiàn)先升后降趨勢，說明、項(xiàng)對AXT得率影響較大；而項(xiàng)等高線幾乎為圓形，說明BC項(xiàng)對AXT的得率幾乎無影響，與2.5.1結(jié)論對應(yīng)。通過Design-Expert 8.0.6可得設(shè)定單元提取AXT最優(yōu)配比：液料比18.21 mL，超聲時間18.57 min，超聲溫度38.67 ℃，此配比下AXT提取率高達(dá)85.75%。從實(shí)際操作角度考慮，現(xiàn)把設(shè)定單元分別改成18 mL、18 min、39 ℃，以此作為新設(shè)定單元并進(jìn)行驗(yàn)證，最終提取結(jié)果為85.1%，與統(tǒng)計軟件預(yù)測分析值相比，幾乎無明顯差異。說明該數(shù)據(jù)模型可用于實(shí)際操作當(dāng)中。

圖11 AB響應(yīng)面3D圖及等高線

圖12 AC響應(yīng)面3D圖及等高線

圖13 BC響應(yīng)面3D圖及等高線

3 結(jié)論

本研究利用UAE方法對破壁后的雨生紅球藻進(jìn)行AXT提取工藝參數(shù)的優(yōu)化及確定。首先進(jìn)行原料預(yù)處理以初步減少提取阻力，然后通過對比選擇溶解度最佳的提取試劑，以此為基礎(chǔ)篩選出最佳超聲處理?xiàng)l件并得出優(yōu)化數(shù)據(jù)。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：采用低溫研磨對藻粉進(jìn)行破壁，進(jìn)而以乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）作為提取溶劑在超聲時間18 min、超聲溫度39 ℃、液料比9∶50（mL/mg）、超聲功率200 W條件下進(jìn)行震蕩超聲處理，最后于40 ℃水浴振蕩20 min，提取效果高達(dá)85.1%。

本實(shí)驗(yàn)通過機(jī)械方法對藻粉兩次破壁處理（低溫研磨初次破壁，震蕩超聲二次破壁），大大提高AXT的提取效率。隨著AXT功能價值進(jìn)一步挖掘，其相應(yīng)價值也必然進(jìn)一步提升，目前天然AXT在全球市場上的價格高達(dá)2.5~7 $/g，而AXT純品價值更是高達(dá)3 200 $/g[17-18]，可見對原材料中AXT的有效提取是獲得AXT來源的有效保障。

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備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/ index.axpx）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。

Extraction of astaxanthin fromby ultrasonic combined grinding and wall breaking

MENG Ang1, WANG Meng1, ZHAO Xiao-yan1, ZHU Yun-ping2, ZHANG Xiao-wei1, LIU Hong-kai1, ZHU Hai-tao1

(1. Department of Food Science and Nutrition, Culinary School, University of Jinan, Jinan, Shandong 250022, China; 2. School of Food and Health Engineering, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Based on the determination of wall breaking method and dissolving reagent, ultrasonic-assisted extraction was used in this study to explore the effect of extracting astaxanthin from Haematococcus pluvialis under different conditions, and further optimize the test results by response surface methodology. The results showed that under the conditions of ultrasonic time of 18 mins, ultrasonic temperature of 39 ℃, liquid-material ratio of 9∶50 (mL/mg), and ultrasonic power of 200 W, ultrasonic treatment was carried out under the condition of oscillating ultrasound. Finally, the treatment was carried out under the condition of water bath oscillation at 40 ℃ for 20 mins, the astaxanthin extraction rate can be 85.1% using Liquid nitrogen grinding broken wall treatment with ethyl acetate-ethanol (v/v: 1∶2) as the extraction solvent.

; astaxanthin; liquid nitrogen grinding broken wall; solubilizing reagent; ultrasonic-assisted extraction

TS202

A

1007-7561(2020)03-0091-07

10.16210/j.cnki.1007-7561.2020.03.014

2019-11-28

國家自然科學(xué)基金（21406133），北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心開放基金（20181018）

孟昂，1993年出生，男，在讀碩士生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物與功能食品開發(fā).

趙曉燕，1975年出生，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭称防碚撆c加工應(yīng)用及生物粉體技術(shù)研究.